Summary
פגיעה בכבד הנגרמת על-ידי תרופות (DILI) היא הגורם העיקרי לכשל תרופתי. פותח פרוטוקול לחיזוי מדויק של אחריות DILI של תרכובת באמצעות מערכת מיקרופיזיולוגית של הכבד (MPS). מודל הכבד משתמש בקוקולטורה של תאי כבד ראשוניים ובנקודות קצה רלוונטיות לתרגום כדי להעריך את תגובות התאים לטיפול.
Abstract
DILI היא גורם מרכזי להתשה בפיתוח תרופות עם למעלה מ-1,000 תרופות שאושרו על ידי ה-FDA וידועות כגורמות ל-DILI בבני אדם. למרבה הצער, DILI לעתים קרובות אינו מזוהה עד שהתרופות מגיעות לשלבים קליניים, מה שמסכן את בטיחות המטופלים ומוביל להפסדים משמעותיים לתעשיית הפארמה. אם ניקח בחשבון שלמודלים דו-ממדיים סטנדרטיים יש מגבלות בזיהוי DILI, חיוני לפתח מודלים במבחנה שהם חזויים יותר כדי לשפר את יכולת תרגום הנתונים. כדי להבין בפירוט את הסיבתיות ואת ההיבטים המכניסטיים של DILI, פותח MPS של כבד אנושי המורכב מתאים פרנכימליים ראשוניים של הכבד האנושי ותאים שאינם פרנכימליים (NPCs) ומתורבתים במיקרו-רקמות תלת-ממדיות על פיגום מהונדס תחת זלוף. תאי הפטוציטים האנושיים הראשוניים (PHHs) ותאי קופפר (HKCs) גודלו כמיקרו-רקמות בפלטפורמת MPS במשך עד שבועיים, וכל תרכובת מעניינת הוכנסה שוב ושוב למיקרו-רקמות של הכבד בשבעה ריכוזי בדיקה למשך עד ארבעה ימים. נותחו נקודות קצה פונקציונליות ספציפיות לכבד (כולל סמנים ביולוגיים קליניים כגון אלנין אמינוטרנספראז, ALT) כדי להעריך את תפקוד הכבד. ניתן להעריך חשיפה חריפה וכרונית לתרכובות בדרגות חומרה שונות של DILI על ידי השוואת תגובות למיקרו-רקמות בודדות ורב-מינונים. המתודולוגיה אומתה עם קבוצה רחבה של תרכובות הפטוטוקסיות חמורות קלות. כאן אנו מראים את הנתונים עבור pioglitazone ו troglitazone, תרכובות hepatotoxic ידוע נסוג מהשוק על גרימת כשלים בכבד. באופן כללי, הוכח כי מודל MPS בכבד יכול להיות כלי שימושי להערכת DILI והקשר שלו לשינויים בתפקוד הכבד. המודל יכול לשמש גם כדי להעריך כיצד תרכובות חדשניות מתנהגות בתת-קבוצות נפרדות של מטופלים וכיצד פרופילי רעילות עשויים להיות מושפעים ממצבי מחלות כבד (למשל, הפטיטיס נגיפית, מחלת כבד שומני).
Introduction
DILI נותרה הסיבה השכיחה ביותר לאי ספיקת כבד חריפה בארה"ב ובאירופה והיא גורם מוביל להתשה של תרכובות בתהליך פיתוח התרופה1. כמעט כל סוגי התרופות יכולים לגרום להפטוטוקסיות, כאשר סוכני מערכת העצבים המרכזית ואנטיביוטיקה הם ללא ספק הטיפולים הנפוצים ביותר הגורמים ל- DILI בחולים2. הפטוטוקסיות הנגרמות על ידי תרופות נגרמת על ידי אינטראקציה מורכבת של גורמים גנטיים, לא גנטיים וסביבתיים, מה שמוביל למוות של הפטוציטים וסוגי תאי כבד אחרים, כולל כולנגיוציטים ותאי אנדותל 1,3.
ניתן לסווג את הגורמים הגורמים ל-DILI בשתי דרכים: אלה הגורמים לנזק כבד תלוי מינון צפוי או אלה הגורמים ל- DILI אידיוסינקרטי שהוא נדיר ומתפתח ללא תלות במינון תרופה, או מסלול, או משך מתן תרופה, אך אחראי עד שישית מכל כשלי הכבד החריפים בארה"ב רק4. למרבה הצער, DILI הוא לעתים קרובות לא מזוהה עד תרופות הגיעו לשלבים הקליניים של תהליך פיתוח התרופה. דירוג פגיעה בכבד הנגרמת על ידי תרופות (או DILIrank) מורכב מיותר מאלף תרופות שאושרו על ידי ה- FDA המחולקות לארבעה סוגים בהתאם לפוטנציאל שלהן לגרום ל- DILI, ויש לעקוב מקרוב אחר השימוש בהן בחולים5.
חקר מנגנונים של הפטוטוקסיות של תרופות נותר מאתגר מאוד, ולכן פותחו מודלים פרה-קליניים רבים כדי לחקור מנגנונים של DILI. למודלים הנוכחיים במבחנה וב-in vivo המשמשים לחיזוי DILI בפיתוח פרה-קליני יש מספר מגבלות למתן תובנות על האינטראקציות המורכבות ומרובות הפנים בגוף אדם חי. קווי תאי כבד סרטניים (כלומר, HepG2, HepaRG) בתרבית בדו-ממד עדיין משמשים בשלבים המוקדמים של פיתוח תרופות להערכת הרעילות של תרכובות מועמדות6. עם זאת, קווי תאים אלה מגיעים מתורמים בודדים ומראים רמות חריגות של תפקוד הכבד, ולא תמיד מפגינים רגישות גבוהה לגילוי DILI 7,8. כחלופה לקווי תאי כבד סרטניים, PHHs מייצגים טוב יותר את הפיזיולוגיה של הכבד האנושי אם הם מתרבים כראוי במבחנה, אם כי קיימות מספר מגבלות עם התרבית שלהם, כמו זמן דגירה קצר עם תרופות, אורך חיים קצר יחסית, אובדן ביטוי גנים בכבד ושינויים בתפקודים מטבוליים של תרופות 9,10,11 . PHHs יכולים להיות בתרבית על חלבוני מטריצה חוץ-תאית בלוחות תרבית תאים דו-ממדיים סטנדרטיים, אך כחיסרון, הירידה המהירה בתפקודם פירושה שיש להם רגישות נמוכה (<50%) לחיזוי DILI12.
מצד שני, ניסויים במודלים של בעלי חיים הם איטיים, יקרים, וזקוקים לתרגום חוצה מינים כדי לבצע אקסטרפולציה של חיזוי לבני אדם. רוב התרופות שפותחו לאחרונה אינן מצליחות לקבל אישור מה שהופך את התהליך הזה ליקר ומסוכן5. יתר על כן, לבדיקת שיטות חדשות ספציפיות לבני אדם, מודלים של בעלי חיים פחות מתאימים בגלל הבדלים ברצף הגנים או בתגובה החיסונית לעומת בני אדם13.
