Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63391
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Center for Evolution and Medicine, School of Life Sciences, Arizona State University, 2United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology

Summary

Vi beskriver metodiken och betydelsen av den aktuella appliceringen bioassay för att mäta insekticidkänslighet hos myggor och bananflugor. Den presenterade analysen är hög genomströmning, använder insektsmassa - vilket möjliggör beräkning av en massrelativiserad dödlig dos istället för koncentration - och har sannolikt lägre variabilitet än andra liknande metoder.

Abstract

Den fortsatta användningen av insektsmedel för folkhälsa och jordbruk har lett till utbredd resistens mot insektsmedel och hindrande av kontrollmetoder. Insekticidresistensövervakning av myggpopulationer görs vanligtvis genom Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flaskbioassays eller Världshälsoorganisationens (WHO) rörtester. Dessa metoder kan emellertid resultera i en hög grad av variation i dödlighetsdata på grund av variabel insekticidkontakt med insekten, det relativt lilla antalet testade organismer, omfattande variation i massa mellan populationer och ständigt föränderliga miljöförhållanden, vilket leder till varierande resultat. Detta dokument presenterar den aktuella applikationsbioassay, anpassad som en fenotypisk bioassay med hög genomströmning för både myggor och fruktflugor, för att testa ett stort antal insekter längs en rad insekticidkoncentrationer.

Denna analys 1) säkerställer konsekvent behandling och insekticidkontakt med varje organism, 2) producerar mycket specifika dos-responskurvor som tar hänsyn till skillnader i genomsnittlig massa mellan stammar och kön (vilket är särskilt viktigt för fältinsamlade organismer), och 3) möjliggör beräkning av statistiskt rigorösa median dödliga doser (LD50 ), som är nödvändiga för jämförelser av resistenskvoter – en alternativ övervakningsmetod från diagnostisk dosdödlighet, som också används för övervakning av larvicidresistens. Denna analys kommer att vara ett kompletterande verktyg för exakt fenotypning av myggpopulationer och, som illustreras med hjälp av fruktflugor, är lätt anpassningsbar för användning med andra insekter. Vi hävdar att denna analys kommer att bidra till att fylla klyftan mellan genotypisk och fenotypisk insekticidresistens hos flera insektsarter.

Introduction

Myggor är ansvariga för över 700 000 dödsfall varje år på grund av de sjukdomar de överför till människor, med över hälften av dessa dödsfall på grund av malariaensam 1. Den huvudsakliga förebyggande metoden mot överföring av malaria och andra vektorburna sjukdomar är användningen av insekticider, ofta i form av långvariga insekticidnät eller inomhusrestsprutning2. Insekticidresistens är emellertid utbredd bland myggor och andra insektsvektorer, liksom jordbruksskadedjur 3,4. För att effektivt hantera motstånd är övervakning av central betydelse5. För detta behövs mycket exakta och höggenomströmningsresistensdetekteringsmetoder. För närvarande är de mest utbredda övervakningsverktygen för insekticidresistens för myggor WHO: s rörtest6 och CDC-flaskans bioassay7. För fruktflugor är den återstående kontaktapplikationsmetoden (liknande CDC-flaskbioassay) en vanlig insekticidbioassay 8,9,10. Variationen i data från dessa metoder är emellertid vanligtvis hög, med mätningar av samma laboratoriemyggstam som sträcker sig från ~ 20-70% dödlighet i CDC-flaskanalyser och 0-50% i WHO-rörtester när de utsätts för subletala doser11. Sådan variation är förvånande eftersom den begränsade genetiska variationen i de flesta laboratoriestammar förväntas leda till begränsad variation i insekticidkänsligheten i befolkningen. Ändå finns det fortfarande en hög grad av variation observerad i bioassay-resultaten.

Potentiella källor till denna variation kan vara ett resultat av heterogen insekticidexponering mellan prover inom bioassay på grund av indirekt exponering för insektsmedel via ytan, heterogena miljöeffekter, normal biologisk variation mellan individer av samma genotyp och variation i massan av prover av samma population12 . En sällan använd metod med högre replikerbarhet är den aktuella applikationsbioassay. I denna analys appliceras insektsmedlet direkt på varje insekt13,14, vilket avlägsnar faktorn för heterogen exponering av olika prover inom samma analys. På grund av den långsamma genomströmningen av denna metod används den emellertid inte rutinmässigt som ett övervakningsverktyg för insekticidkänslighet för myggpopulationer. Detta dokument presenterar ett modifierat protokoll för den aktuella applikationsbioassay som möjliggör exponeringar med högre genomströmning samtidigt som den korrigerar för variation i insektsmassa, en parameter som korrelerar med förändringar i insekticidkänslighet12. En minskning av buller och massrelaterad variation i dödlighetsdata från variabel exponering för insektsmedel skulle möjliggöra mer exakt teknisk resistensövervakning11,15. Sådana data skulle kunna användas för att mer exakt associera fenotypisk resistens med genetiska markörer, konditionsparametrar och/eller vektorkompetens. Dessutom visar vi hur denna analys lätt kan anpassas till andra insektsarter genom att använda den aktuella applikationsbioassay på fruktflugor, en mindre insektsart.

Huvudbegränsningen för de ovannämnda återstående kontaktapplikationerna är att exponeringen för insektsmedel kan variera från prov till prov inom samma analys. När det gäller CDC-flaskbioassays och kontaktmetoden kan exponeringen för insektsmedel variera mellan replikat av samma analys. Insekterna utsätts för insektsmedel som antingen fördelas på insidan av en glasflaska (CDC-flaska bioassay och kontaktmetod) eller på impregnerade papper (WHO-rörtest). Koncentrationen av insektsmedel på båda ytorna (glas och papper) är känd och förutbestämd genom screening av olika arter av kända genotyper. Den mängd som är tillgänglig för att potentiellt absorberas av insekten kan emellertid variera kraftigt beroende på vilken yta som används, insekticidblandningens komponenter och hur homogent insektsmedlet fördelas över ytmaterialet16,17. I CDC-flaskans bioassay är insekticidbeläggningen på insidan av flaskan beroende av procedurer som används av varje laboratorium och användare. I WHO:s rörtest produceras de insekticidbehandlade papperen centralt och därmed troligen ganska homogena över laboratorier. I WHO:s rörtest tillåter exponeringsröret emellertid prover att landa och vila på icke-insekticidexponerat metallnät, vilket leder till potentiell heterogen exponering för insektsmedel bland proverna i varje test. Den faktiska mängden insektsmedel som plockas upp och absorberas av prover via varje metod behöver fortfarande undersökas ytterligare18.

