Automatically Generated

Summary

Vi beskriver metodikken og betydningen av den aktuelle applikasjonen bioassay for å måle insektmiddel mottakelighet i mygg og fruktfluer. Den presenterte analysen er høy gjennomstrømning, utnytter insektmasse- og tillater dermed beregning av en masse-relativisert dødelig dose i stedet for konsentrasjon – og har sannsynligvis lavere variasjon enn andre lignende metoder.

Abstract

Fortsatt bruk av insektmidler for folkehelse og landbruk har ført til utbredt insektmiddelresistens og hemming av kontrollmetoder. Insektmiddelresistensovervåkning av myggpopulasjoner gjøres vanligvis gjennom Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flaskebioassays eller World Health Organization (WHO) rørtester. Imidlertid kan disse metodene resultere i en høy grad av variasjon i dødelighetsdata på grunn av variabel insektmiddelkontakt med insektet, det relativt små antallet organismer testet, omfattende variasjon i masse mellom populasjoner og stadig skiftende miljøforhold, noe som fører til variable resultater. Dette papiret presenterer den aktuelle applikasjonen bioassay, tilpasset som en høy-gjennomstrømning fenotypisk bioassay for både mygg og fruktfluer, for å teste et stort antall insekter langs en rekke insektmiddelkonsentrasjoner.

Denne analysen 1) sikrer konsistent behandling og insektmiddelkontakt med hver organisme, 2) produserer svært spesifikke doseresponskurver som står for forskjeller i gjennomsnittlig masse mellom stammer og kjønn (som er spesielt viktig for feltoppsamlede organismer), og 3) muliggjør beregning av statistisk strenge median dødelige doser (LD₅₀ ), som er nødvendige for sammenligninger av resistensforhold – en alternativ overvåkingsmetode fra diagnostisk dosedødelighet, som også brukes til larvicidresistensovervåking. Denne analysen vil være et komplementært verktøy for nøyaktig fenotyping myggpopulasjoner, og som illustrert ved hjelp av fruktfluer, er lett tilpasningsdyktig for bruk med andre insekter. Vi hevder at denne analysen vil bidra til å fylle gapet mellom genotypisk og fenotypisk insektmiddelresistens i flere insektarter.

Introduction

Mygg er ansvarlig for over 700.000 dødsfall hvert år på grunn av sykdommene de overfører til mennesker, med over halvparten av disse dødsfallene på grunn av malaria alene¹. Den viktigste forebyggende metoden mot overføring av malaria og andre vektorbårne sykdommer er bruk av insektmidler, ofte i form av langvarige insektmiddelnett eller innendørs gjenværende sprøyting². Insektmiddelresistens er imidlertid utbredt blant mygg og andre insektvektorer, samt landbruksskade skadedyr ^3,4. For effektivt å håndtere motstand er overvåking av viktig betydning⁵. For dette er det nødvendig med svært nøyaktige og høygjennomstrømningsmotstandsdeteksjonsmetoder. For tiden er de mest utbredte overvåkingsverktøyene for insektmiddelresistens for mygg WHO tube test⁶ og CDC-flasken bioassay⁷. For fruktfluer er gjenværende kontaktapplikasjonsmetode (lik CDC-flasken bioassay) et vanlig brukt insektmiddelbioassay ^8,9,10. Imidlertid er variasjonen i data fra disse metodene vanligvis høy, med målinger av samme laboratorie myggstamme som spenner fra ~ 20-70% dødelighet i CDC-flaskeanalyser og 0-50% i WHO-rørtester når de utsettes for subletal doser¹¹. Slike variasjoner er overraskende fordi den begrensede genetiske variasjonen i de fleste laboratoriestammer forventes å føre til begrenset variasjon i insektmiddelets følsomhet i befolkningen. Likevel er det fortsatt stor variasjon i bioassayresultatene.

Potensielle kilder til denne variasjonen kan være et resultat av heterogen insektmiddeleksponering mellom prøver i bioassay på grunn av indirekte insektmiddeleksponering via overflaten, heterogene miljøeffekter, normal biologisk variasjon mellom individer av samme genotype og variasjon i massen av prøver av samme populasjon^12. . En sjelden brukt metode med høyere replikerbarhet er den aktuelle applikasjonen bioassay. I denne analysen påføres insektmiddelet direkte på hvert insekt^13,14, og fjerner faktoren for heterogen eksponering av forskjellige prøver innenfor samme analyse. På grunn av denne metodens langsomme gjennomstrømning brukes den imidlertid ikke rutinemessig som et insektmiddel mottakelighetsovervåkingsverktøy for myggpopulasjoner. Dette dokumentet presenterer en modifisert protokoll for den aktuelle applikasjonsbioassay som gir mulighet for høyere gjennomstrømningseksponeringer samtidig som den korrigerer for variasjon i insektmasse, en parameter som korrelerer med endringer i insektmiddel mottakelighet¹². En reduksjon i støy og masserelatert variasjon i dødelighetsdata fra variabel insektmiddeleksponering vil gi mer nøyaktig teknisk^{motstandsovervåking 11,15}. Slike data kan brukes til å knytte fenotypisk resistens mer nøyaktig til genetiske markører, treningsparametere og/eller vektorkompetanse. I tillegg demonstrerer vi hvordan denne analysen lett kan tilpasses andre insektarter ved å bruke den aktuelle anvendelsen bioassay på fruktfluer, en mindre kroppslig insektart.

Hovedbegrensningen for de nevnte gjenværende kontaktapplikasjonene er at insektmiddeleksponering kan variere fra prøve til prøve i samme analyse. Når det gjelder CDC-flaskebioassays og kontaktmetoden, kan insektmiddeleksponering variere mellom replikeringer av samme analyse. Insektene er utsatt for insektmiddel som enten distribueres på innsiden av en glassflaske (CDC-flaskebioassay og kontaktmetode) eller på impregnerte papirer (WHO tube test). Konsentrasjonen av insektmiddel på begge overflater (glass og papir) er kjent og forhåndsbestemt ved å screene forskjellige arter av kjente genotyper. Mengden som er tilgjengelig for potensielt å bli absorbert av insektet, kan imidlertid variere sterkt avhengig av overflaten som brukes, insektmiddelblandingskomponentene og hvor homogent insektmiddelet fordeles over overflatematerialet^16,17. I CDC-flasken bioassay er insektmiddelbelegget på innsiden av flasken avhengig av prosedyrer som brukes av hvert laboratorium og bruker. I WHO-rørtesten produseres insektmiddelbehandlede papirer sentralt og dermed mest sannsynlig ganske homogent på tvers av laboratorier. Men i WHO-rørtesten tillater eksponeringsrøret prøver å lande og hvile på ikke-insektmiddeleksponert metallnett, noe som fører til potensiell heterogen insektmiddeleksponering blant prøvene i hver test. Den faktiske mengden insektmiddel plukket opp og absorbert av prøver via hver metode må fortsatt utforskes ytterligere¹⁸.