כתוצאה מכך, העניין במודלים מתקדמים יותר של כבד תלת-ממדי (3D) במבחנה גדל באופן אקספוננציאלי. גידול PHHs כמבנים כדוריים הנוצרים על ידי צבירה כבידתית בטיפות תלויות או על משטחי חיבור אולטרה-נמוכים מייצג שיטה בעלת תפוקה גבוהה להערכת התחייבויות מורכבות14. ספרואידים PHH שימשו להערכת DILI ברקע חולה (למשל, סטאטוזיס וכולסטזיס)15. מגוון רחב של מודלים פותחו כדי לכלול מצופה מיקרו-דפוס cocultures של hepatocytes עם פיברובלסטים סטרומליים16, רקמות כבד מודפסות ביו 3D 17, תרביות ספרואידים 3D עם או בלי תאים שאינם פרנכימליים בכבד15. עם זאת, לכל השיטות הללו עדיין יש חסרונות, וגידול PHHs במיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית יכול לספק להם רמות גבוהות יותר של פונקציונליות לפרקי זמן ממושכים כדי לאפשר חקירה של חשיפה ממושכת להפטוטוקסיקנים פוטנציאליים. בנוסף, כדי לשפר את הרלוונטיות התרגומית של כל תרבית PHH מתקדמת במבחנה, יש להשתמש בנקודות קצה פונקציונליות רלוונטיות מבחינה קלינית או בסמנים ביולוגיים של תפוקת רעילות כדי לאפשר השוואה בין נתונים in vivo או תרחישים קליניים18.
במחקר זה הערכנו אם ניתן להשתמש במודל כבד במבחנה, הידוע גם בשם איבר-על-שבב (OOC), כדי להבין את ההיבטים המכניסטיים המפורטים של רעילות כבד. בעבר הוכח כי ה-MPS שומר על מיקרו-רקמות כבד תלת-ממדיות מתפקדות מאוד, תחת זרימה, למשך עד 4 שבועות19. המערכת נבדקה לאחרונה על ידי ה-FDA והוכחה כבעלת יכולת שכפול גבוהה בעת ביצוע רעילות לתרופות, חילוף חומרים והצטברות תוך תאית20. יתר על כן, בהשוואה לספרואידים ותרביות סנדוויץ ', למערכת היה תפקיד יציב יותר ורגישות גבוהה יותר באיתור הרעילות של מספר תרופות20. עד כה, ה-MPS שימש במגוון רחב של יישומים המכסים ADME 21, מידול מחלות (HBV 22, NAFLD 23,24,25) ואינטראקציות בין תרופות 26, מה שעשוי להפוך אותו למתאים מאוד להערכת DILI אקוטי וכרוני. הטכנולוגיה המוצגת כאן מציעה אלטרנטיבה לסגירת הפער בין תרביות תאים מסורתיות יותר ומודלים של בעלי חיים לבין ניסויים קליניים בבני אדם, ומתקדמת לקראת סימולציה של תנאים ביולוגיים אנושיים כדי לתמוך בהערכת רעילות הכבד של תרכובות מועמדות בשלבים פרה-קליניים של תהליך פיתוח התרופה.
Protocol
כל העבודות בוצעו במעבדה על פי נהלי בריאות ובטיחות קפדניים ובהתאם להערכות סיכוני מעבדה ו-SOPs משלה. כל הציוד המשמש מטופל על פי הנחיות היצרן. ארונות בטיחות מיקרוביולוגיים (MBSCs) מקבלים שירות מדי שנה, וקי-דיסקוס (אשלגן יודיד) נבדק לפי התקנים הבריטיים. הפרוטוקול תואם את קוד הנוהג וההנחיות של רשות הרקמות האנושיות של בריטניה (HTA) ומשתמש בתאים אנושיים ראשוניים ממקור אתי המסופקים על ידי ספקים העומדים באופן מלא בדרישות הכלליות להסכמה מדעת (45 CFR §46.116 ו- §46.117) ופרקטיקה קלינית טובה (GLP), (ICH E6), וועדות רגולציה ואתיקה.
1. הכנת מדיה תרבית תאים
הערה: הכינו את המדיום DMEM המתקדם לזריעה ביום -1 ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הכן DMEM מתקדם בינוני ביום הראשון ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע אחד.
- זריעת מדיום DMEM מתקדם עבור קולטורת PHHs ו- HKCs: השלם בקבוק אחד של 500 מ"ל מדיום DMEM מתקדם (טבלת חומרים) עם 18 מ"ל של קוקטייל A (ריכוז סופי של 3.6%) ועם 25 מ"ל של FBS (ריכוז סופי 5%).
- תחזוקה מדיום DMEM מתקדם עבור PHHs ו- HKCs coculture: תוספת בקבוק אחד של 500 מ"ל בינוני DMEM מתקדם (טבלת חומרים) עם 20 מ"ל של קוקטייל B (ריכוז סופי של 4%) ו 500 ננומטר הידרוקורטיזון.
הערה: הידרוקורטיזון ייעשה טרי ביום השימוש, והשלבים להכנת תמיסת המלאי והדילולים הנדרשים מוזכרים להלן. - הכנת הידרוקורטיזון 500 ננומטר בתחזוקה מתקדמת DMEM בינונית
- הכנת תמיסת המלאי ההתחלתית (20 מ"מ): שקלו 7.24 מ"ג הידרוקורטיזון (טבלת חומרים) לתוך בקבוקון זכוכית 1 מ"ל. רשום את הכמות המדויקת של הידרוקורטיזון שנשקל וקבע את נפח הדימתיל סולפוקסיד (DMSO) באמצעות החישוב הבא:
- הכנת תמיסת מלאי הידרוקורטיזון 100 μM עובדת: הוסף 5 μL מתמיסת המלאי ההתחלתית של 20 mM ל- 995 μL של DMEM מתקדם.
הערה: דילול של 25 μL מתמיסת ה-DMSO משלב 1 במים או במדיה גורם לריכוז DMSO של 0.5%. בפתרון הסופי, ריכוז DMSO יהיה 0.0025%. במקרה זה, הנפח הנוסף של 5 μL גורם לשינוי לא משמעותי בנפח הכולל. - הכנת תמיסת הידרוקורטיזון 500 ננומטר העובדת ב- DMEM מתקדם: כדי להכין 1 מ"ל של תמיסת הידרוקורטיזון 500 ננומטר ב- DMEM מתקדם, הוסף 5 μL מתמיסת המלאי של 100 μM הידרוקורטיזון ל- 995 μL של מדיום DMEM מתקדם לתחזוקה.
- הכנת תמיסת המלאי ההתחלתית (20 מ"מ): שקלו 7.24 מ"ג הידרוקורטיזון (טבלת חומרים) לתוך בקבוקון זכוכית 1 מ"ל. רשום את הכמות המדויקת של הידרוקורטיזון שנשקל וקבע את נפח הדימתיל סולפוקסיד (DMSO) באמצעות החישוב הבא:
2. הגדרת MPS ו-priming (יום -1)
- חבר את הבקר לבית תחנת העגינה שלו באינקובטור של תרביות תאים וודא שמוסיפים חומר ייבוש טרי (טבלת חומרים) לצנצנת הייבוש הממוקמת בגב הבקר.