Dessutom används CDC-flaskans bioassay, WHO-rörtest och kontaktmetod oftast som tröskelanalyser som testar endast en förutbestämd insekticidkoncentration. Detta tillvägagångssätt kan exakt detektera förekomsten av motstånd och är värdefullt för motståndsövervakning (särskilt när motståndet sprider sig). Tröskelanalyser kan dock inte kvantifiera styrkan hos resistensen, vilket kan vara mer prediktivt för effekten av interventionsverktyg. Om flera insekticidkoncentrationer används med dessa metoder kan de användas som intensitetsanalyser. Intensitetsanalyser för CDC-flaskbioassay och WHO-rörtestet har introducerats genom att testa 5x och 10x de förutbestämda diskriminerande doserna för att ta itu med detta gap i övervakning 6,19. Samtidigt som det ger större förmåga att skilja mellan resistenta populationer, ger 3-5 (förutbestämda) doser begränsad upplösning för att beräkna dödliga koncentrationer. Dessutom används myggor av olika storlekar i sådana analyser. Ändå är massan viktig att mäta eftersom större prover kan behöva en högre dos för att dödas eftersom den effektiva dosen per massenhet kommer att vara mycket lägre än för en mindre organism12. Att beräkna en massrelativiserad dödlig dos (mängd insektsmedel per insektsmassa) skulle vara ett mer användbart mått än den vanligare dödliga koncentrationen (t.ex. mängden insektsmedel per yta) eftersom den tar hänsyn till variationen av insektsmassa mellan kön, populationer och genotyper. Sådana data skulle bidra till att fylla klyftan mellan genotypisk och fenotypisk resistens inom laboratoriet och fältet och kan också ge ett enkelt sätt att beräkna den nödvändiga applikationskoncentrationen för att behandla en population av insekter med en känd genomsnittlig massa.

Användningen av massrelativiserade dödliga doser som dödar 50% av proverna (LD50) innehåller också flera andra fördelar. Bedömning av toxiciteten hos en specifik förening i mg/kg (= ng/mg) är standard inom human- och veterinärtoxikologi14, och LD50-värden finns på materialsäkerhetsdatablad. Dödliga doser möjliggör också direkt jämförelse av toxicitet mellan olika kemikalier mot en viss art eller samma kemikalie mot olika arter20, samt högkvalitativ utvärdering av nya insekticider och kemikalier13. Dessutom kan LD50 ge mer meningsfulla och exakta resistensförhållanden än de som härrör från diagnostiska dosdödlighetsresultat, vilket kan resultera i en överskattning av resistensnivån som finns i en population. Därför skulle denna analys vara lämplig för rutinmässiga övervakningsprogram genom att tillhandahålla mer rigorös resistensövervakning baserad på massrelaterade dödliga doser härledda från fler prover än vad som rekommenderas för andra bioassays21.

Den aktuella appliceringsmetoden har använts vid övervakning av insekticidkänslighet för myggor och flugor som ett alternativ till bioassaysen för standardkänslighet för insekticider när resistens redan är känd eller misstänkt22,23, samt för övervakning hos vissa skadegörare24 för att mer exakt bedöma resistensprofiler och insekticids inneboende toxicitet21 . I aktuella applikationsbioassays appliceras insektsmedlet på varje organism, vilket resulterar i minimal variation i exponering för insektsmedel. Detta dokument presenterar en något anpassad och förbättrad metod som gör det möjligt att applicera insekticidexponering på ett stort antal insekter på kort tid samtidigt som den kontrollerar insektsmassa22. Denna metod med högre genomströmning med goda replikerbarhetsnivåer kan vara ett användbart ytterligare verktyg för rutinmässig övervakning av insekticidkänslighet.

Protocol

OBS: Insekticider kan orsaka faror för människor, djur och miljö25. Försiktighet, utbildning och personlig skyddsutrustning rekommenderas starkt. Var noga med att följa materialsäkerhetsdatabladen för alla insekticider och lösningsmedel som används.

1. Bakre exemplar

  1. Bakre 3-5 dagar gamla vuxna myggor.
    OBS: Protokollet nedan återspeglar villkoren för Aedes aegypti uppfödning, nära i stället för FN: s livsmedels- och jordbruksorganisations riktlinjer26.
    1. Bakre myggor i alla livsstadier vid 27 ± 1 ° C och 75 ± 5% relativ luftfuktighet med 12:12 h ljus och mörk cykling.
    2. Kläck myggäggen genom att sänka ner dem i avjoniserat vatten och tillsätt jäst26, eller placera de nedsänkta äggen i en vakuumkammare i 30 minuter.
      OBS: Båda metoderna minskar syrehalten i vattnet och ökar kläckningen27.
    3. Mata de nykläckta larverna fiskmat (eller en motsvarande diet som mald kattkibble) i brickor och håll larvtätheten så lika som möjligt mellan brickorna eftersom larvtätheten påverkar utvecklingen12 (t.ex. 200-250 larver per bricka som innehåller totalt 1,5 liter vatten).
    4. Foder larverna varannan dag tills de når pupalstadiet (cirka 7-10 dagar), vilket ökar mängden mat efter behov.
      OBS: När de matas för lite kommer larvtillväxten att hämmas, och larverna kan äta varandra. När de matas för mycket kan larverna dö, vilket gör att vattnet blir fult.
    5. När puppor utvecklas, överför dem dagligen till en vattenskål i vuxna myggburar och ge 10% sackaroslösning ad libitum.
    6. Spela in den första dagen av vuxen uppkomst. Ta bort de återstående popparna från buret 2 dagar efter uppkomsten börjar.
      OBS: Manliga myggor dyker upp snabbare. Observera uppkomsten av män och kvinnor separat och se till att tillräckligt med män och kvinnor är tillgängliga för varje test.
    7. Vänta i 3 dagar efter att du har tagit bort popparna för att uppnå 3-5 dagar gamla myggor för testning.
  2. Bakre fruktflugor (löst enligt protokoll från universitetet i Zürich28).
    1. Bakre Drosophila stammar i lagerflaskor vid 23 ± 1 ° C och 60 ± 5% relativ luftfuktighet med 12:12 h ljus och mörk cykling.
      OBS: Drosophila lagerflaskor bör innehålla 75 ml av ett vanligt flugmedium, som först hälls som en vätska i botten av flaskorna och sedan får stelna över natten.
    2. Överför kolonier till nya lagerflaskor med färsk mat varannan vecka för att förhindra överbefolkning och mögeltillväxt. För att göra detta, slå ner flugor med en handhållen koldioxid (CO2) dispenser, överför de bedövade flugorna till ett vägpapper på ett ispaket eller kylbord och borsta flugorna i en ny lagerflaska med en finspetsad pensel. Var noga med att hålla flaskorna på sina sidor under denna process för att förhindra att flugor faller i maten och drunknar.