I tillegg brukes CDC-flasken bioassay, WHO tube test og kontaktmetode oftest som terskelanalyser som tester bare en forhåndsbestemt insektmiddelkonsentrasjon. Denne tilnærmingen kan nøyaktig oppdage tilstedeværelsen av motstand og er verdifull for motstandsovervåking (spesielt når motstanden sprer seg). Terskelanalyser kan imidlertid ikke kvantifisere styrken på motstanden, noe som kan være mer prediktivt for effekten av intervensjonsverktøy. Hvis flere insektmiddelkonsentrasjoner brukes med disse metodene, kan de brukes som intensitetsanalyser. Intensitetsanalyser for CDC-flasken bioassay og WHO tube test har blitt introdusert ved å teste 5x og 10x de forhåndsbestemte diskriminerende doser for å adressere dette gapet i overvåking ^6,19. Samtidig som det gir større evne til å skille mellom resistente populasjoner, gir 3-5 (forhåndsbestemte) doser begrenset oppløsning for å beregne dødelige konsentrasjoner. I tillegg brukes mygg av forskjellige størrelser i slike analyser. Likevel er massen viktig å måle ettersom større prøver kan trenge en høyere dose for å bli drept, da den effektive dosen per masseenhet vil være mye lavere enn for en mindre organisme¹². Beregning av en masse-relativisert dødelig dose (mengde insektmiddel per insektmasse) ville være en mer nyttig beregning enn den mer vanlige dødelige konsentrasjonen (f.eks. mengde insektmiddel per overflateareal) da den vurderer variasjonen av insektmasse mellom kjønn, populasjoner og genotyper. Slike data vil bidra til å fylle gapet mellom genotypisk og fenotypisk motstand i laboratoriet og feltet, og kan også gi en enkel måte å beregne den nødvendige applikasjonskonsentrasjonen for å behandle en populasjon av insekter av en kjent gjennomsnittlig masse.

Bruken av masse-relativiserte dødelige doser som dreper 50% av prøvene (LD₅₀) inneholder også flere andre fordeler. Vurdering av toksisiteten til en bestemt forbindelse i mg/kg (= ng/mg) er standard i human og veterinær toksikologi¹⁴, og LD_50-verdier finnes på sikkerhetsdatablad. Dødelige doser tillater også direkte sammenligning av toksisitet mellom forskjellige kjemikalier mot en bestemt art eller samme kjemikalie mot forskjellige arter²⁰, samt høyverdig evaluering av nye insektmidler og kjemikalier¹³. I tillegg kan LD₅₀ gi mer meningsfylte og nøyaktige motstandsforhold enn de som er avledet av diagnostiske dosedødelighetsresultater, noe som kan føre til en overestimering av motstandsnivået som finnes i en populasjon. Derfor vil denne analysen være egnet for rutinemessige overvåkingsprogrammer ved å gi strengere motstandsovervåking basert på masse relativiserte dødelige doser avledet fra flere prøver enn anbefalt for andre bioassays²¹.

Den aktuelle applikasjonsmetoden har blitt brukt i insektmiddel mottakelighet overvåking for mygg og fluer som et alternativ for standard insektmiddel mottakelighet bioassays når motstand er allerede kjent eller mistenkt^22,23, samt for overvåking i noen insekter²⁴ for mer nøyaktig å vurdere motstandsprofiler og insektmiddel iboende toksisitet²¹ . I aktuell anvendelse bioassays påføres insektmiddelet på hver organisme, noe som resulterer i minimal variasjon i insektmiddeleksponering. Dette papiret presenterer en litt tilpasset og forbedret metode som gjør det mulig å bruke insektmiddeleksponering på et stort antall insekter på kort tid, samtidig som det kontrolleres for insektmasse²². Denne metoden med høyere gjennomstrømning med gode nivåer av replikerbarhet kan være et nyttig ekstra verktøy for rutinemessig insektmiddel mottakelighet overvåking.