הערה: יחידת הבקר שואבת לחות מהאינקובטור לאורך זמן ונשמרת יבשה באמצעות חומר ייבוש טרי. - הפעל את הבקר על ידי לחיצה על מתג נדנדת הסירה הממוקם מאחוריו והמתן 5 דקות עד שהמערכת תתייצב ותגיע ללחץ. לאחר מכן בדוק את המסך עבור הדו"ח הפנאומטי כדי להבטיח: (i) תפוקת מאגר הלחץ הגיעה ~ 2000 mBar ו- (ii) תפוקת מאגר הוואקום הגיעה ~ 850 mBar.
- הסר כל צלחת מהאריזה ובדוק חזותית כל באר כדי לבדוק פגמים אפשריים (פיגומים חסרים, סדקים וכו ').
- הכנס מנהל התקן (עם לוחית דולקת) לתחנת העגינה כדי לבדוק שמנהל ההתקן מזוהה על-ידי תחנת העגינה והבקר. בדוק את תפוקת מאגר הלחץ ירדה בפחות מ-100 mBar, ותפוקת מאגר הוואקום גדלה בפחות מ-500 mBar.
- הגדילו כל באר על ידי הוספת 500 μL של מדיום DMEM מתקדם לזריעה (מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס) לצד המאגר.
- בחר את תוכנית Prime במסך הבקר (זרימה כלפי מעלה למשך 3 דקות במהירות של 2.5 μL/s) עד שהנוזל יגיע דרך תומכי המסנן. הערה: 'זרימה למעלה' היא הגדרה בבקר המאפשרת למדיה לזרום מהמאגר כלפי מעלה דרך הפיגומים בלוח LC12.
- מלא את כל הבארות עם 1.1 מ"ל נוספים של מדיום DMEM מתקדם לזריעה כדי לכסות את ערוץ פני השטח. לאחר מכן כל הבארות יהיו בנפח העבודה המלא שלהן של 1.6 מ"ל.
- מקם את הנהגים עם צלחות בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2 , התחבר לתחנת העגינה והפעל את תוכנית הדגירה .
הערה: כל התוכניות ששימשו בניסוי (Prime, Incubate, Seed, Media Change) מוגדרות מראש במערכת MPS. ראש את הצלחות באינקובטור עד מוכן לזרע.
3. זריעת תאי כבד לתוך MPS (יום 0)
- קדם את כל PHHS ו- HKCs. כל ה-PHHs וה-HKCs Lots מאומתים מראש בתוך החברה לפני ביצוע הניסוי בתרבית תאים (ראו חומר משלים).
- הפשרת בקבוקונים של PHHs ותאי HKCs (טבלת חומרים) על ידי החזקת הבקבוקונים בהתמדה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שנותר רק רסיס קטן של קרח.
- Pipette PHHs ישירות לתוך צינור של מראש מחומם (37 °C) Cryopreserved Hepatocyte התאוששות בינונית CHRM מדיה (שני בקבוקונים מקסימום לכל צינור).
- צמחו את התאים בעדינות, ולאחר מכן השתמשו ב-1 מ"ל של CHRM כדי לשטוף את כל התאים הנותרים מהקריוטוב. היו עדינים מאוד עם תאים בעת הפשרה והעברה לצינור חרוטי.
זהירות אין להתסיס את הבקבוקונים במהלך ההפשרה, ואין לקטר את תכולתם למעלה ולמטה. - Pipette HKCs תאים בעדינות מן cryotube לתוך 10 מ"ל של זרעיעה קרה כקרח DMEM בינוני מתקדם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
הערה: ניתן לשלב עד 2 בקבוקונים של HKCs. - צנטריפוגה לשני סוגי התאים בטמפרטורת החדר (RT) ב-100 x גרם למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט.
- החזירו את ה-PHHs במדיום DMEM מתקדם לזריעה חמה ו-HKCs במדיום DMEM מתקדם של זריעה קרה כקרח (כדי לסייע בהפחתת התגבשות התאים), באמצעות 1 מ"ל לכל בקבוקון של תאים שנוספו לצינור והניחו את התאים על קרח. השתמש בפעולת נדנדה עדינה כדי להשעות את התאים.
אזהרה: אין להשעות את ה-PHHs על ידי פעולת פיפטה, מכיוון שהיא עלולה להוביל למוות של תאים. - שלב את מתלי התאים ממספר צינורות (אם רלוונטי - כלומר, אם כל ה- PHHs הם מאותו תורם), אך אל תערבב סוגי תאים.
- ספירת תאים. רשום את הכדאיות (חייב להיות מעל 85% עבור שני סוגי התאים, PHHs ו- HKCs) ואת המספר הכולל של תאים. אם כדאיות התאים יורדת מתחת ל-85%, הפשירו בקבוקון חדש של תאים, והעריכו מחדש את כדאיות התא.
- חשב את כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה:
- חשב את הנפח הרצוי של תרחיף התא כדי לזרוע לתוך כל באר ונפח נוסף של מדיום DMEM מתקדם זריעה הדרוש כדי לקחת את נפח הזריעה הכולל ל 400 μL. מספרי תאים לכל באר: 0.4 x 10 6 PHHs ו- 0.04 x 106 HKCs לכל באר, וצפיפות תאים של 0.25 x 106 PHHs / mL, בהתאמה 0.025 x 106 HKCs / מ"ל.
- נתק את מנהל ההתקן מתחנת העגינה והנח אותו ב- MBSC.
- שאפו את המדיה מהפיגום הנ"ל לנקודת העצירה (יורדים בחריץ העמוק על טבעת התמך), הערוץ והמאגר. השאירו "נפח מת" של 0.2 מ"ל בבאר התרבית, והגיעו ממש מעל הפיגום. יש להיזהר שלא להסיר את המדיום הכולל מעל הפיגום כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
- הוסף 400 μL של מדיום DMEM מתקדם לתא הבאר, החזר את הנהג לתחנת העגינה בחממה והפעל את תוכנית שינוי המדיה למשך 3 דקות. התוכנית תושהה באופן אוטומטי לאחר 3 דקות.
- לאחר שתסיים, נתק את מנהל ההתקן מתחנת העגינה והנח אותו בחזרה ב- MBSC.
- שאפו את המדיה מהפיגום הנ"ל עד לנקודת העצירה ובקצה המאגר של כל באר.
- השהה בזהירות את ה- PHHs על ידי נדנדה עדינה של הצינור, ולאחר מכן הוסף את הנפח הנדרש של מתלה התא לכל תרבית היטב. קפטו בזהירות על תרחיף התאים, וודאו שהתאים מתפזרים באופן שווה על פני פיגום הצלחת.
הערה: כדי להבטיח כיסוי טוב לאורך כל הפיגומים, השתמש בתנועת מערבולת איטית כדי להפיל תאים על הפיגום. - באופן דומה, יש להשעות בזהירות את ה-HKCs ולהוסיף את מתלי התאים לכל תרבית.
הערה: השתמש בתנועת מערבולת איטית כדי לזרוע HKCs כדי להבטיח כיסוי טוב לאורך כל הפיגום. ניתן להפריד בין שני שלבי המשנה של הזריעה, או לערבב מראש את שני סוגי התאים בצפיפות מתאימה ולזרוע אותם במקביל. - לאחר שכל הבארות מכילות את שני סוגי התאים, הנח את מנהל ההתקן MPS על תחנת העגינה באינקובטור מבלי לחבר אותו פיזית והשאר אותו לעמוד במשך שעה אחת.