2. Förbered insekticidformuleringar med hjälp av det gravimetriska tillvägagångssättet

  1. Gör den första stamlösningen enligt den gravimetriska metoden med hjälp av en analytisk skala med 0,1 mg noggrannhet inuti en draghuv.
    OBS: Den gravimetriska metoden använder massa för att mäta mängden insekticid och lösningsmedel som tillsätts. Standardpraxis (volymetrisk metod) kommer att kräva en analytisk skala för att mäta mängden (fast) insektsmedel som tillsätts när den första stamlösningen bereds. Mängden tillsatt lösningsmedel och alla följande spädningar mäts dock endast i volymprocent. Den gravimetriska metoden har en högre noggrannhet och är därför att föredra.
    1. Bestäm målkoncentrationen av insektsmedel och målvolymen (högst 10 ml rekommenderas om du använder 15 ml koniska rör för att förhindra spill vid förvaring i en frys) för den första stamlösningen och beräkna hur mycket insekticid aktiv ingrediens (AI) som ska tillsättas med Eq (1):
       Equation 1 (1)
    2. Förbered ett lagringsrör (15 ml koniskt rör rekommenderas för större volymer, 1,5 ml mikrocentrifugskruvlockrör som rekommenderas för volymer på 1 ml eller mindre) och märk med insekticid och lösningsmedelsnamn, målkoncentration och beredningsdatum. Placera röret och locket på vågen i ett rack eller hållare och stansa vågen.
    3. Väg önskad mängd fast eller flytande insekticid AI bestämd från steg 2.1.1. (t.ex. deltametrin som används för representativa data) i röret och registrera massan.
    4. Tara skalan och tillsätt önskad volym lösningsmedel (motsvarande målvolymen) till röret, stäng locket omedelbart och registrera massan. Stäng rörets lock omedelbart efter tillsats av lösningsmedlet (aceton som används här) för att undvika avdunstning och blanda lösningen.
    5. Registrera rumstemperaturen. Vissa lösningsmedel, såsom aceton, kan ha signifikanta volymförändringar (och därmed densitet) beroende på temperatur.
    6. Om du förvarar omedelbart, linda in rörets lock i parafilm (för att minska avdunstningen), placera det i ett rörställ / hållare (för att hålla sig upprätt och förhindra läckage), täck i folie (för att förhindra UV-exponering), placera det i en återförslutningsbar plastpåse (för att minska avdunstningen) och placera påsen i en -20 ° C frys. Om det inte förvaras omedelbart, se till att locket är säkrat och täck i folie eller en ljusskyddad behållare.
    7. Beräkna stamlösningens faktiska koncentration (mg/ml) genom att dividera massan av insekticid AI tillsatt med volymen tillsatt lösningsmedel (och volymen insektsmedel som tillsätts om det är i flytande form). För att beräkna volymen av tillsatt lösningsmedel (eller flytande insekticid), dela massan tillsatt med den kända densiteten som är lämplig för den registrerade temperaturen.
    8. Beräkna stamlösningens densitet (g/ml) genom att dividera den totala tillsatta massan (insektsmedel och lösningsmedel) med den totala tillsatta volymen (lösningsmedel och insektsmedel, om den är i flytande form). Se steg 2.1.7 för omvandling av flytande massa till volym.
  2. Späd den ursprungliga stamlösningen seriellt via 10% utspädningar. Använd vid behov dessa seriella utspädningar för att skapa en initial dos-responskurva för att identifiera målintervallet för insekticidkoncentrationer för bioassay.
    1. Beräkna volymen av insekticidsallösningen och lösningsmedlet som ska tillsättas till varje rör (t.ex. 1 ml insekticidsallösning utspädd i 9 ml lösningsmedel för en 10 ml utspädning av 10% av den tidigare koncentrationen).
    2. Vortex stamlösningen i 10 s. Tara ett förmärkt första utspädningsrör på skalan. Tillsätt den önskade volymen stamlösning till det första utspädningsröret med en pipett. Stäng omedelbart locket på båda rören och registrera massan i det första utspädningsröret.
    3. Tara det första utspädningsröret igen och tillsätt den önskade volymen lösningsmedel. Stäng locket omedelbart, registrera massan av det tillsatta lösningsmedlet och virvla den första utspädningen i 10 s.
    4. Upprepa steg 2.2.2 och 2.2.3 för de återstående utspädningarna.
    5. Förvara alla spädningar enligt beskrivningen ovan i steg 2.1.6.
    6. Beräkna de faktiska koncentrationerna av utspädningarna genom att följa steg 2.1.7.
    7. Beräkna densiteten för varje insekticidutspädning genom att dividera den totala tillsatta massan (insekticidlösning och lösningsmedel) med den totala tillsatta volymen (insekticidlösning och lösningsmedel). För varje seriell utspädning, använd den tidigare insekticidbeståndets utspädningstäthet för att beräkna den nya utspädningens densitet enligt Eq (2):
      Equation 2 (2)
  3. Valfritt: Skapa insekticidutspädningar med mindre steg genom seriell utspädning.
    1. Välj koncentrationer och volymer för varje ny lösning som ska göras med hjälp av en dos-responskurva för de initiala seriella utspädningarna, tidigare studier eller publicerad litteratur.
      OBS: Valda koncentrationer bör resultera i ett mortalitetsintervall på 0-100%, med minst tre koncentrationer från detta intervall för att möjliggöra Probit-analys.
    2. Använd de seriella utspädningarna som stamlösningar för att göra varje ny utspädning och följ steg 2.2 för att skapa de nya utspädningarna mellan de 10-faldiga utspädningarna.
  4. Valfritt: Alicitera insekticidlösningen. Om större volymer av insekticidlösningarna tillverkas, alicitera lösningarna i 1,5 ml skruvlocksrör för att undvika kontaminering, avdunstning och nedbrytning av stamlösningarna från frekvent hantering och exponering för ljus.
    1. Alicitera lösningarna, med utgångspunkt från den lägsta koncentrationen och arbeta mot den högsta koncentrationen för att minska potentiell kontaminering. Blanda varje stamlösning genom att virvla i 10 s innan du öppnar och pipetterar önskad volym (t.ex. 0,5 ml) i ett förmärkt skruvlocksrör.
    2. Förvara alikvoterna i en ljusbeständig behållare i en frys på -20 °C.
      OBS: Det rekommenderas att regelbundet (månadsvis) ersätta alikvoter med små nya alikvoter som tas direkt från beståndets bekämpningsmedelsutspädningar. Detta kommer att begränsa risken för kontaminering att överföras till andra experiment eller förändringar på grund av avdunstning eller UV-nedbrytning medan proverna används på bänken. Protokollet kan pausas här och startas om även år senare, så länge insektsmedelslösningarna lagras ordentligt (se steg 2.1.6) och förvaras i frysen -20 °C.
  5. Använd en permanent markörpenna för att markera menisken innan du förvarar för att övervaka lösningsmedelsindunstning. När du tar bort insekticidlösning för att göra alikvoter, markera menisken varje gång lösningen avlägsnas.