Protocol

MERK: Insekticider kan forårsake menneskelige, dyre- og miljøfarer25. Forsiktighet, opplæring og personlig verneutstyr anbefales på det sterkeste. Pass på å følge de materielle sikkerhetsdatabladene for alle insektmidler og løsningsmidler som brukes. 1. Bakre prøver Bakre 3-5-dagers voksne mygg.MERK: Protokollen nedenfor gjenspeiler betingelsene for Aedes aegypti-oppdrett , tett etter FNs retningslinjer for mat og landbruk26. Bakre mygg i alle livsstadier ved 27 ± 1 °C og 75 ± 5 % relativ fuktighet med 12:12 timers lys og mørk sykling. Lukk myggeggene ved å senke dem ned i deionisert vann og tilsett gjær26, eller legg de nedsenkede eggene inne i et vakuumkammer i 30 minutter.MERK: Begge metodene reduserer oksygeninnholdet i vannet og øker klekkingen27. Fôr de nyutviklede larvene fiskemat (eller et tilsvarende kosthold som malt kattefôr) i skuffer og hold larvetettheten så lik som mulig mellom skuffer, da larvetetthet påvirker utviklingen12 (f.eks. 200-250 larver per brett som inneholder totalt 1,5 liter vann). Fôr larvene annenhver dag til de når puppetrinnet (ca. 7-10 dager), og øk mengden mat etter behov.MERK: Når matet for lite, larv vekst vil bli stunted, og larvene kan spise hverandre. Når de mates for mye, kan larvene dø, noe som får vannet til å gå dårlig. Når pupper utvikler seg, overfør dem daglig til en vannskål i voksne myggbur og gi 10% sukroseløsning ad libitum. Registrer den første dagen av voksen fremvekst. Fjern de resterende puppene fra buret 2 dager etter at fremveksten starter.MERK: Mannlige mygg dukker opp raskere. Legg merke til fremveksten av menn og kvinner separat og sørg for at tilstrekkelige menn og kvinner er tilgjengelige for hver test. Vent i 3 dager etter å ha fjernet puppene for å oppnå 3-5-dagers gamle mygg for testing. Bakre fruktfluer (løst etter protokoller fra Universitetet i Zürich28). Bakre Drosophila stammer i lagerflasker ved 23 ± 1 °C og 60 ± 5 % relativ luftfuktighet med 12:12 timers lys og mørk sykling.MERK: Drosophila lagerflasker skal inneholde 75 ml av et standard fluemedium, som først helles som væske i bunnen av flaskene og deretter får lov til å størkne over natten. Overfør kolonier til nye lagerflasker med fersk mat annenhver uke for å forhindre overbefolkning og muggvekst. For å gjøre dette, slå ned fluer ved hjelp av en håndholdt karbondioksid (CO2) dispenser, overfør bedøvede fluer til et veiepapir på en ispakke eller kjølebord, og pensle fluene i en fersk lagerflaske ved hjelp av en finpolet pensel. Pass på å holde flaskene på sidene under denne prosessen for å forhindre at fluer faller inn i maten og drukner. 2. Forbered insektmiddelformuleringer ved hjelp av gravimetrisk tilnærming Lag den første lagerløsningen etter den gravimetriske tilnærmingen ved hjelp av en analytisk skala med 0,1 mg nøyaktighet inne i en avtrekkshette.MERK: Den gravimetriske tilnærmingen bruker masse for å måle mengden insektmiddel og løsningsmiddel som tilsetts. Standardpraksisen (volumetrisk tilnærming) vil kreve en analytisk skala for å måle mengden (solid) insektmiddel som legges til når den første lagerløsningen fremstilles; Imidlertid måles mengden løsningsmiddel som tilsetts og alle etterfølgende fortynninger bare etter volum. Den gravimetriske tilnærmingen har et høyere nøyaktighetsnivå og er derfor foretrukket. Bestem målinseksjonskonsentrasjonen og målvolumet (maksimalt 10 ml anbefales hvis du bruker 15 ml koniske rør for å forhindre søl ved lagring i en fryser) for den første lagerløsningen og beregne hvor mye insektmiddelaktiv ingrediens (AI) for å legge til ved hjelp av Eq (1):   (1) Forbered et lagringsrør (15 ml konisk rør anbefales for større volumer, 1,5 ml mikrocentrifuge skruehettrør anbefales for volumer på 1 ml eller mindre) og etikett med insektmiddel og løsningsmiddelnavn, målkonsentrasjon og tilberedningsdato. Plasser røret og lokket på vekten i et stativ eller en holder og tara vekten. Vei ønsket mengde fast eller flytende insektmiddel AI bestemt fra trinn 2.1.1. (f.eks. deltametrin som brukes til de representative dataene) i røret og registrerer massen. Tara skalaen og legg til ønsket volum av løsningsmiddel (tilsvarende målvolumet) til røret, lukk lokket umiddelbart og registrer massen. Lukk rørets lokk umiddelbart etter tilsetning av oppløsningsvæsken (aceton som brukes her) for å unngå fordampning og bland oppløsningen. Registrer romtemperaturen. Noen løsningsmidler, som aceton, kan ha betydelige volumendringer (og følgelig tetthet) avhengig av temperatur. Hvis du oppbevarer det umiddelbart, vikle rørets lokk i parafilm (for å redusere fordampning), legg det i et rørstativ / holder (for å holde deg oppreist og forhindre lekkasje), deksel i folie (for å forhindre UV-eksponering), plasser det i en resealable plastpose (for å redusere fordampning), og legg posen i en -20 ° C fryser. Hvis det ikke oppbevares umiddelbart, må du kontrollere at lokket er festet og dekselet i folie eller en lysbeskyttet beholder. Beregn lagerløsningens faktiske konsentrasjon (mg / ml) ved å dele massen av insektmiddel AI tilsatt av volumet av løsningsmiddel tilsatt (og volumet av insektmiddel tilsatt hvis det er i flytende form). For å beregne volumet av tilsatt løsningsmiddel (eller flytende insektmiddel), del massen tilsatt av den kjente tettheten som passer for den registrerte temperaturen. Beregn tettheten (g / ml) av lagerløsningen ved å dele den totale massen som er tilsatt (insektmiddel og løsningsmiddel) med det totale volumet som er tilsatt (løsningsmiddel og insektmiddel, hvis det er i flytende form). Se trinn 2.1.7 for konvertering av flytende masse til volum. Fortynn den opprinnelige lagerløsningen serielt via 10 % fortynning. Bruk om nødvendig disse serielle fortynningene til å lage en innledende doseresponskurve for å identifisere målområdet for insektmiddelkonsentrasjoner for bioassay. Beregn volumet av insektmiddelbestandsløsning og løsningsmidlet for å legge til hvert rør (f.eks. 1 ml insektmiddelbestandsoppløsning fortynnet i 9 ml løsningsmiddel for en 10 ml fortynning av 10% av forrige konsentrasjon). Virvel lagerløsningen for 10 s. Tara et forhåndsmerket første fortynningsrør på skalaen. Tilsett det nødvendige volumet av lagerløsning til det første fortynningsrøret ved hjelp av en pipette. Lukk straks lokket på begge rørene og registrer massen i det første fortynningsrøret. Tjære det første fortynningsrøret igjen og tilsett det nødvendige volumet av løsningsmiddel. Lukk lokket umiddelbart, registrer massen av det tilsatte løsningsmidlet, og virvel den første fortynning i 10 s. Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3 for de resterende fortynningene. Oppbevar alle fortynninger som beskrevet ovenfor i trinn 2.1.6. Beregn de faktiske konsentrasjonene av fortynning ved å følge trinn 2.1.7. Beregn tettheten av hvert insektmiddelfortynning ved å dele den totale massen som er tilsatt (insektmiddelløsning og løsningsmiddel) med det totale volumet som er tilsatt (insektmiddelløsning og løsningsmiddel). For hver seriell fortynning, bruk den forrige insektmiddelbestandens fortynning av tetthet for å beregne den nye fortynningstettheten etter Eq (2): (2) Valgfritt: Lag insektmiddelfortynning med mindre trinn ved seriell fortynning. Velg konsentrasjonene og volumene til hver ny løsning som skal lages ved hjelp av en doseresponskurve av de første serielle fortynningene, tidligere studier eller publisert litteratur.MERK: Utvalgte konsentrasjoner bør resultere i et dødelighetsområde på 0-100%, med minst tre konsentrasjoner fra dette området for å tillate probitanalyse. Bruk de serielle fortynningene som lagerløsninger for å lage hver ny fortynning og følg trinn 2.2 for å skape de nye fortynningene mellom de 10 ganger fortynningene. Valgfritt: Aliquot insektmiddeloppløsningen. Hvis større volumer av insektmiddelløsningene er laget, aliquot løsningene i 1,5 ml skruehettrør for å unngå forurensning, fordampning og nedbrytning av lagerløsningene fra hyppig håndtering og eksponering for lys. Aliquot løsningene, starter fra laveste konsentrasjon og arbeider mot den høyeste konsentrasjonen for å redusere potensiell forurensning. Bland hver lagerløsning ved å virvelere i 10 s før du åpner og rører ønsket volum (f.eks. 0,5 ml) i et forhåndsmerket skruehettrør. Oppbevar aliquots i en lysbestandig beholder i en -20 °C fryser.MERK: Det anbefales å regelmessig (månedlig) erstatte aliquots med små nye aliquots tatt direkte fra lageret plantevernmiddel fortynning. Dette vil begrense potensialet for kontaminering som skal overføres til andre eksperimenter eller endringer på grunn av fordampning eller UV-forringelse mens prøvene brukes på benken. Protokollen kan settes på pause her og startes på nytt enda flere år senere, så lenge insektmiddelløsningene lagres riktig (se trinn 2.1.6) og oppbevares i -20 °C fryseren. Bruk en permanent markørpenn for å markere menisken før lagring for å overvåke fordampning av løsningsmidler. Når du fjerner insektmiddeloppløsning for å lage aliquots, merk menisken hver gang løsningen fjernes. 