- לאחר שעה אחת, מלא כל באר בנפח הנדרש של מדיום DMEM מתקדם של זריעה כדי להגיע ל-400 μL ולהפעיל את תוכנית הזרעים .
- לאחר 2 דקות, התוכנית תשהה באופן אוטומטי, תסיר את הנהג מהאינקובטור ותוסיף באיטיות 1000 μL של מדיום ה- DMEM המתקדם של Seeding לתעלה (קרוב יותר לקצה המאגר מאשר לתא הבאר) כדי להשיג נפח כולל של 1.4 מ"ל (עם נפח מת נוסף של 200 μL בערוצים).
- להעביר את הצלחות לחממה ולהפעיל את שאר תוכנית Seed במשך 8 שעות.
הערה: Flow יעבור באופן אוטומטי לתוכנית דגירה לאחר 8 שעות.
4. שינוי מדיה (יום 1)
- נתק את מנהל ההתקן מתחנת העגינה והנח אותו ב- MBSC.
- בצע שינוי מדיה על-ידי הסרת מדיום ה-DMEM המתקדם לזריעה בתא הבאר עד לנקודת העצירה.
- הוסף 400 μL של מדיום DMEM מתקדם תחזוקה לתוך תא הבאר, להחזיר את הנהג לתחנת העגינה בחממה ולהפעיל את תוכנית שינוי מדיה במשך 3 דקות. התוכנית תושהה באופן אוטומטי לאחר 3 דקות.
- נתק את מנהל ההתקן מתחנת העגינה, וב- MBSC, שאף הרחק מדיה מתא המאגר, הערוץ ונקודת העצירה מעל הפיגום. בשלב זה, באר התרבות תוחזר לנפח המת.
- מלא את תא המאגר ב-1.4 מ"ל של מדיום DMEM מתקדם שחומם מראש (37°C) והתחמם מראש.
- החזירו את הנהג לתחנת העגינה בחממה והפעילו את תוכנית הדגירה .
5. בקרת איכות של מיקרורקמה בכבד (QC), איסוף מדיה, שינוי מדיה ומינון תרופות (יום 4)
- ביום הרביעי בצע שינוי מדיה באמצעות בדיקות המדיום וה-QC של DMEM המתקדמות לתחזוקה כדי להבטיח שהזריעה בוצעה בהצלחה.
הערה: QC הוא תהליך המשמש לבדיקת בריאותם של המיקרו-רקמות שנוצרו על-ידי מדידת לקטט דהידרוגנאז (LDH) ואוריאה. - לפני הפעלת ה-QC, הכן פתרונות מלאי טריים עבור כל תרכובת לבדיקה (במדיום DMEM מתקדם לתחזוקה או במדיום DMEM מתקדם לתחזוקה המכיל 0.1% DMSO, בהתאם למסיסות של כל תרכובת). הכינו דילולים בהתאם כדי להניב ריכוזי בדיקה לכל תרכובת.
- נתק את מנהל ההתקן והצלחת מתחנת העגינה והעבר ל- MBSC.
- העבר 50 μL של מדיה מכל באר באמצעות פיפטה לצלחת באר 96 כדי לבצע בדיקת LDH (טבלת חומרים) לפני הדגימה ו-25 μL עבור בדיקת אוריאה (טבלת חומרים).
הערה: מבחני LDH ואוריאה יבוצעו בהתאם להוראות היצרן. - המשך את הניסוי לאחר QC אם קריאות LDH נמוכות מ-2AU/ 10 6 תאים והאוריאה היא מעל 40 מיקרוגרם/יום/106 תאים .
הערה: אלבומין אינו משמש כ- QC מכיוון שזהו מבחן ארוך להפעלה ביום והוא ייבדק מאוחר יותר לאחר השלמת הניסוי מהדגימות שנסוגו ביום 4. - אם בארות כלשהן נכשלות ב- QC, הסר אותן מתכנון הניסוי.
- לאחר אישור פריסת הניסוי, דגמו את המדיה הנותרת מכל באר, והקפידו לא להפריע לתרבית התאים על ידי נגיעה בפיגום. אחסן את המדיה שנאספה (המסומנת כדגימות לפני המינון) בטמפרטורה של -80°C לבדיקות מאוחרות יותר.
- בצע שינוי מדיה ב- MBSC בהתאם לשלבים 4.3-4.5. שנה את הבארות למדיום DMEM מתקדם לתחזוקה עם ריכוז התרופה הנכון בהתאם לתכנון הניסוי.
- לאחר השלמתו, החזירו את הנהג לתחנת העגינה בחממה והפעילו את תוכנית הדגירה .
6. איסוף מדיה, שינוי מדיה ומינון תרופות (יום 6)
- הכן פתרונות מלאי טריים עבור כל תרכובת לבדיקה (במדיום DMEM מתקדם לתחזוקה או במדיום DMEM מתקדם לתחזוקה המכיל 0.1% DMSO, בהתאם למסיסות של כל תרכובת). הכן דילולים בהתאם כדי להניב ריכוזי בדיקה עבור כל תרכובת בהתאם לתוכנית הלוחית.
- נתק את מנהל ההתקן ואת הצלחת מתחנת העגינה והעבר ל- MBSC.
- אסוף מדיה מכל באר (~ 1 מ"ל) באופן ידני עם פיפטה תוך הקפדה לא להפריע לתרבית התאים על ידי נגיעה בפיגום, בדיקה עבור LDH ו- Urea. אחסן את שאר המדיה שנאספה בטמפרטורה של -80°C לבדיקות מאוחרות יותר, ותייג אותן כדגימות של 48 שעות לאחר המינון.
- מינון מחדש של כל באר עם אותו ריכוז תרופה כמו ביום 4 ובהתאם לתוכנית הצלחת על ידי ביצוע שינוי מדיה בשלבים 4.3-4.5.
- לאחר השלמתו, החזירו את הנהג לתחנת העגינה בחממה והפעילו את תוכנית הדגירה .
7. סיום הניסוי (יום 8)
- נתק את מנהל ההתקן ואת הצלחת מתחנת העגינה והעבר ל- MBSC.
- דגימת מדיה מכל באר באופן ידני באמצעות פיפטה, תוך הקפדה שלא להפריע לתרבית התאים על ידי נגיעה בפיגום.
- בדוק את המדיה הנסוגה עבור LDH ו- Urea ואחסן את שאר המדיה שנאספה ב- -80 °C לבדיקות מאוחרות יותר.
- הפעלת בדיקת CYP3A4-glo.
- מדוד את ההשפעות של התרופות שנבדקו על פעילות ציטוכרום P450 CYP3A4 ב- PHHs בסוף הניסוי באמצעות בדיקה זו.
- צור מחדש את מגיב הזיהוי (עבור בדיקת CYP3A4, ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן. אם מגיב הזיהוי שוחזר והקפיא בעבר, הסר אותו מהמקפיא של -20 מעלות צלזיוס ואפשר לו להפשיר ב-RT.
- הכן 20 mM מלאי D-לוציפרין תקן בהתאם להוראות היצרן.
- הכן מדיום מצע לומינוגני עובד עם דילול 1:1000 של לוציפרין IPA במדיום DMEM מתקדם תחזוקה (2 מ"ל של מדיום מצע לומינוגני לכל באר).