3. Förbered arbetsyta för aktuell applikationsbioanalys

OBS: Det rekommenderas att arbeta i ett insektshanteringstält på bänken för att lättare fånga flyende myggor eller flugor. Se tilläggsfigur S1 för bilder av ett insektshanteringstält.

  1. Ta bort de nödvändiga insekticidlösningarna från frysen, virveln omedelbart och placera dem i en ljusbeständig behållare vid rumstemperatur för att låta insekticiderna värmas till rumstemperatur innan de används.
    OBS: Insekticid AI kan separeras från lösningsmedlet vid svalare temperaturer. Dessutom förändras acetonvolymen med temperaturen, vilket kan förändra den applicerade insekticiddosen. Att blanda lösningarna och låta dem värmas till rumstemperatur hjälper till att säkerställa konsistens vid användning av insekticidlösningarna.
  2. Ange alla nödvändiga verktyg och material för den aktuella appliceringsanalysen i insektshanteringstältet som det hänvisas till i materialförteckningen.
  3. Rengör sprutpipan och nålen med aceton av analytisk kvalitet genom att fylla i 5 tvättar per acetonalitquot. Fyll i detta med 5 separata alikvoter för totalt 25 tvättar. Se tilläggsfigur S2 för sprut- och repeaterpipeterdelar.
    1. Ställ ut 5 mikrocentrifugrör med 0,5 ml aceton vardera.
    2. Fyll sprutfatet med 0,025 ml aceton från det första röret och utvisa sedan acetonen i en avfallsbehållare genom att snabbt trycka ner kolven. Upprepa ytterligare fyra gånger för att slutföra totalt fem acetontvättar från samma acetonalitquot. Fyll sedan sprutfatet helt med luft och utvisa luften och potentiella acetonrester i avfallsbehållaren. Upprepa ytterligare två gånger för att slutföra tre "tvättar" med luft.
    3. Upprepa steg 3.3.2 för de återstående 4 rören aceton.
    4. Skapa en luftficka i pipan mellan sprutkolven och toppen av nålen genom att dra upp kolven något i pipan (~ 5 mm).
      OBS: Denna luftficka skyddar kolven från att kontakta insektsmedelslösningarna och minskar insekticidöverföringen.
    5. Ställ sprutan åt sidan tills den är klar att användas för topisk applicering.
  4. Skapa en nyckel som innehåller de doser som ska tillämpas och tilldela slumpmässiga ID:er efter slumptal eller bokstavsgeneratorer (se Tilläggsfil 1).
  5. Märk plasthållkopparna med slumpmässigt ID för blind dödlighetsbedömning.
    OBS: Om det behövs kan protokollet pausas här och startas om senare dag och tid. Om mer än några timmar går under pausen uppmanas det att upprepa steg 3.3 för att säkerställa att sprutan är ren och att placera insektsmedelslösningarna tillbaka i frysen tills ungefär en timme före dosering av insekterna och sedan upprepa steg 3.1.