3. Forbered aktuell anvendelse bioassay arbeidsområde MERK: Det anbefales å jobbe i et benkeplate insekthåndteringstelt for enklere fangst av å unnslippe mygg eller fluer. Se Supplerende figur S1 for bilder av et insekthåndteringstelt. Fjern de nødvendige insektmiddelløsningene fra fryseren, virvelen umiddelbart, og legg dem i en lysbestandig beholder ved romtemperatur for å la insekticidene varme til romtemperatur før bruk.MERK: Insektmiddel-AIer kan skilles fra løsningsmidlet ved kjøligere temperaturer. I tillegg endres acetonvolumet med temperatur, noe som kan endre den påførte insektmiddeldosen. Blanding av løsningene og slik at de kan varme til romtemperatur bidrar til å sikre konsistens ved bruk av insektmiddelløsningene. Sett ut alle nødvendige verktøy og materialer for den aktuelle applikasjonsanalysen i insekthåndteringsteltet som referert i materialtabellen. Rengjør sprøytefatet og nålen med analytisk aceton ved å fullføre 5 vasker per aceton aliquot. Fullfør dette med 5 separate aliquots for totalt 25 vasker. Se supplerende figur S2 for sprøyte- og repeaterpipettordeler. Sett ut 5 mikrocentrifuge rør med 0,5 ml aceton hver. Fyll sprøytefatet med 0,025 ml aceton fra det første røret, og utvis deretter acetonen i en avfallsbeholder ved å skyve stempelet raskt ned. Gjenta fire ganger til for å fullføre totalt fem acetonvasker fra samme aceton aliquot. Fyll deretter sprøytefatet helt med luft og utvis luft og potensielle acetonrester inn i avfallsbeholderen. Gjenta to ganger til for å fullføre tre “vasker” med luft. Gjenta trinn 3.3.2 for de resterende 4 rørene med aceton. Lag en luftlomme i sylinderen mellom sprøytestempelen og toppen av nålen ved å trekke stempelet litt opp i fatet (~5 mm).MERK: Denne luftlommen beskytter stempelet mot å kontakte insektmiddelløsningene og reduserer insektmiddeloverbæring. Sett sprøyten til side til den er klar til bruk for lokal påføring. Opprett en nøkkel som inneholder dosene som skal påføres, og tilordne tilfeldige ID-er etter tilfeldige tall- eller bokstavgeneratorer (se Tilleggsfil 1). Merk plastholderkoppene med tilfeldig ID for blind dødelighetsvurdering.MERK: Om nødvendig kan protokollen settes på pause her og startes på nytt på et senere tidspunkt. Hvis mer enn noen få timer går mens du pauser, oppfordres det til å gjenta trinn 3.3 for å sikre at sprøyten er ren og plassere insektmiddelløsningene tilbake i fryseren til omtrent en time før dosering av insekter og gjenta deretter trinn 3.1. 4. Forbered prøver for den aktuelle bioassay. Se figur 1 hvis du vil ha en oversikt over fremgangsmåter Sorter og vei myggene Ved hjelp av en aspirator drevet av sug fra innånding, aspirerer du ønsket antall 3-5-dagers voksne mygg som trengs for analysen, inkludert et overskudd for å ta hensyn til skadede personer. Overfør myggene til et konisk rør (opptil 100 mygg per rør) ved å plassere spissen av aspiratoren i røret med bomull viklet rundt spissen og forsiktig puste ut og banke på aspiratoren. Bruk bomullen til å koble til røret når aspiratorspissen er fjernet og deretter hette med lokket. Unngå å fylle aspiratoren og rørene med for mange mygg samtidig, da dette gir ekstra stress på myggene og kan forårsake død. Slå kort ned myggene i rørene ved å plassere dem i minst 10 minutter ved 4 °C eller begrave dem under is i et isbrett.MERK: Mygg kan holdes ved 2 °C i flere timer med minimal dødelighet29; Det er imidlertid best å minimere varigheten som myggene er på is for å redusere potensielle negative effekter. Overfør de nedslåtde myggene til insekthåndteringsteltet ogpp forsiktig myggene ut på en plastbrett (f.eks. Petri-tallerken) plassert på isen. Hell bare ca 50 mygg om gangen for å sikre at hver berører den kjølige skuffen under den og forblir slått ned. Sorter myggene etter kjønn ved å forsiktig plukke dem opp av beinet (eller vingene) med tang og legg hvert kjønn i en egen holdekopp. Tell antall mygg av hvert kjønn mens du sorterer og stopper når ønsket nummer er nådd. Mens du sorterer, fjern mygg som er skadet (f.eks. manglende ben) eller er ekstra store (f.eks. unormalt forstørret mage) eller små (lett å skille med det blotte øye som mindre enn den gjennomsnittlige myggstørrelsen til den befolkningen).MERK: Håndtering av myggene ved vedleggene reduserer strukturelle skader på deres myke primærlegemer (f.eks. mage). Registrer vekten av hver kopp mygg ved hjelp av en analytisk skala med 0,1 mg presisjon. Legg en tom kopp med en Petri-tallerken som lokk på vekten og tjære vekten. Hell myggene i beholderen, legg lokket på toppen, og legg beholderen på skalaen. Registrer kombinert vekt og antall eksemplarer på resultatarket (se Tilleggsfil 2). Plasser straks koppen av prøver tilbake på is for å holde dem immobilisert. Gjenta trinn 4.1.5.1-4.1.5.2 til alle kopper med prøver er veid. Del de tilberedte myggene i grupper på 20-25 i separate kopper plassert på is merket med de tilfeldige ID-ene. Når du overfører mygg, ta sikte på å redusere stress og fysisk skade forårsaket av tang. Ideelt sett, plukk myggene opp ved hjelp av tang 1-2 ganger bare: en gang for sortering / veiing og en potensiell andre gang for overføring til eksperimentelle kopper.MERK: Et ideelt antall mygg per kopp er 20-25, som er nok for en replikering, er rimelig å vurdere dødeligheten, og bør ikke resultere i tetthetsindusert stress / død i koppen. Sorter og vei fruktfluene Bedøv fluene ved hjelp av CO2 i 7 s.MERK: Hvis fluer utsettes for CO2 i mer enn 7 s, kan de ha problemer med å krype og fly når de våkner30. Hell fluene på en ispakke innpakket i benkpapir og bruk en finspisset pensel for å skille og telle menn og kvinner. Bruk penselen til forsiktig å plukke opp de valgte fluene og legg dem i en ren, tom lagerflaske. Velg like mange mannlige og kvinnelige fruktfluer (f.eks. 15 hanner og 15 kvinner) og merk lagerflaskene med stammenavn og fruktflue totalt (f.eks. canton-s, 30 fluer).MERK: Det er viktig å ha like mange kvinnelige og mannlige fruktfluer fordi mannlige fruktfluer kan oppleve økt aggresjon mot hverandre etter å ha blitt fjernet fra tilstedeværelsen av kvinner31. Derfor, for å unngå ikke-insektmiddeldødelighet eller skader, er det best å ha like mange menn og kvinner (eller utelate mannlige fruktfluer helt). Registrer vekten av hver flaske fruktfluer ved hjelp av en analytisk skala. Plasser et tomt hetteglass (merket med en tilfeldig ID, se trinn 3.4) med en Petri-tallerken som lokk på vekten og tjære vekten.MERK: Hetteglass av glass anbefales for bruk med fruktfluer, da de reduserer det statiske betydelig. Bedøv flasken med fruktfluer som tilsvarer hetteglassets tilfeldige ID ved hjelp av CO2 i 7 s. Hell fruktfluene på veiepapir og bruk papiret som en trakt for å introdusere fluene i hetteglasset. Plasser Petri parabolen lokket på toppen av hetteglasset med fruktfluer og legg den på skalaen. Registrer den kombinerte vekten og antall prøver på resultatarket og legg deretter umiddelbart hetteglasset med fruktfluer i et brett med is, med lokket fortsatt på toppen for å forhindre at fluene unnslipper. Gjenta trinn 4.2.4.1-4.2.4.4 for hver flaske fruktfluer. Når trinnene ovenfor er fullført, går du umiddelbart videre til neste del. 5. Doseprøver Last sprøyten med riktig insektmiddelkonsentrasjon. Start med den minst konsentrerte dosen og arbeid mot den mest konsentrerte dosen med hver gruppe organismer. For å forhindre avfall, last bare sprøyten med det nødvendige volumet av insektmiddel pluss en anbefalt ekstra 2 μL. Vipp prøvene på veiepapir(er) som er plassert på toppen av et brett på isen. Skill prøvene som er tett sammen ved hjelp av en ren, insektmiddelfri pensel eller bomullspinne for å gi enkel tilgang til hvert eksemplar for dosering. For mygg, bruk penselen også for å sikre at hver prøve ligger på dorsum og deres ventrale overflate vender opp. Bruk sprøyten, bruk en dråpe insektmiddelløsning (eller aceton for kontrollen) på ventral thorax og mageområde for mygg og dorsum for fruktfluer. Påfør en 0,2 μL dråpe (som krever en 10 μL sprøyte) for mindre insekter som fruktfluer og en 0,5 μL dråpe (som krever en 25 μL sprøyte) for mygg.MERK: Insektmiddelfølsomheten varierer ikke signifikant mellom primær kroppsdeler (som hode, thorax og mage) sammenlignet med vedlegg (for eksempel vinger, ben eller proboscis)32. Derfor trenger ikke applikasjonsstedet å være nøyaktig så lenge dosedråpen påføres primærkroppen. Den ventrale thoraxen og mageområdet er valgt for mygg fordi de ofte ligger på sin dorsale side når de slås ned, mens dorsum er valgt for fruktfluer fordi de ofte ligger på sin ventrale side når de slås ned. Denne reduserte spesifisiteten til applikasjonsområdet bidrar til å øke gjennomstrømningen til denne metoden. Hell straks prøvene tilbake i den merkede plastkoppen og dekk koppen med netting og et gummibånd. Legg koppen i en holdebrett og legg merke til på koppen eventuelle prøver som ble drept, skadet eller rømt i denne prosessen (for å utelukke dem i den endelige tellingen av prøver i den koppen). For den første koppen registrerer du tiden når doseringen er fullført. Bytt ut veiepapiret(e) som prøvene er plassert på for å unngå insektmiddelforurensning mellom doser. Gjenta dosering for hver kopp til alle prøvene er dosert med riktig insektmiddelkonsentrasjon og registrer sluttidspunktet når alle prøvene er dosert. Gi 10% sukroseløsning til hver kopp via en gjennomvåt bomullsdott og sett koppene til side til dødeligheten vurderes neste dag. Oppbevar myggene ved 27 ± 1 °C med 75 ± 5 % relativ fuktighet5 , og frukten flyr ved 23 ± 1 °C med 60 ± 5 % relativ fuktighet.MERK: Vær forsiktig mens du klemmer bomullsbollene for å unngå overmetning eller undermetning. Bomullsbollene skal være fuktige, men ikke dryppende. Dryppende sukkervann i koppen kan føre til dødelighet av prøvene og dermed påvirke dødelighetsvurderingen av insektmiddelet. 