- בצע שינוי מדיה כמתואר בשלבים 4.3-4.5 עם מדיום מצע לומינוגני. שמור 500 μL של מדיום המצע הלומינוגני בבקבוקון זכוכית 1.5 מ"ל (טבלת חומרים) כחומר קלט.
- החזירו את הנהג לתחנת העגינה בחממה והפעילו את תוכנית הדגירה למשך שעה וחצי.
- הכן עקומת תקן D-לוציפרין במדיום תרבית בצינורות של 1.5 מ"ל בהתאם להוראות היצרן ופיפטה 50 μL של כל תקן בשכפול על לוח לבן אטום 96 באר (ראה טבלת חומרים), תוך שימוש במדיום תרבית ריק או 0 μM.
- לאחר שחלף הזמן, הסר את מנהל ההתקן מתחנת העגינה ודגום מדיה עבור בדיקת CYP3A4 בהתאם לשלבים 7.4.9-7.4.13.
- לאחר הדגירה, העבירו 50 μL של מדיום הדגימה מכל באר וחומר קלט ללוח הלומינומטר הלבן האטום היטב בעל 96 הבאר המכיל תקנים. הקפידו להשאיר לפחות שתי שורות ריקות על הלוח האטום שבין התקנים לדגימות כדי למנוע מעבר קל בין התקנים המובילים לבין קריאות הדגימות.
- הוסף 50 μL של מגיב זיהוי לוציפרין לכל באר כדי ליזום תגובה זוהרת.
- דגרו את הצלחת ב-RT על שייקר צלחת למשך 20 דקות בחושך כדי לייצב את האות הזוהר.
- הקלט את הזוהר באמצעות מצלמת לומינומטר או CCD.
- התווה את העקומה הסטנדרטית על-ידי לקיחת הממוצע של כל נקודה ולאחר מכן הפחתת הממוצע של החסר. השתמש במשוואה של הקו כדי לחשב את קצב חילוף החומרים (pmol/min/106 תאים ) בשאר הדגימות, וזכור לכלול את כל הדילולים שבוצעו.
- הסר את הפיגומים מהצלחות באמצעות זוג פינצטות והנח אותם בצלחת באר 24 המכילה 500 μL של D-PBS (ללא Ca++ ו- Mg++) בכל באר, תוך הקפדה שלא להפריע למיקרוטק.
- צלם תמונות של כל פיגום באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של פי 10.
- הפעלת בדיקת ATP (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן:
- הפשירו את המגיב ב-RT.
- שטפו את הפיגומים פעמיים עם 500 מיקרון של D-PBS (ללא Ca++ ו-Mg++) עבור כל שלב כביסה.
- הוסף 120 μL של מגיב ו 120 μL של PBS לכל פיגום ואת אותם נפחים לבאר ריקה (זה ישמש ריק). מניחים את הצלחת המכוסה ברדיד אלומיניום על שייקר ומנערים במרץ (500 סל"ד) במשך 5 דקות ולאחר מכן 30 דקות של דגירה כדי לייצב את אות הזוהר.
- מעבירים 100 μL של הדגימות המוזנחות בשכפול ללוחית בדיקה שטוחה ברורה של 96 בארות לצורך מדידה. ודא כי בארות ריקות לא ממוקמים ליד בארות מדידה אחרות של זוהר גבוה.
- הקלט את הזוהר באמצעות קורא microplate.
- השווה את luminescence של דגימות כדי לקבוע את luminescence של התקנים כדי לקבוע ATP זוהה על ידי מגיב בדגימות.
Representative Results
כתב היד מתאר מודל MPS כבד המשמש להערכת DILI. ה- MPS מקל על יצירת מיקרו-רקמות כבד תלת-ממדיות המתוחזקות בתפקוד גבוה תחת זרימה במשך עד 4 שבועות. PHHs/HKCs נזרעים על פיגומים מצופים קולגן כדי ליצור מיקרו-רקמות כבד אשר מתמזגות עם מדיום גדילה, ולאחר שעברו את בדיקת ה- QC, הם מינון עם תרכובות. כאן אנו מראים נתונים עבור troglitazone ו- pioglitazone, שתי תרכובות דומות מבחינה מבנית אך עם דרגות חומרה שונות של DILI.
ביום 4, לפני מינון התרופה, נבדקת בדיקת QC של מיקרו-רקמות בכבד שנוצרו, והיא מורכבת משחרור LDH וסינתזת אוריאה (איור 1A). ה- QC שואף לאשר כי MPS הכבד מייצר מיקרו-רקמות כבד עקביות ומתפקדות ביותר. הנתונים המוצגים כאן מופקים משלושה ניסויים ומראים רמות טובות של שכפול עם שונות תוך-מחקרית ובין-מחקרית נמוכה. לאחר תרבית בת 8 ימים, מעריכים מדדי בריאות וכבד מרובים (אלבומין, אוריאה, CYP3A4, ATP) ומיקרו-רקמות בקרה מראות רמות גבוהות של פונקציונליות בכבד ויכולת שכפול (איור 1B,C). מיקרוסקופיית פאזה ניגודית וצביעת IF של מיקרו-רקמות הכבד (ראו חומר משלים) מראות עקביות זריעה גבוהה בכל המיקרו-ערוצים של הפיגום וחושפות את התפלגות ה-HKCs במיקרו-רקמות PHH (איור 1D)
איור 1: MPS של הכבד מייצר נתונים הניתנים לשחזור ומיקרו-רקמות עקביות. (A) מדדי QC תלת-ממדיים של מיקרו-רקמות כבד ביום 4, והערכת פונקציונליות בסוף המחקר ביום 8 -(B) אלבומין ואוריאה, (C) CY3A4 ו-ATP). הנתונים נאספים משלושה ניסויים; בכל ניסוי היו 3 משכפלים של בקרת רכב. הנתונים המוצגים הם ממוצע ± SD, N = 9. (D) מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה (10x ו-20x) ו-IF של מיקרו-רקמות כבד תלת-ממדיות הנוצרות על-ידי שילוב PHHs ו-HKCs בפלטפורמת MPS בכבד להערכת DILI. כדי להמחיש את ה-HKCs, לפני זריעת HKCs הומרו עם וקטור אדנו-ויראלי המבטא eGFP (ראו חומר משלים). מוצגים פוטומיקרוגרפים מייצגים. ההתמרה וההדמיה בוצעו כניסוי עצמאי להדגמת לוקליזציה של תאים ולא נעשו עם פרוטוקול DILI המתואר. תאי HKCs מאומתים מראש בתוך החברה לפני השימוש בתרבית תאים ניסיונית וחייבים להיות בעלי רמות נמוכות של הפעלה לאחר הפשרה; זה מוערך על ידי מדידת סמנים ביולוגיים IL-6 ו- TNF-אלפא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Troglitazone ידוע לגרום DILI חמור; בעקבות הרישיון לטיפול בסוכרת מסוג 2, הוא בוטל על ידי ה- FDA לאחר 3 שנים בשוק בגלל תדירות הפגיעה בכבד הקשורה לשימוש בו. נכון להיום, מחקרים שפורסמו בבעלי חיים לא הצליחו לחזות את הפוטנציאל של troglitazone לגרום לפגיעה חמורה בכבד. הרעילות של תרכובת זו לא זוהתה גם בבדיקות כבד סטנדרטיות במבחנה 2D14.