4. Förbered prover för den aktuella bioassayen. Se figur 1 för en proceduröversikt

  1. Sortera och väga myggorna
    1. Använd en aspirator som drivs av sug från inandning, aspirera det önskade antalet 3-5 dagar gamla vuxna myggor som behövs för analysen, inklusive ett överskott för att ta hänsyn till skadade individer. Överför myggorna till ett koniskt rör (upp till 100 myggor per rör) genom att placera andningsspetsen i röret med bomull lindad runt spetsen och försiktigt andas ut och knacka på andningsskyddet. Använd bomullen för att plugga röret när andningsspetsen tas bort och täck sedan med locket. Undvik att fylla aspiratorn och rören med för många myggor på en gång, eftersom detta lägger till ytterligare stress på myggorna och kan orsaka dödsfall.
    2. Slå ner myggorna i rören en kort stund genom att placera dem i minst 10 minuter vid 4 °C eller begrava dem under is i en isbricka.
      OBS: Myggor kan hållas vid 2 ° C i flera timmar med minimal dödlighet29; Det är dock bäst att minimera den tid under vilken myggorna är på is för att minska potentiella negativa effekter.
    3. Överför de nedslagna myggorna till insektshanteringstältet och tippa försiktigt myggorna ut på en plastbricka (t.ex. petriskål) som placerats på isen. Häll bara cirka 50 myggor åt gången för att säkerställa att var och en rör vid den svala brickan under den och förblir nedslagen.
    4. Sortera myggorna efter kön genom att försiktigt plocka upp dem vid benet (eller vingarna) med pincett och placera varje kön i en separat hållkopp. Räkna antalet myggor av varje kön medan du sorterar och sluta när önskat antal uppnås. När du sorterar, ta bort alla myggor som är skadade (t.ex. saknade ben) eller är extra stora (t.ex. onormalt förstorad buk) eller små (lätt att skilja med blotta ögat som mindre än den genomsnittliga myggstorleken för den befolkningen).
      OBS: Hantering av myggorna genom bilagorna minskar strukturella skador på deras mjuka primära kroppar (t.ex. buken).
    5. Registrera vikten av varje kopp myggor med en analytisk skala med 0,1 mg precision.
      1. Lägg en tom kopp med en petriskål som lock på vågen och tara vågen. Häll myggorna i behållaren, placera locket ovanpå och placera behållaren på skalan.
      2. Anteckna den sammanlagda vikten och antalet exemplar på notbladet (se kompletterande fil 2). Placera omedelbart koppen med exemplar tillbaka på is för att hålla dem immobiliserade.
      3. Upprepa steg 4.1.5.1–4.1.5.2 tills alla koppar provexemplar vägs.
    6. Dela de beredda myggorna i grupper om 20-25 i separata koppar placerade på is märkta med slumpmässiga ID: er. Vid överföring av myggor, sträva efter att minska stress och fysisk skada orsakad av pincetten. Plocka helst upp myggorna med tång endast 1-2 gånger: en gång för sortering / vägning och en potentiell andra gång för överföring till experimentkopparna.
      OBS: Ett idealiskt antal myggor per kopp är 20-25, vilket är tillräckligt för en replikat, är rimligt för att bedöma dödligheten och bör inte resultera i densitetsinducerad stress / död i koppen.
  2. Sortera och väga bananflugorna
    1. Bedöva flugorna med CO2 i 7 s.
      OBS: Om flugor utsätts för CO2 i mer än 7 s kan de ha problem med att krypa och flyga när de vaknar30.
    2. Häll flugorna på ett ispaket inslaget i bänkpapper och använd en finspetsad pensel för att separera och räkna män och kvinnor.
    3. Använd penseln för att försiktigt plocka upp de valda flugorna och placera dem i en ren, tom lagerflaska. Välj lika många manliga och kvinnliga bananflugor (t.ex. 15 hanar och 15 honor) och märk buljongflaskorna med stamnamnet och bananflugans totala (t.ex. Canton-S, 30 flugor).
      OBS: Det är viktigt att ha lika många kvinnliga och manliga fruktflugor eftersom manliga fruktflugor kan uppleva ökad aggression mot varandra efter att ha tagits bort från närvaron av honor31. För att undvika dödlighet eller skador som inte är insektsmedel är det därför bäst att ha lika många män och kvinnor (eller utelämna manliga fruktflugor helt).
    4. Registrera vikten på varje flaska fruktflugor med hjälp av en analytisk skala.
      1. Placera en tom injektionsflaska (märkt med ett slumpmässigt ID, se steg 3.4) med en petriskål som lock på skalan och tara skalan.
        OBS: Glasflaskor rekommenderas för användning med fruktflugor eftersom de avsevärt minskar det statiska.
      2. Bedöva flaskan med bananflugor som motsvarar flaskans slumpmässiga ID med CO2 i 7 s.
      3. Häll bananflugorna på vägpapper och använd papperet som en tratt för att införa flugorna i flaskan. Lägg petriskålslocket ovanpå flaskan med bananflugor och lägg det på vågen.
      4. Registrera den sammanlagda vikten och antalet exemplar på poängbladet och placera sedan omedelbart flaskan med fruktflugor i en isbricka, med locket fortfarande ovanpå för att förhindra att flugorna flyr.
      5. Upprepa steg 4.2.4.1–4.2.4.4 för varje flaska bananflugor.
  3. När ovanstående steg är klara går du omedelbart vidare till nästa avsnitt.

5. Dosprover

  1. Ladda sprutan med rätt insekticidkoncentration. Börja med den minst koncentrerade dosen och arbeta mot den mest koncentrerade dosen med varje grupp av organismer. För att förhindra avfall, ladda endast sprutan med den nödvändiga volymen insektsmedel plus en rekommenderad extra 2 μL.
  2. Tippa proverna på vägningspapper som placeras ovanpå en bricka på isen. Separera proverna som ligger nära varandra med en ren, insekticidfri pensel eller bomullspinne för att ge enkel åtkomst till varje prov för dosering. För myggor, använd penseln också för att säkerställa att varje prov ligger på sin dorsum och deras ventrala yta är vänd uppåt.
  3. Använd sprutan och applicera en droppe insekticidlösning (eller aceton för kontrollen) på ventral bröstkorg och bukområde för myggor och dorsum för fruktflugor. Applicera en 0,2 μL droppe (som kräver en 10 μL spruta) för mindre insekter som fruktflugor och en 0,5 μL droppe (som kräver en 25 μL spruta) för myggor.
    OBS: Insekticidkänslighet skiljer sig inte signifikant mellan primära kroppsdelar (såsom huvud, bröstkorg och buk) jämfört med bilagor (såsom vingar, ben eller proboscis)32. Därför behöver applikationsstället inte vara exakt så länge dosdroppen appliceras på primärkroppen. Den ventrala bröstkorgen och bukområdet väljs för myggor eftersom de ofta ligger på sin dorsala sida när de slås ner, medan dorsum väljs för fruktflugor eftersom de ofta ligger på sin ventrala sida när de slås ner. Den här minskade specificiteten för programplatsen hjälper till att öka dataflödet för den här metoden.
  4. Häll omedelbart proverna tillbaka i den märkta plastkoppen och täck koppen med nät och ett gummiband. Placera koppen i en hållbricka och notera på koppen eventuella exemplar som dödades, skadades eller flydde i denna process (för att utesluta dem i den slutliga räkningen av exemplar i den koppen). För den första koppen, registrera tiden då dosningen är klar.
  5. Byt ut det eller de vägningspapper på vilka proverna placeras för att undvika kontaminering av insektsmedel mellan doserna.
  6. Upprepa dosningen för varje kopp tills alla prover har doserats med rätt insekticidkoncentrationer och registrera sluttiden när alla prover har doserats.
  7. Ge 10% sackaroslösning till varje kopp via en blöt bomullstuss och lägg kopparna åt sidan tills dödligheten bedöms följande dag. Förvara myggorna vid 27 ± 1 °C med 75 ± 5 % relativ luftfuktighet5 och banan flyger vid 23 ± 1 °C med 60 ± 5 % relativ luftfuktighet.
    OBS: Var försiktig när du klämmer på bomullstussarna för att undvika övermättnad eller undermättnad. Bomullstussarna ska vara fuktiga men inte droppande. Droppande sockervatten i koppen kan leda till dödlighet hos proverna och därmed påverka dödlighetsbedömningen av insektsmedlet.