6. Vurdere dødelighet Registrer prøvedødelighet ved 24 timer etter starten av insektmiddeleksponering. Klassifisere mygg som levende hvis de kan fly og holde seg oppreist; som døde hvis de er immobile eller ataxic (ute av stand til å stå eller ta av for flyturen), som beskrevet av WHO6. Følg samme dødelighetsvurdering for fruktfluer 8,33.MERK: For å vurdere forsinket dødelighet kan dødeligheten i tillegg vurderes etter 48 og 72 timer med daglige sukkervannsendringer. Etter at dødeligheten er registrert, plasser alle koppene med prøver i en inneholdt pose i en fryser i minst 1 time for å sikre at alle prøvene er døde før avhending eller etterfølgende bruk (f.eks. molekylær eller kjemisk analyse). 7. Utfør replikeringer Gjenta trinn 3-6 på et nytt sett med prøver, og pass på å utføre repliker samtidig hver dag, da insektmiddelfølsomhet kan endres avhengig av tidspunktet på dag34. Sørg for at minimum 3 replikerer for hver konsentrasjon for nøyaktig estimering av den dødelige dosen som dreper 50% av prøvene (LD50). Inkluder flere replikeringer hvis det observeres et høyt variabilitetsnivå. Fullfør analysen etter at alle dataene er samlet inn. 8. Analyser resultatene Registrer data i et regnearkprogram og bruk den tilfeldige ID-nøkkelen til å avmaskere dataene (referansetrinn 3.4). Lagre dataene som en tekstfil (se eksempeldata i Tilleggsfil 3) for analyse i statistikkprogrammet R35 (se eksempel R-kode i Supplemental File 4) eller annen programvare du velger36. Fullfør følgende analyse i programmet. Se Tilleggsfil 4 hvis du vil se et eksempel på en R-kode. Beregn dosen av insektmiddel (ng) per prøvemasse (mg) etter Eq (3) nedenfor: (3) Beregn jordelivet og bruk Abbotts formel37 for å korrigere dødeligheten i forhold til dødeligheten som er observert i hver kontroll37. Alternativt kan du bruke Schneider-Orelli (1947)-formelen for å korrigeredødeligheten 38. Med begge formelene kan du bruke rettelsen på alle data uavhengig av dødelighet i hver kontroll, som tidligere beskrevet37 og implementert39, med mindre kontrolldataene er uvanlig høye (se diskusjonen nedenfor).MERK: Abbotts formel og tilsvarende alternativer, som Schneider-Orelli-formelen, justerer dødelighetsverdiene proporsjonalt med omfanget av dødelighet som ikke er observert i kontrollene, og vil ikke føre til en reduksjon i dødeligheten for kopper som hadde 100% dødelighet. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se referanseene for disse formlene. Transformer korrigerte dødelighetsdata til sannsynlighetsverdier (sannsynlighetsenhet)40 og utfør lineær regresjon mellom insektmiddeldosen og transformerte dødelighetsdata. Bruk en kjikvadrattest for å vurdere passformen til de lineære modellene.MERK: Dødelighetsverdier på 0 (0 % dødelighet) eller 1 (100 % dødelighet) fjernes fra dataene før sannsynlighetstransformasjonen fullføres. Dette er nødvendig på grunn av arten av sannsynlighetstransformasjonen. Som sådan vil de grafiske dataene ikke inneholde positive eller negative kontroller eller andre data som resulterte i 0% eller 100% dødelighet (etter at Abbotts korreksjon er brukt). Beregn LD50 og 95% konfidensintervaller (CIer) per prøvestamme, populasjon og / eller kjønn etter tidligere publiserte metoder 39,41,42. MERK: Hvis de 95 % CIene av to stammer ikke overlapper hverandre, har stammene betydelig forskjellige doseresponser. Hvis det er aktuelt, beregn motstandsforhold (RRs) ved å dele LD50 av interessestammen med LD50 av referanse/kontrollstammen. Figur 1: Aktuell protokolldiagram for applikasjonsanalyse. Aktuell applikasjonsanalyseprotokoll begynner med (A) sorteringsprøver på is, etterfulgt av (B) veieprøver på analytisk skala, (C) doseringsprøver med insektmiddeloppløsning(er) og (D) 24 timers ventetid etter insektmiddeleksponering med tilgang til 10% sukroseløsning ad libitum (via en gjennomvåt bomullskule), etterfulgt av dødelighetsvurdering. Røde piler indikerer mål insektmiddel søknadssted for mygg (venstre) og fruktfluer (høyre). Vær oppmerksom på at bildet ikke skaleres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Disse representative resultatene har to forskjellige stammer av Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), og en isolert feltstamme fra Florida med kjente knockdown-resistensmutasjoner F1534C og V1016I (IICC genotype). I tillegg er Drosophila melanogaster (Canton: S-stamme) omtalt. Figur 2 og figur 3 illustrerer doseresponsen til hver organisme ved belastning og kjønnstestet etter protokollen ovenfor. Siden det ikke ble observert forskjeller mellom doseresponskurvene til mannlige og kvinnelige mygg i hver stamme (t = 1,70, p = 0,098 for ROCK og t = 0,64, p = 0,527 for IICC), ble data fra begge kjønn innenfor hver myggstamme samlet. Den masse-relativiserte LD50 for ROCK og IICC er henholdsvis 0,008 ng/mg (95 % KI: 0-0,104) og 0,336 ng/mg (95 % KI: 0,235-0,438). De 95% CIene av disse verdiene overlapper ikke, noe som indikerer signifikant forskjellige doseresponser av stammene. RR for IICC-stammen (i forhold til ROCK-stammen) er 41,7, som ifølge WHO regnes som svært motstandsdyktig5. For Canton-S fruktfluer er den masse-relativiserte LD50 0,213 ng/mg (95% KI: 0-0,490). Figur 2: Representative data om mygg ved hjelp av aktuell anvendelse bioassay. Representative doseresponsdata fra aktuell applikasjonsbioassay etter ovennevnte protokoll ved hjelp av deltametrin og mygg: (A) kvinnelige Ae. aegypti ROCK (n = 880) og IICC (n = 550) stammer, (B) mannlige Ae. aegypti ROCK (n = 880) og IICC (n = 569) stammer. Deltametrintestkonsentrasjonene varierte fra 0,00075 ng/μL til 9,68705 ng/μL, og dosen av deltametrin påført (ng) per gjennomsnittlig myggmasse (mg) reflekteres på x-aksen. Dødelighet vises som en andel på y-aksen. Den svarte linjen gjennom hver datapunktklynge representerer belastningen og kjønnsspesifikk lineær regresjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Representative data om fruktfluer ved hjelp av aktuell anvendelsesbioassay. Representative doseresponsdata fra aktuell applikasjonsbioassay etter protokollen ovenfor ved hjelp av deltametrin og fruktfluer: D. melanogaster Canton-S-stamme (n = 1014). Deltametrintestkonsentrasjonene varierte fra 0,00499 til 5,02876 ng/μL, og dosen av deltametrin påført (ng) per gjennomsnittlig fruktfluemasse (mg) reflekteres på x-aksen. Dødelighet vises som en andel på y-aksen. Den svarte linjen representerer den lineære regresjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Supplerende figur S1: Benkeplate insekthåndteringstelt. Benkeplate insekthåndteringstelt brukes til enklere fangst av å unnslippe mygg eller fluer under den aktuelle applikasjonsanalysen. Strukturen er lukket i A og åpen i B. Denne strukturen ble bygget med PVC-rør og finmasket stoff. Klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende figur S2: Sprøyte- og repeaterapplikatorenhet. Sprøyte- og repeaterapplikatorenhet som brukes til dosering av insekter. Hoveddelene inkluderer 1) kanyle, 2) sprøytefat, 3) stempel, 4) repeater og 5) repeaterknapp. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 1: Randomiseringsskript: Randomiseringsskript for å lage ikke-partiske etiketter for alle kopper av hvert eksperiment. Klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende fil 2: Dødelighetsresultatark: Dødelighetsskår for å hjelpe dødelighetsvurdering. Sheet inkluderer også steder å registrere all annen viktig informasjon som skal registreres, som referert i protokollen, for eksempel start- og sluttidspunkt for insektmiddelapplikasjonen. Klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende fil 3: Eksempel på dødelighetsdata: Eksempeldatafil som brukes til å opprette figur 2. Kolonneoverskriftsbeskrivelsene er som følger: “id” = identifikasjonskode for hvert datapunkt. “arter” = artsnavn (f.eks. Aedes aegypti); “insektmiddel” = navn på insektmiddel topisk påført (f.eks. Deltametrin); “stamme” = myggstammenavn (f.eks. “date” = startdato aktuell søknad; “sex” = myggens kjønn; “alder” = mygg alder (ung = 3-5-dagers gammel; gammel = 4 uker gammel); “total.mosq” = totalt antall mygg veid i batch; “vekt” = vekt (mg) av alle mygg i batch; “konsentrasjon” = konsentrasjon av insektmiddel (μg / ml); “sprøyte” = dråpevolum (ml) sprøyte; “dose” = mengde insektmiddel aktiv ingrediens påført hver mygg (ng); “totalt” = antall mygg i hver kopp; “død” = antall døde mygg i hver kopp. Klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende fil 4: R analysekode: Eksempel på R-kode som kan brukes til å fullføre probitanalysen (som beskrevet i trinn 8 i protokollen). De representative resultatene (tilgjengelig via den supplerende eksempeldatafilen) kan brukes med denne R-koden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Dette papiret presenterer en tilpasset protokoll for den aktuelle applikasjonsanalysen for mygg og fruktfluer. Denne prosedyren kan enkelt tilpasses for å brukes i feltet og med andre organismer, da det krever minimalt med spesialisert utstyr. Nedenfor finner du denne protokollens kritiske trinn, potensielle endringer, feilsøkingsråd, begrensninger for metoden og betydningen av denne metoden.