מיקרו-רקמות כבד ב-MPS טופלו ב-troglitazone במשך 96 שעות, והן גרמו לתגובה רעילה חריפה, Cmax driven, אשר זוהתה על-ידי שחרור ALT ו-LDH והפחתה מהירה בייצור אלבומין ואוריאה, בסביבות 15 x Cמקסימום, לאחר חשיפה חריפה לטרוגליטזון (איור 2A). פעילות נקודת הקצה התאית (תוכן ATP) ופעילות CYP3A4 (להערכת ביו-טרנספורמציה מטבולית), שנדגמו לאחר חשיפה של 96 שעות, אישרו עוד יותר את הרעילות הנגרמת על-ידי טרוגליטזון וערכי EC:50 היו דומים מאוד לנקודות קצה אחרות (איור 2B). תמונות מיקרוסקופיה של ברייטפילד שצולמו לאחר תרבית של 8 ימים ב-MPS חושפות מיקרו-רקמה בריאה של הכבד, שנזרעה באופן אחיד בכל הפיגום (בקרת רכב) בניגוד למוות/השפלה כללית של רקמות, כפי שניתן לראות בשכפולים שטופלו בבקרה חיובית ובטרוגליטזון בשני ריכוזי הבדיקה העליונים (איור 2C).
איור 2: קביעת סיכון DILI לטרוגליטזון באמצעות נקודות קצה הפטוטוקסיות מרובות. מיקרו-רקמות בכבד נחשפו לשבעה ריכוזי בדיקה של טרוגליטזון במשך 96 שעות והושוו עבור (A) שחרור LDH, שחרור ALT, ייצור אלבומין, סינתזת אוריאה, פעילות CYP3A4 ותכולת ATP. קווים כחולים - חשיפה של 48 שעות (נקודות קצה של מדיה בלבד), קווים אדומים - חשיפה של 96 שעות. הבקרה החיובית הייתה 100 μM כלורפרומזין. כל נקודות הקצה נמדדות מאותן תרביות MPS בכבד. הנתונים המוצגים ממוצעים ± SD, N = 3. (B) סיכום של מספרי E:50 שהופקו מנתונים. N.D. = נתונים שאינם ניתנים להתוויה. קו = לא נבדק. (C) מיקרוסקופיה מייצגת של מיקרו-רקמות כבד לאחר תרבית של 8 ימים (הגדלה 10x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כמו כן נחקרה רעילות בכבד בעקבות חשיפה לפיוגליטזון. Pioglitazone היא תרכובת הידועה כבעלת חשש נמוך DILI4 ולא הפעילה הפטוטוקסיות בתרביות הפטוציטים ראשוניים דו-ממדיים קלאסיים ואפילו בכמה מודלים תלת-ממדיים מתקדמים יותר10,11. השפעות הפטוטוקסיות קלות נצפו בשתי נקודות הזמן שנבדקו (איור 3). לא זוהה שחרור LDH או ALT; עם זאת, לאחר 48 שעות, נצפתה ירידה קלה בייצור אלבומין ואוריאה, בערך 25x Cמקסימום (איור 3A). ירידה מינורית מאוד בתכולת ה-ATP נצפתה גם בריכוזי פיוגליטזון גבוהים, אך זה לא היה משמעותי. ערכי EC:50 הנוצרים מעקומות מינון-תגובה מוצגים באיור 3B. מיקרוסקופיה גילתה שינוי קל במיקרו-רקמות לאחר חשיפה של 96 שעות לפיוגליטזון בשני הריכוזים הגבוהים ביותר שנבדקו (איור 3C). התוצאות מדגימות את יכולתו של MPS בכבד לזהות את הרעילות של תרכובות עם חשש קל של DILI.
איור 3: קביעת סיכון DILI לפיוגליטזון באמצעות נקודות קצה הפטוטוקסיות מרובות. מיקרו-רקמות בכבד נחשפו לשבעה ריכוזי בדיקה של פיוגליטזון במשך 96 שעות והושוו עבור (A) שחרור LDH, שחרור ALT, ייצור אלבומין, סינתזת אוריאה, פעילות CYP3A4 ותכולת ATP. קווים כחולים - חשיפה של 48 שעות (נקודות קצה של מדיה בלבד), קווים אדומים - חשיפה של 96 שעות. הבקרה החיובית הייתה 100 μM כלורפרומזין. כל נקודות הקצה נמדדות מאותן תרביות MPS בכבד. הנתונים המוצגים ממוצעים ± SD, N = 3. (B) סיכום של מספרי EC:50 שהופקו מנתונים. N.D. = נתונים שאינם ניתנים להתוויה. קו = לא נבדק. (C) מיקרוסקופיה מייצגת של מיקרו-רקמות כבד לאחר תרבית של 8 ימים (הגדלה 10x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
על ידי הערכת כל נקודות הקצה הפונקציונליות וסמנים ביולוגיים של תפוקת רעילות שעשויים לייצג תרחישים in vivo או קליניים (שחרור LDH, סינתזת אוריאה, ייצור אלבומין, פעילות CYP3A4, תוכן ATP, שחרור ALT) ואימות הנתונים שנוצרו עבור שתי התרכובות שנבדקו במינון בטווח מינון של שבע נקודות במשך 48 שעות ו-96 שעות, נוצרה מפת חום כדי להניב "חתימה של הפטוטוקסיות", סיוע בזיהוי תרכובות עם רמה משתנה של דאגת DILI (איור 4).
איור 4: קביעת "חתימת רעילות" עם MPS כבד. מפת חום מראה של troglitazone ו pioglitazone משש נקודות קצה פונקציונליות ספציפיות לכבד (שחרור LDH, סינתזת אוריאה, ייצור אלבומין, שחרור ALT, פעילות CYP3A4 ותוכן ATP) לאחר חשיפה של 48 שעות ו-96 שעות לטווח מינון של שבע נקודות. כל ערך נוצר כ- Mean, N = 3, ומנורמל כדי לשלוט בדגימות. הערכים בסרגלי הצבע מייצגים הגדלת קיפול לעומת פקדים בסיסיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
חומר משלים: הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מיקרו-רקמות והערכה מוקדמת של תאים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
MPS נועדו לשחזר יחידות פונקציונליות של איברים אנושיים במבחנה ופותחו כדי לענות על המגבלות של מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים תלת-ממדיות27. הכבד הוא אחד האיברים המעוצבים ביותר באמצעות MPS, ומגוון רחב של מערכות פותחו. הכבד האנושי אחראי על חילוף החומרים של תרופות ועל יצירת מטבוליטים רעילים של תרופות, ותפקודו הוא מרכיב מפתח במודל לפיתוח תרופות, כולל הערכת אחריות DILI של תרכובות28. כאן הצגנו שיטה חדשה להערכת DILI באמצעות MPS כבד; הפרוטוקול מאפשר לחפש תובנות מכניסטיות עבור כל תרכובת שנבדקת כדי לקבוע כיצד היא עלולה לגרום ל-DILI, כמו גם להיות בדיקה רגישה וחזקה ביותר. מיקרו-רקמות כבד נוצרות בלוחות MPS, שהם קולקולטורה של PHH ו- HKCs והם פונקציונליים מאוד עם רמות גבוהות של ייצור אלבומין ואוריאה, כמו גם פעילות CYP3A4 גבוהה בהשוואה לדגמי כבד סטנדרטיים במבחנה 20.