6. Bedöm dödligheten

  1. Registrera provdödlighet vid 24 timmar efter starten av exponering för insektsmedel. Klassificera myggor som levande om de kan flyga och hålla sig upprätt; som döda om de är orörliga eller ataxiska (oförmögna att stå eller lyfta för flygning), enligt beskrivningen i WHO6. Följ samma dödlighetsbedömning för bananflugor 8,33.
    OBS: För att bedöma fördröjd dödlighet kan dödligheten dessutom bedömas efter 48 och 72 timmar med dagliga sockervattenförändringar.
  2. När dödligheten har registrerats, placera alla koppar med prover i en innesluten påse i en frys i minst 1 timme för att säkerställa att alla prover är döda före bortskaffande eller efterföljande användning (t.ex. molekylär eller kemisk analys).

7. Utför repliker

  1. Upprepa steg 3-6 på en ny uppsättning prover, var noga med att utföra replikat vid samma tidpunkt varje dag, eftersom insekticidkänsligheten kan förändras beroende på tid på dag34.
  2. Säkerställ minst 3 replikat för varje koncentration för noggrann uppskattning av den dödliga dos som dödar 50 % av proverna (LD50). Inkludera fler repliker om en hög variabilitetsnivå observeras.
  3. Slutför analysen när alla data har samlats in.

8. Analysera resultaten

  1. Spela in data i ett kalkylarksprogram och använd den slumpmässiga ID-tangenten för att avslöja data (referenssteg 3.4). Spara data som en textfil (se exempeldata i tilläggsfil 3) för analys i statistikprogrammet R35 (se exempel R-kod i tilläggsfil 4) eller annan programvara av val36.
  2. Inom programmet slutför du följande analys. Se Kompletterande fil 4 för ett exempel på R-kod.
    1. Beräkna dosen insekticid (ng) per provmassa (mg) enligt Eq (3) nedan:
      Equation 3 (3)
    2. Beräkna dödligheten och tillämpa Abbotts formel37 för att korrigera dödligheten i förhållande till den dödlighet som observerats i varje kontroll37. Alternativt kan du använda Schneider-Orelli (1947) formel för att korrigera dödligheten38. Med endera formeln, tillämpa korrigeringen på alla data oavsett dödlighet i varje kontroll, som tidigare beskrivits37 ochimplementerats 39, såvida inte kontrolldata är ovanligt höga (se diskussion nedan).
      OBS: Abbotts formel och motsvarande alternativ, såsom Schneider-Orelli-formeln, justerar mortalitetsvärdena proportionellt till den grad av dödlighet som inte observerats i kontrollerna och kommer inte att orsaka en minskning av dödligheten för koppar som hade 100% dödlighet. Mer information finns i de citerade referenserna för dessa formler.
    3. Omvandla korrigerade mortalitetsdata till probitvärden (sannolikhetsenhet)40 och utför linjär regression mellan insekticiddosen och transformerade mortalitetsdata. Använd ett chi-kvadrattest för att bedöma passformen hos den linjära modellen/de linjära modellerna.
      OBS: Mortalitetsvärden på 0 (0% dödlighet) eller 1 (100% dödlighet) tas bort från data innan probittransformationen har slutförts. Detta är nödvändigt på grund av arten av probittransformationen. Som sådan kommer de graferade uppgifterna inte att innehålla positiva eller negativa kontroller eller andra data som resulterade i 0% eller 100% dödlighet (efter att Abbotts korrigering har tillämpats).
    4. Beräkna LD50 och 95% konfidensintervall (CI) per provstam, population och / eller kön enligt tidigare publicerade metoder 39,41,42.
    5. OBS: Om 95% CI av två stammar inte överlappar varandra, har stammarna signifikant olika dossvar.
    6. Beräkna i tillämpliga fall motståndskvoter (RR) genom att dividera LD50 av den intressanta stammen med LD50 för referens-/kontrollstammen.

Figure 1
Bild 1: Protokolldiagram för aktuell applikationsanalys. Aktuellt applikationsanalysprotokoll börjar med (A) sortering av prover på is, följt av (B) vägning av prover i analytisk skala, (C) dosering av prover med insekticidlösning (er) och (D) 24 timmars väntetid efter exponering för insektsmedel med tillgång till 10% sackaroslösning ad libitum (via en blöt bomullstuss), följt av dödlighetsbedömning. Röda pilar indikerar målinsekticidapplikationsplats för myggor (vänster) och fruktflugor (höger). Observera att bilden inte ska skalas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

Dessa representativa resultat har två olika stammar av Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) och en isolerad fältstam från Florida med kända knockdown-resistensmutationer F1534C och V1016I (IICC-genotyp). Dessutom presenteras Drosophila melanogaster (Kanton: S-stam).

Figur 2 och figur 3 illustrerar dosresponsen för varje organism per stam och kön som testats enligt ovanstående protokoll. Eftersom inga skillnader observerades mellan dos-responskurvorna för manliga och kvinnliga myggor inom varje stam (t = 1,70, p = 0,098 för ROCK och t = 0,64, p = 0,527 för IICC) samlades data från båda könen inom varje myggstam. Den massrelatiserade LD50 för ROCK och IICC är 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) respektive 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). De 95% CI av dessa värden överlappar inte varandra, vilket indikerar signifikant olika dossvar av stammarna. RR för IICC-stammen (i förhållande till ROCK-stammen) är 41,7, vilket enligt WHO anses vara mycket resistent5. För Canton-S-fruktflugorna är den massrelativiserade LD50 0,213 ng / mg (95% CI: 0-0,490).