Kritiske trinn i protokollen: Det er tre kritiske trinn i protokollen som, hvis de fullføres feil, kan drastisk påvirke resultatene av bioassay: insektmiddelkonsentrasjonsnøyaktighet, prøve knockdown og dødelighetsvurdering.

Insektmiddel konsentrasjon nøyaktighet:
Det er ekstremt viktig å ha nøyaktige insektmiddelløsninger for å oppnå replikerbare doseresponskurver og meningsfulle resultater. Den volumetriske tilnærmingen til insektmiddelløsningspreparat er mer vanlig i litteraturen for både CDC-flaskebioassay⁷ og aktuelle applikasjoner 13,14,43. Imidlertid er den gravimetriske tilnærmingen beskrevet her iboende mer nøyaktig på grunn av hensynet til temperatur gjennom inkludering av (temperaturspesifikk) tetthet, noe som fører til mer nøyaktig formuleringsforberedelse.

Prøve knockdown:
Å slå ned prøvene er en kritisk komponent i denne metoden og muliggjør nøyaktig administrering av insektmiddel- og vektmålingene. Men å slå ned organismer inneholder uunngåelig risikoen for fysisk stress og skade, som tidligere vist³⁰. Vær derfor forsiktig og oppmerksom når du slår ned prøvene for å sikre i) hver prøve blir slått ned i en lignende varighet, ii) lengden på knockdown holdes på et minimum, og iii) metoden for knockdown holdes konsistent på tvers av alle prøver. I tillegg anbefales det å teste knockdown-metoden separat, før insektmiddelapplikasjon, for å sikre at metoden er vellykket og ikke induserer kontrolldødelighet større enn 10%. Den første testen kan ta lengre tid for en uerfaren bruker, noe som fører til lengre knockdown-tider. Vær derfor forsiktig når du tolker resultater fra de første analysene.

Dødelighet vurdering:
Vurdering av dødelighet kan være utfordrende, spesielt når insektmiddelet ikke helt dreper, men bare slår ned eller maims mygg eller fly. Derfor er det viktig å være klar over hvordan insektmiddelet påvirker målorganismen og har en klar definisjon for “døde” (eller nedslått) organismer før du starter. I tillegg anbefales det å la samme person vurdere dødelighet mellom doser og replikerer for å redusere variasjon.

Protokollendringer: Flere endringer beskrevet nedenfor kan brukes på denne protokollen for å forbedre allsidigheten og tilgjengeligheten.

Tilpasse analysen til mindre eller større insekter:
Ved bruk av mindre eller større prøver anbefales det å bruke et mindre eller større dosevolum av insektmiddel, henholdsvis. Som et eksempel tilpasset vi myggprotokollen til fruktfluer ved å redusere 0,5 μL-dosen til en 0,2 μL dose. Kontroller at riktig sprøytestørrelse er valgt for det valgte dosevolumet.

Tilpasning av analysen til feltinsekter:
Ved bruk av feltinsekter kan det være mer variasjon i insektstørrelse. Derfor vil veiing av insekter i mindre grupper (f.eks. per kopp) anbefales i stedet for som en stor gruppe (f.eks. alle insekter som brukes til ett eksperiment). Dette kan bidra til å fange den potensielle variasjonen i insektmiddel mottakelighet forbundet med forskjellene i felt insektmasse.

Modifikasjoner av utstyr:
Insekthåndteringstelt: Dosering av prøven kan fullføres under et insekthåndteringstelt som bare er konstruert med PVC-rør og myggnetting. Dette kan være et alternativ til et lukket rom (f.eks. insektmiddel) og bidra til å eliminere potensiell insektmiddelforurensning i områder der insektoppdrett kan forekomme. Dette insekthåndteringsteltet er enkelt å konstruere og rimelig (~ $ 70). Alternativt kan et insekthåndteringsbur kjøpes (~ $ 425).

Kjølebord: Ispakker eller isbrett kan brukes til å slå ned prøven og/eller holde prøven slått ned.