למרות שמודל DILI המתואר כאן יכול לשמש ככלי שימושי בשלבים מאוחרים יותר של בדיקות פרה-קליניות בתהליך פיתוח התרופה, יש לו גם מספר מגבלות. מכיוון שרוב שירותי ה-MPS הזמינים כיום בשוק, זוהי פלטפורמה בעלת תפוקה נמוכה, ולכן קשה יותר להשתמש בה לפעילויות סינון סמים בקנה מידה גדול. מודל DILI, המורכב ממיקרו-רקמות שנוצרו על ידי PHHs ו-HKCs מתכלים, גם אינו יכול ללכוד לחלוטין את המורכבות של הכבד האנושי, ואופטימיזציה נוספת על ידי שילוב סוגים שונים של תאים (למשל, תאי מערכת החיסון) תועיל כדי להוסיף ערך למודל הקיים. ניתן לשלב את ה-MPS החד-איברי הזה גם עם פלטפורמות איברים אחרות שיכולות לחלוק מדיום משותף ולאפשר הצלבת איברים ברמה התאית או האנדוקרינית, וזה יכול לעזור להבין טוב יותר את התובנות המכניסטיות של רעילות שאינה מוגבלת רק לכבד עצמו. יתר על כן, כמו כל טכנולוגיה חדשה יחסית, היא עשויה להיחשב יקרה ולכן בעלת נגישות מוגבלת.
MPS היא פלטפורמה המשמשת לפיתוח מודלים אורגנוטיפיים של רקמות חד-אנושיות או רב-אנושיות. המערכת מורכבת מבקר, כבל טבור ומנהל התקן MPS שלתוכו מוכנסת הצלחת (איור 5A). בכל צלחת MPS לכבד יש 12 בארות פתוחות עצמאיות לגידול תאי כבד ראשוניים בתלת-ממד על פיגומים מהונדסים. לסיכום, המערכת נבדקת QC, והצלחות מוכנות ביום -1, ה-PHHs וה-HKCs נזרעים על הצלחות ביום אפס (איור 5B, ראו 1). מיקרו-משאבות משובצות מאפשרות את זרימת המדיה של תרביות תאים דרך הפיגומים כדי להקל על היווצרותם של מיקרו-רקמות תלת-ממדיות (איור 5B, ראו 2). מיקרו-רקמות שנוצרו הן QC'd ביום 4, מינון עם ריכוזים שונים של כל תרכובת כל 48 שעות במשך 4 ימים, ונבדק עבור סמנים ביולוגיים של נקודות קצה ביום 8 (איור 5C). ציר הזמן הניסיוני של בדיקת DILI בלוח MPS מתואר באיור 5D.
איור 5: המערכת המיקרופיזיולוגית וציר הזמן הניסויי של בדיקת DILI סטנדרטית. (A) המערכת המיקרופיזיולוגית על מרכיביה: בקר (1), כבל טבור (2), תחנת עגינה (3), מנהל התקן MPS (4) ולוח LC12 (5). (B) זריעה של PHHs ו- HKCs על צלחת LC12 ביום 1 (1) ומיקרו-משאבות מוטבעות מקלות על זרימת מדיה של תרבית תאים עם קצבי זרימה הניתנים לכוונון דרך המיקרו-רקמות התלת-ממדיות שנזרעו על הפיגומים (2). (C) הורדת הפיגומים בסוף המחקר. (D) ציר הזמן הניסויי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב שתבוצע בדיקת QC חזקה של המערכת לפני שתתחיל, תבדוק שהמערכת מתפקדת כראוי מבחינה פניאומטית והלוחות המתכלים נבדקים חזותית ומוכנים ביעילות כדי להבטיח פונקציונליות אחידה בכל הבארות. תאים אנושיים ראשוניים באיכות גבוהה חיוניים לפרוטוקול זה, כאשר הפטוציטים ידועים כדבקים באופן עקבי בניסויים בתרביות תאים ויוצרים אינטראקציות תלת-ממדיות. הפשרת תאים אלה היא גם שלב קריטי, שכן אין להחיות את ההפטוציטים הראשוניים על ידי פעולת פיפטינג מכיוון שהדבר עלול להוביל במהירות למוות של תאים. קיום תאים מעל 85% הוא קריטי לזריעה מוצלחת, שכן כמויות גדולות של פסולת תאית יפריעו להיווצרות מיקרו-רקמה תלת-ממדית. בדיקת QC של מיקרו-רקמות כבד שנוצרו ביום 4 חשובה גם היא, והמשתמש צריך לוודא שרמות מקובלות של LDH ו- Urea נמדדות, מכיוון שפרמטרים מחוץ לטווח עשויים להעיד על היווצרות רקמות באיכות ירודה ולאפשר פתרון בעיות פשוט. לבסוף, ההידרוקורטיזון המשמש במדיה של תרבית התאים חייב להיות מוכן טרי ביום השימוש כדי למנוע כל השפלה לא רצויה שעלולה להשפיע על תפקוד תרבית התא, כפי שהוא נדרש כדי לשמור על פונקציונליות מטבולית של hepatocytes.
למרות היותו בעל מורכבות משמעותית, MPS הכבד אינו מכיל את כל סוגי התאים של הכבד האנושי. ניתן להוסיף סוגי תאים נוספים למודל24,29 כדי להגדיל את הרלוונטיות הפיזיולוגית, אך יש להוסיף אותם רק עם הצדקה ברורה להקשר השימוש. לחקר DILI PHH הם סוג תא המפתח, והשילוב של HKCs במודל זה מאפשר לקבוע כמה תגובות אימונולוגיות. כמו כן, יש לציין כי PHHs מבודדים מכבדים אנושיים ו- PHHs בהקפאה הזמינים מסחרית נוטים להדגים כמה וריאציות מלוט ללוט. הוכחנו כאן כי פרוטוקול זה מייצר תוצאות הניתנות לשחזור כאשר משתמשים בו עם תכשירים איכותיים של תאים. עם זאת, ניתן היה לצפות לשונות מסוימת של לוט-לוט, וניתן להתגבר על כך עוד יותר על ידי שימוש במאגר של תורמים מרובים. ניתן להתגבר על מגבלות אלה על ידי שימוש בתאים דמויי הפטוציטים המתמיינים מ- iPSC המסכמים תכונות תפקודיות רבות של PHHs ואשר שימשו בתהליך פיתוח התרופה30. HKCs גם מראים הרבה השתנות רבה ורמה גבוהה של הפעלה עם הפשרה; לכן, תורמי HKCs מאומתים מראש בתוך החברה לפני השימוש בתרבית תאים ניסיונית (coculture עם PHHs מאומתים) וחייבים להיות בעלי רמות נמוכות של הפעלה לאחר הפשרה; זה מוערך על ידי מדידת סמנים ביולוגיים IL-6 ו- TNF-אלפא (ראה חומר משלים).