Figure 2
Figur 2: Representativa data om myggor med hjälp av aktuell applikationsbioassay. Representativa dos-responsdata från topikal applicering bioassay enligt ovanstående protokoll med användning av deltametrin och myggor: (A) kvinnlig Ae. aegypti ROCK (n = 880) och IICC (n = 550) stammar, (B) manliga Ae. aegypti ROCK (n = 880) och IICC (n = 569) stammar. Testkoncentrationerna av deltametrin varierade från 0,00075 ng/μL till 9,68705 ng/μL, och dosen av deltametrin som applicerades (ng) per genomsnittlig myggmassa (mg) återspeglas på x-axeln. Dödligheten visas som en andel på y-axeln. Den svarta linjen genom varje datapunktskluster representerar den stam- och könsspecifika linjära regressionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa data för bananflugor med hjälp av topisk applicering bioassay. Representativa dos-responsdata från topikal applicering bioassay enligt ovanstående protokoll med användning av deltametrin och fruktflugor: D. melanogaster Canton-S stam (n = 1014). Testkoncentrationerna av deltametrin varierade från 0,00499 till 5,02876 ng/μL, och dosen av applicerat deltametrin (ng) per genomsnittlig bananflugemassa (mg) återspeglas på x-axeln. Dödligheten visas som en andel på y-axeln. Den svarta linjen representerar den linjära regressionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfigur S1: Insektshanteringstält på bänkskiva. Benchtop insektshanteringstält används för att lättare fånga flyende myggor eller flugor under den aktuella applikationsanalysen. Strukturen är stängd i A och öppen i B. Denna struktur byggdes med PVC-rör och finmaskigt tyg. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Sprut- och repeaterapplikatorenhet. Sprut- och repeaterapplikatorenhet som används för dosering av insekter. Huvuddelarna inkluderar 1) nål, 2) sprutfat, 3) kolv, 4) repeater och 5) repeaterknapp. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Randomiseringsskript: Randomiseringsskript för att skapa icke-partiska etiketter för alla koppar i varje experiment. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Resultatblad för dödlighet: Resultatblad för dödlighet för att underlätta bedömningen av dödligheten. Arket innehåller också platser för att registrera all annan viktig information att spela in, som det hänvisas till i protokollet, till exempel start- och sluttider för insekticidapplikationen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: Exempel på dödlighetsdata: Exempel på datafil som används för att skapa figur 2. Kolumnrubrikbeskrivningarna är följande: "id" = identifieringskod för varje datapunkt; "art" = artnamn (t.ex. Aedes aegypti), "insekticid" = namnet på insektsmedel som appliceras lokalt (t.ex. Deltametrin); "stam" = namn på myggstam (t.ex. ROCK); "datum" = startdatum aktuell ansökan; "kön" = myggens kön; "ålder" = ålder av myggor (ung = 3-5 dagar gammal; gammal = 4 veckor gammal); "total.mosq" = totalt antal myggor som vägs i sats; "vikt" = vikt (mg) av alla myggor inom sats; "koncentration" = koncentration av insektsmedel (μg/ml), "spruta" = droppvolym (ml) spruta; "dos" = mängd insekticid aktiv ingrediens applicerad på varje mygga (ng); "totalt" = antal myggor i varje kopp; "död" = antal döda myggor i varje kopp. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: R-analyskod: Exempel på R-kod som kan användas för att slutföra Probit-analysen (enligt beskrivningen i steg 8 i protokollet). De representativa resultaten (tillgängliga via den kompletterande exempeldatafilen) kan användas med denna R-kod. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Detta dokument presenterar ett anpassat protokoll för den aktuella applikationsanalysen för myggor och fruktflugor. Denna procedur kan enkelt anpassas för att användas i fält och med andra organismer eftersom det kräver minimal specialutrustning. Nedan behandlas detta protokolls kritiska steg, potentiella ändringar, felsökningsråd, metodens begränsningar och betydelsen av denna metod.

Kritiska steg i protokollet: Det finns tre kritiska steg i protokollet som, om de fylls i felaktigt, drastiskt kan påverka resultaten av bioassayn: insekticidkoncentrationsnoggrannhet, provknockdown och dödlighetsbedömning.

Insekticidkoncentrationsnoggrannhet:
Det är oerhört viktigt att ha exakta insekticidlösningar för att få replikerbara dos-responskurvor och meningsfulla resultat. Det volymetriska tillvägagångssättet för beredning av insekticidlösning är vanligare inom litteraturen för både CDC-flaskbioassay7 och aktuellaapplikationer 13,14,43. Det gravimetriska tillvägagångssättet som beskrivs här är emellertid i sig mer exakt på grund av hänsyn till temperatur genom inkludering av (temperaturspecifik) densitet, vilket leder till mer exakt formuleringsberedning.

Exempel knockdown:
Att slå ner proverna är en kritisk komponent i denna metod och möjliggör noggrann administrering av insektsmedlet och viktmätningar. Att slå ner organismer innehåller emellertid oundvikligen risken för fysisk stress och skada, vilket tidigarevisats 30. Var därför försiktig och uppmärksam när du slår ner proverna för att säkerställa att i) varje prov slås ner under en liknande varaktighet, ii) längden på knockdown hålls till ett minimum och iii) metoden för knockdown hålls konsekvent över alla exemplar. Dessutom rekommenderas att testa knockdown-metoden separat, före applicering av insektsmedel, för att säkerställa att metoden är framgångsrik och inte inducerar kontrolldödlighet större än 10%. Det första testet kan ta längre tid för en oerfaren användare, vilket leder till längre knockdown-tider. Var därför försiktig när du tolkar resultaten från de första analyserna.

Bedömning av dödlighet:
Att bedöma dödligheten kan vara utmanande, särskilt när insektsmedlet inte helt dödar utan bara slår ner eller lemlästar myggan eller flugan. Därför är det viktigt att vara medveten om hur insektsmedlet påverkar målorganismen och ha en tydlig definition för "döda" (eller nedslagna) organismer innan man börjar. Dessutom rekommenderas att samma person bedömer dödligheten mellan doser och replikat för att minska variationen.