Inkubator: Inkubatorer anbefales for oppdrett av prøven og holder prøven i 24 timer etter insektmiddelbehandling. Hvis en inkubator ikke er tilgjengelig, kan den konstrueres. Utstyr som trengs for å bygge inkubatoren inkluderer en isolert beholder, luftfukter, varmekabler, fuktighets- og temperaturregulator og et lys, som skal legge opp til en total kostnad på ~ $ 170, følge og utvide på tidligere metoder⁴⁴.

Holde kopper: Selv om plastkopper brukes til å sortere og holde den behandlede prøven, vil voksforede papirkopper eller glassbeholdere være egnede alternativer.

Organisme og livsstadium modifikasjon:
Denne metoden er veldig tilpasningsdyktig for bruk med andre vektorer, insekter og / eller leddyr som Culex quinquefasciatus mygg³², husfluer³² og kakerlakker⁴⁵, samt ikke-voksne livsstadier, for eksempel mygg larver⁴⁶.

Endring av aktuell programplassering:
Denne metoden beskriver å bruke insektmiddelet på ventral thorax og mageregion for mygg (og dorsum for fruktfluer). Andre programplasseringer kan imidlertid brukes så lenge eksponeringsstedet er konsekvent. Konsistens er viktig fordi insektmiddelfølsomhet kan variere basert på applikasjonsplassering³².

Råd om feilsøking: Denne metoden har flere trinn som i utgangspunktet er utfordrende. Beskrevet nedenfor er noen av de vanligste problemene man kan støte på.

Lekker/fordamper insektmiddelløsninger:
Insekticider oppløses ofte i aceton, en svært flyktig forbindelse. Dette betyr at aceton fordampes raskt ved romtemperatur, og øker insektmiddelkonsentrasjonene over tid. Hvis insektmiddelløsningene ser ut til å lekke eller fordampe, kan du gjenskape løsningene, sikre at rørets lokk er på tett, og dobbeltsjekk at lagringsprotokollene følges riktig (f.eks. parafilm brukes, og rørene lagres oppreist). Hvis lekkasjen vedvarer, kan du prøve å fylle rørene med et lavere volum for å gi mer plass til volumendringen som acetonopplevelsene opplever ved forskjellige temperaturer. I tillegg, hvis du bruker aceton som løsningsmiddel, må du sørge for at rørene er vurdert for acetonlagring (f.eks. FEP-, TFE- og PFA-plast). Hvis du bruker hydrofobe insektmidler, lagre løsningene i glassflasker (da hydrofobe insektmidler holder seg til glass mindre enn plast). Det er også god praksis å markere menisken til løsningen før lagring for å overvåke fordampning.

Vektdrift på mikrovekt ved veiing av organismer:
Hvis vektavlesningen på vekten driver (sakte går opp eller ned), kan dette skyldes statisk. Drift oppstår oftest når du veier organismer i plastprodukter, da plast lett kan holde en statisk ladning. For å unngå dette kan et veiepapir plasseres under plastbeholderen som veies, eller en beholder uten plast som glass kan brukes.

Unormale dødelighetsresultater:
Det er mange måter dødelighetsresultatene kan virke unormale på, for eksempel å observere høy dødelighet i kontrollene eller høy / lav dødelighet gjennom alle insektmiddeldoser. Se gjennom følgende tilfeller for feilsøking av hvert scenario.

Høy kontrolldødelighet
Hvis det er høy dødelighet i kontrollgruppen (10% eller større), vurdere knockdown-metoden og tiden prøvene blir slått ned. Hvis det er mulig, forkort tiden som prøvene er slått ned for. Andre potensielle faktorer å vurdere for høy dødelighet i kontrollene inkluderer i) å sjekke om inkubatorinnstillingene er riktige – unormale temperaturer og / eller fuktighet kan føre til økt dødelighet. Temperatur og fuktighet bør kontrolleres med en uavhengig datalogger. ii) Vurdering av insekthåndtering. Håndtering av insekter for mye eller for grovt kan føre til høy dødelighet. iii) Kontrollere om det ikke er insektmiddelforurensning i 100% aceton som brukes til å behandle kontrollgruppen eller på instrumenteringen. Skift ut aceton og rengjør alle instrumenter med aceton eller etanol. Unngå kontaminering ved ofte å skifte ut hansker, forhindre søl og rengjøringsinstrumenter. Merk at i Supplemental File 3 døde maksimalt to mygg innenfor kontrollen (kun aceton) kopper. Dette nivået av dødelighet anses ikke som høyt (det er mindre enn 10%), og derfor var det ingen grunn til bekymring.

Høy dødelighet i alle eksponerte grupper (men ikke i kontrollgrupper)
Bruk lavere insektmiddelkonsentrasjoner eller mindre dosevolumer for testing. Dosene som brukes kan være over minimumsdosen som ikke vil indusere dødelighet. Bruk flere 10 ganger fortynning for å identifisere riktig doseområde, og utelukke forurensning. For å unngå forurensning, begynn å dosere med lavest konsentrasjon og arbeid mot den høyeste konsentrasjonen. I tillegg må du sørge for at alt utstyr som brukes regelmessig rengjøres med aceton og/eller etanol, dosene som påføres prøven er svært små, og selv den minste krysskontaminering kan påvirke resultatene.

Lav dødelighet i alle utsatte grupper
Bruk høyere insektmiddelkonsentrasjoner. Dosene som brukes kan alle være for lave til å forårsake dødelighet i befolkningen. For å identifisere riktig doseområde, eksponer prøver for flere mer 10 ganger konsentrerte doser. Forsikre deg om at insektmiddelløsningene ikke har utløpt eller degradert (potensielt på grunn av høy temperatur eller lyseksponering). Hvis løsningene er utløpt eller mistenkes for å ha blitt degradert, kan du gjenskape løsningene og sikre at riktige lagringsforhold følges.

Inkonsekvent dødelighet mellom replikeringer/dager
Tidspunktet på dagen når insekter blir utsatt for insektmiddelet, kan påvirke motstandsnivået uttrykt, spesielt for metabolsk motstand³⁴. Gjenta denne protokollen i samme tidsvindu hver dag for å unngå tid på dagen som en potensiell variabel som bidrar til endringer i dødeligheten. Andre potensielle faktorer som bidrar til inkonsekvent dødelighet mellom replikeringer inkluderer i) prøver som blir differensialt oppdratt mellom eksperimenter. Forsikre deg om at alle prøver er av samme aldersgruppe, oppdrettet ved samme temperatur og lignende tettheter og mattilgjengelighet. ii) insektmiddelkonsentrasjoner som forringes over tid eller blir mer konsentrert på grunn av acetonfordampning. Remake løsningene og sikre riktige lagringsforhold. iii) Inkonsekvent dødelighetsscoring. Sørg for at samme person scorer dødelighet eller utvikle en klar protokoll som skal brukes konsekvent på tvers av teamet. Bruk blind scoring for å redusere skjevheter i dødelighet scoring.

Insekter som stikker til overflaten av sorteringsbrettet:
Aceton reagerer på plast som brukes i denne protokollen, for eksempel Petri-retter. Prøven vil sannsynligvis holde seg til overflaten hvis du bruker aceton på Petri-retter eller lignende plastflater. Denne vedheften kan unngås ved å fôre sorteringsbrettet med veiepapir eller bruke en ikke-plastisk sorteringsbrett. I tillegg kan kondens på overflaten av plast i sorteringsbrettet eller holde kopper føre til insekter som holder seg til kondensen, eller prøven kan være for kald og potensielt fryse til overflaten. Juster knockdown-metoden for å redusere kondens samtidig som prøvene blir for kalde/frosne (plasser for eksempel veiepapir mellom prøvene og plastsorteringsbrettet).