הנתונים המוצגים כאן מאשרים כי הבדיקה יכולה לזהות DILI במדויק, ומסייעת בזיהוי הפטוטוקסינים שאולי לא יזוהו על ידי2D 10,11 ואפילו כמה מודלים תלת-ממדיים. נתונים המופקים מ- MPS עדיין אינם משמשים כתקן על ידי תעשיית התרופות לצורך הגשות רגולטוריות או בדיקות סקר תרופות בשל היעדר סטנדרטיזציה והרמוניזציה של תהליכים, כולל שכפול בין-אתרי20. הנתונים והגישות הניסוייות שהודגמו כאן מתייחסים לכך, ומראים כי ניתן להשתמש במודל הכבד באופן שגרתי וחזק במסכי DILI כדי לחזות במדויק את האחריות של תרכובות חדשות.
על ידי מדידת מגוון של נקודות קצה כדי לייצר "חתימה של hepatotoxicity", עוזר לזהות תרכובות עם רמות שונות של דאגה DILI (כולל תרכובות שאינן ניתנות לזיהוי על ידי שיטות אחרות במבחנה) ואת מנגנוני הרעילות שלהם נחשף. טכנולוגיה זו יכולה לסגור את הפער בין תרבית תאים מסורתית ומודלים של בעלי חיים מצד אחד לבין ניסויים קליניים בבני אדם, ולהתקדם לקראת סימולציה של תנאים ביולוגיים אנושיים לצורך הערכה פרה-קלינית של רעילות הכבד כחלק מתהליך פיתוח התרופה.
Disclosures
כל המחברים הם עובדים של CN ביו חידושים מוגבלת.
Acknowledgments
CN Bio Innovations Ltd. מימנה מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture cluster plates flat bottom | Corning | 3524 | |
| 96 well clear assay plates, flat bottom clear plastic | Greiner | 655101 | |
| 96 well plates black flat bottom | Corning | 3915 | |
| 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | ThermoScientific | 165306 | |
| Advanced DMEM (1x) | Gibco | 12491015 | Cell culture media. |
| AssayMax Albumin ELISA Kit | AssayPro | EA3201-1 | Dilution 1:250. Time point Day 4, 6, and 8. |
| Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements) | Gibco | CM4000 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | Dilution 1:1. Time point Day 8. |
| Chlorpromazine HCl | Sigma Aldrich | C8138 | |
| Chromacol blue lids, 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | ThermoScientific | 9-SCK(B)-ST1 | glass vial |
| Chromacol vials, 9 mm Clear Glass Screw Thread Vials | ThermoScientific | 2-SVW | |
| Class 2 Microbiological Safety Cabinets - Trimat2 1500 exhaust | Contained Air Solutions | ||
| Conical tubes 50 mL | Greiner | 227261 | |
| Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM) | ThermoFisher Scientific | Gibco CM7000 | |
| Cryopreserved primary human hepatocytes | BioIVT Europe | Lot. RAS | |
| CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit | Promega | G1781 | Dilution - none. Time point Day 4, 6 and 8 |
| >Data analysis model used to generate the graph and EC:50 curves was nonlinear regression (curve fit) asymmetric sigmoidal, 5PL, where X is log(concentration | GraphPad Prism 9 | ||
| Disposable PES Filter Units 500mL | Fisher Scientific | 15913307 | |
| Disposable Pipette Basins 50ml | Fisher Scientific | 12369175 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich | Sigma D2650 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | |
| Easy Reader Conical Polypropylene Centrifuge Tubes 15 mL | Fisher Scientific | 11889640 | |
| Foetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Human ALT ELISA Kit | Abcam | ab 234578 | Dilution 1:5. Time point Day 6 and 8. |
| Human Cryopreserved Kupffer Cells | Lonza Europe | Lot. 190088KC | |
| hydrocortisone | Merck | H0888-1G | |
| Incubators models: New Brunswick Galaxy 170 S, New Brunswick Galaxy 170 R and CellXpert® C170. | Eppendorf | All serviced yearly; paperwork available upon request. | |
| Inverted Microscope | Leica DMIL LED | ||
| MPS know as Organ-on-a-Chip (OOC) | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| MPS LC-12 plate | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Neubauer Improved C-Chip Disposable Haemocytometer (2 channel) | Cambridge Bioscience | DHC-N01-50 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V9002 | Dilution - none. Time point Day 8 |
| PhysioMimix MPS platform | CN Bio Innovations Ltd. | ||
| Pioglitazone | MedChemExpress Tocris | HY-13956/CS-1700 | |
| Quantichrom Urea Assay Kit – Bioassay systems | Bioassay Systems | DY970-05 | Dilution 1:2 if initial reading is too high. Time point Day 4, 6 and 8. |
| Silica gel | Sigma-Aldrich | S7625 | |
| Software used to analyse and generate all the graphs was | GraphPad Prism 9 | ||
| Stripettes 10 mL | Fisher Scientific | 11839660 | |
| Stripettes 25 mL | Fisher Scientific | 11839181 | |
| Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements) | Gibco | CM3000 | |
| Troglitazone | MedChemExpress Tocris | 97322-87-7 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Tubes 1.5 mL | Greiner | 616201 | |
| Weighing balance - model PA214C and AV213C | Ohaus Corp |
References
- Lisi, D. M. Drug-induced liver injury: An overview. US Pharmacist. 41 (12), 30-34 (2016).
- Kuna, L., et al. Models of drug induced liver injury (DILI)-current issues and future perspectives. Current Drug Metabolism. 19 (10), 830-838 (2018).
- Katarey, D., Verma, S. Drug-induced liver injury. Clinical Medicine. 16 (6), London, England. 104-109 (2016).
- Kullak-Ublick, G. A., et al. Drug-induced liver injury: recent advances in diagnosis and risk assessment Recent advances in clinical practice. Gut. 66, 1154-1164 (2017).
- Dirven, H., et al. Performance of pre-clinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Scientific Reports. 11 (1), 6403 (2021).
- Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Current Drug Metabolism. 9 (1), 1-11 (2008).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line HepG2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Gerets, H. H. J., et al. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
- Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).
- Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).
- Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Advances in engineered liver models for investigating drug-induced liver injury. BioMed Research International. 2016, 1829148 (2016).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 32 (1), 56-67 (2000).
- Bell, C. C., et al. Comparison of hepatic 2D sandwich cultures and 3D spheroids for long-term toxicity applications: A multicenter study. Toxicological Sciences. 162 (2), 655-666 (2018).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Khetani, S. R., et al. Use of micropatterned co-cultures to detect compounds that cause drug-induced liver injury in humans. Toxicological Sciences. 132 (1), 107-117 (2013).
- Ma, X., et al. Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).
- Dieterle, P. Y. M., Dieterle, F. Tissue-specific, non-invasive toxicity biomarkers: translation from pre-clinical safety assessment to clinical safety monitoring. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 5 (9), 1023-1038 (2009).
- Rowe, C., et al. Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins. Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).
- Rubiano, A., et al. Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation. Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).
- Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Kostrzewski, T., et al. Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).
- Kostrzewski, T., et al. A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).
- Vacca, M., et al. Bone morphogenetic protein 8B promotes the progression of non-alcoholic steatohepatitis. Nature Metabolism. 2 (6), 514-531 (2020).
- Long, T. J., et al. Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms. Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).
- Bai, J., Wang, C. Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery. Frontiers in Pharmacology. 11, 407 (2020).
- Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).
- Clark, A. M., et al. A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).
- Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083 (2021).