R-analysefeil:
Når dødelighetsdataene er samlet inn, kan det oppstå en rekke komplikasjoner under analysen. Den vanligste grunnen til at en R-kode ikke kan fullføre handlingene for datafilen, er at dataformatet ikke samsvarer med koden (f.eks. kolonneoverskrifter og/eller tomme celler). Hvis det oppstår mer alvorlige komplikasjoner, kan du se R-hjelpesidene som er innebygd i Rstudio³⁵.

Begrensninger ved den ovenfor beskrevne aktuelle søknadsmetoden:
Insektmiddelabsorpsjon via aktuell applikasjonsmetode etterligner ikke naturlig eksponering:
Aktuell anvendelse på primærkroppen er ikke den naturlige måten å absorpsjon av insektmiddel på. I feltet absorberer insekter for det meste insektmidler gjennom bena over den tiden de er i kontakt med den insektmiddelbehandlede overflaten eller på vingene gjennom små aerosolpartikler ^47,48, i stedet for en rask eksponering på ventraloverflaten. Imidlertid vil den direkte anvendelsen av en kjent insektmiddeldose nøyaktig etablere en fenotypisk respons på insektmidler, som trengs for genetiske og evolusjonære studier eller sammenligninger av insektmiddelfølsomhet over rom eller tid. Derfor er denne tilnærmingen gunstig for å teste teknisk motstand, men vil ikke direkte måle praktisk motstand (effekten av det faktiske intervensjonsverktøyet i et feltsett¹⁵). Det er imidlertid viktig å merke seg at de nåværende standardmetodene (f.eks. WHO-rørtester og CDC-flaskebioassays) heller ikke kan fange eller etterligne aerosol (dvs. ved å dugge) insektmiddeleksponering i feltet.

Aktuelle applikasjonsanalyser kan bare vurdere kontaktabsorpsjonsinseksjonsmidler:
Denne metoden er beregnet på insektmidler som virker gjennom kontakt og absorpsjon av insektmiddelet og ikke for bruk med orale insektmidler, for eksempel borsyre som vanligvis brukes i attraktive giftige sukkeragn⁴⁹.

Betydningen av metoden:
Den aktuelle applikasjonsmetoden utvider veletablerte standarder for insektmiddelbioassays ved å beregne dødelig dose (ikke konsentrasjon) og måle teknisk (ikke praktisk) motstand¹⁵. Nedenfor er fordelene og ulempene ved denne metoden over eksisterende insektmiddel mottakelighetsanalyser.

Beregning av dødelig dose:
Denne metoden bestemmer den dødelige dosen av insektmiddelet, i stedet for den dødelige konsentrasjonen som CDC og WHO bioassays bruker for å etablere den diskriminerende dosen¹¹. Den dødelige dosen er mer meningsfylt fordi det er en kvantifisert mengde insektmiddel kjent for å fremkalle dødelighet. I motsetning til dette vurderer den dødelige konsentrasjonen ikke hvor mye insektmiddel organismen faktisk får. Ved bruk av dødelig doseberegning kan forskjeller mellom kjønns- eller størrelsesavhengige følsomhetsprofiler observeres og kvantifiseres mer nøyaktig, noe som gjør denne målingen enda mer allsidig.

Teknisk motstand:
Denne metoden vurderer teknisk motstand, som er motstand målt under standardiserte, kontrollerte miljøer. Slike målinger er egnet for overvåking av spredning av insektmiddelresistens og kobling av fenotypisk motstand med potensielle markører¹⁵. På grunn av den reduserte variasjonen i dødelighet som følge av den aktuelle anvendelsen bioassay, gir det bedre identifisering av nye motstandsmarkører. På grunn av unaturlig eksponering av insektmidler til mygg, er denne analysen imidlertid ikke egnet for estimering av effekt av en bestemt intervensjon i en bestemt befolkning. Andre analyser er nødvendig for målinger av slik praktisk motstand¹⁵.

Prøve tilpasningsevne:
Denne metoden kan praktiseres på andre viktige leddyr som avlinger (f.eks. Colorado potetbille), hus (f.eks. og sengebugger), eller pollinatorer (f.eks. bier) med enkle endringer i knockdown tilnærming og / eller insektmiddel dose, volum og / eller konsentrasjon (som beskrevet ovenfor). Den enkle tilpasningsevnen kan bidra til å analogisere insektmiddelresistensforskning på tvers av forskjellige forskningsfelt. Bruken av en LD_50-verdi i stedet for en dødelig konsentrasjon som dreper 50% av prøvene (LC₅₀) tillater nøyaktig sammenligning på tvers av arter.

Kostnad:
I likhet med CDC-flaskebioassays og WHO-rørtester, er kostnadene for å kjøre den aktuelle applikasjonsanalysen minimale (se materialtabellen). De viktigste utstyrsdelene er sprøyten (ca. $ 70) og dispenseren (ca. $ 100), som kan brukes på tvers av analyser.

Antall eksemplarer som trengs:
Minst 20-25 prøver bør brukes per aktuell applikasjonsanalysekopp. Minst fem insektmiddelkonsentrasjoner anbefales å testes per eksperiment, med minst tre repliker som anbefales for prosedyren. Totalt sett resulterer dette i minimum 300-375 prøver som trengs for en komplett test, sammenlignbar med antall prøver som trengs for å utføre motstandsintensitetstester ved hjelp av WHO-rørtester eller CDC-flaskebioassays. Men hvis redusert variasjon oppnås med den aktuelle anvendelsesbioassay, kan samme antall prøver føre til mer statistisk kraft for å sammenligne følsomhetsdata på tvers av rom eller tid.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	20A00L068	Acetone aliquot storage
1.5 mL screw cap tubes	Thomas Scientific	1182K23	Insecticide dilution storage
15 mL conical tubes	VWR	339651	Insecticide dilution storage
20 mL glass scintillation vials	Fisher Scientific	0334125D	Fruit fly weighing
25 μL syringe	Fisher Scientific	14815288	Topical applicator
Acetone	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99.6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC strain)	USDA CMAVE	NA	Insecticide resistant
Aedes aegypti (Rockefeller strain)	CDC	NA	Insecticide susceptible
Analytical scale	Fisher Scientific	14-557-409	Precision up to 0.1 mg
Aspirator	Amazon	6.49986E+11	Mosquito collection device
Bench paper	VWR	89126-794	Place under workspace
Cotton swabs	Amazon	B092S8JVQN	Use for sorting insects
Cotton wool balls	Amazon	B0769MKZWT	Use for sucrose solution
Dispenser	Fisher Scientific	1482225	Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (Canton-S strain)	University of Wisconsin-Madison	NA	Insecticide susceptible
Fine-tipped paint brushes	Amazon	B07KT2X1BK	Use for sorting insects
Fruit fly stock bottles	Fisher Scientific	AS355	Use for rearing and sorting fruit flies
Hand-held CO2 dispenser	Fisher Scientific	NC1710679	Use for knocking down insects
Holding cups	Amazon	B08DXG7V1S	Clear plastic
Ice pack	Amazon	B08QDWMMW5	Use for knocking down fruit flies
Ice trays	Amazon	9301085269	Use for knocking down insects
Insect forceps	Amazon	B07B4767WR	Insect forceps
Insecticide	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltamethrin
Labeling stickers	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Color dot stickers
Labeling tape	Amazon	B00X6A1GYK	White tape
Netting	Amazon	B07F2PHHWV	Use for covering holding cups and insect handling tent
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
PVC Pipe	Lowe’s	23971	Insect handling tent materials
Rubber bands	Amazon	B00006IBRU	Use for securing mesh/net on cups
Sucrose	Amazon	B01J78INO0	Granulated White Sugar
Weighing paper	VWR	12578-165	4" x 4"