Ändringar av protokollet: Flera ändringar som beskrivs nedan kan tillämpas på detta protokoll för att förbättra dess mångsidighet och tillgänglighet.

Anpassning av analysen till mindre eller större insekter:
Vid användning av mindre eller större prover rekommenderas att man applicerar en mindre eller större dosvolym insektsmedel. Som ett exempel anpassade vi myggprotokollet till bananflugor genom att minska dosen 0,5 μL till en dos på 0,2 μL. Se till att rätt sprutstorlek är vald för den valda dosvolymen.

Anpassa analysen till fältinsekter:
Vid användning av fältinsekter kan det finnas mer variation i insektsstorlek. Därför skulle vägning av insekterna i mindre grupper (t.ex. per kopp) rekommenderas istället för som en stor grupp (t.ex. alla insekter som används för ett experiment). Detta kan hjälpa till att fånga den potentiella variationen i insekticidkänslighet i samband med skillnaderna i fältinsektmassa.

Modifieringar av utrustning:
Insektshanteringstält: Doseringen av provet kan slutföras under ett insektshanteringstält som helt enkelt är konstruerat med PVC-rör och myggnät. Detta kan vara ett alternativ till ett slutet rum (t.ex. insektsmedel) och bidra till att eliminera potentiell insekticidförorening i områden där insektsuppfödning kan förekomma. Detta insektshanteringstält är lätt att bygga och billigt (~ $ 70). Alternativt kan en insektshanteringsbur köpas (~ $ 425).

Kylbord: Ispaket eller isbrickor kan användas för att slå ner provet och / eller hålla provet nedslaget.

Inkubator: Inkubatorer rekommenderas för uppfödning av provet och hållande provet i 24 timmar efter insekticidbehandling. Om en inkubator inte är tillgänglig kan den konstrueras. Utrustning som behövs för att bygga inkubatorn inkluderar en isolerad behållare, luftfuktare, värmekablar, fuktighets- och temperaturregulator och ett ljus, vilket bör ge upp till en total kostnad på ~ $ 170, som följer och utökar tidigare metoder44.

Hållkoppar: Även om plastkoppar används för att sortera och hålla det behandlade provet, skulle vaxfodrade papperskoppar eller glasbehållare vara lämpliga alternativ.

Organism och livsstadium modifiering:
Denna metod är mycket anpassningsbar för användning med andra vektorer, insekter och / eller leddjur som Culex quinquefasciatus myggor32, husflugor32 och kackerlackor45, liksom icke-vuxna livsstadier, såsom mygglarver46.

Aktuell ändring av programplats:
Denna metod beskriver applicering av insekticiden på den ventrala bröstkorgen och bukregionen för myggor (och dorsum för fruktflugor). Andra applikationsplatser kan dock användas så länge exponeringsplatsen är konsekvent. Konsistens är viktigt eftersom insekticidkänsligheten kan variera beroende på applikationsplats32.

Felsökningsråd: Den här metoden har flera steg som initialt är utmanande. Nedan beskrivs några av de vanligaste problemen man kan stöta på.

Läckande/avdunstande insektsmedel:
Insekticider löses vanligen i aceton, en mycket flyktig förening. Detta innebär att aceton avdunstar snabbt vid rumstemperatur, vilket ökar insekticidkoncentrationerna över tiden. Om insekticidlösningarna verkar läcka eller avdunsta, gör om lösningarna, se till att rörets lock är på tätt och dubbelkontrollera att lagringsprotokollen följs korrekt (t.ex. parafilm används och rören förvaras upprätt). Om läckage kvarstår, försök att fylla rören med en lägre volym för att ge mer utrymme för volymförändringen som acetonen upplever vid olika temperaturer. Dessutom, om du använder aceton som lösningsmedel, se till att rören är klassade för acetonlagring (t.ex. FEP-, TFE- och PFA-plast). Om du använder hydrofoba insekticider, förvara lösningarna i glasflaskor (eftersom hydrofoba insekticider fäster vid glas mindre än plast). Det är också god praxis att markera lösningens menisk före lagring för att övervaka avdunstningen.

Vikt som driver på mikrobalans vid vägning av organismer:
Om viktavläsningen på vågen driver (långsamt går upp eller ner) kan detta bero på statisk. Drift uppstår oftast vid vägning av organismer i plastartiklar, eftersom plast lätt kan hålla en statisk laddning. För att undvika detta kan ett vägningspapper placeras under plastbehållaren som vägs, eller en icke-plastbehållare som glas kan användas.

Onormala dödlighetsresultat:
Det finns många sätt på vilka dödlighetsresultaten kan verka onormala, till exempel att observera hög dödlighet i kontrollerna eller hög / låg dödlighet under alla insekticiddoser. Granska följande fall för felsökning av varje scenario.

Hög kontrolldödlighet
Om det finns hög dödlighet i kontrollgruppen (10% eller mer), utvärdera knockdown-metoden och hur länge proverna slås ner. Om möjligt, förkorta den tid under vilken proverna slås ner. Andra potentiella faktorer att ta hänsyn till för hög dödlighet i kontrollerna inkluderar i) kontroll av om inkubatorinställningarna är korrekta - onormala temperaturer och / eller fuktighet kan leda till ökad dödlighet. Temperatur och luftfuktighet bör kontrolleras med en oberoende datalogger. ii) Bedömning av insektshantering. Att hantera insekter för mycket eller för grovt kan leda till hög dödlighet. iii) Kontrollera om det inte finns någon insekticidkontaminering i 100% aceton som används för att behandla kontrollgruppen eller på instrumenteringen. Byt ut aceton och rengör alla instrument med aceton eller etanol. Undvik kontaminering genom att ofta byta handskar, förhindra spill och rengöra instrument. Observera att i tilläggsfil 3 dog högst två myggor inom kontrollkopparna (endast aceton). Denna dödlighetsnivå anses inte vara hög (den är mindre än 10%), och därför fanns det ingen anledning till oro.

Hög dödlighet i alla exponerade grupper (men inte i kontrollgrupper)
Använd lägre koncentrationer av insektsmedel eller mindre dosvolymer för testning. De doser som används kan vara över den minsta dosen som inte kommer att inducera dödlighet. Använd flera 10-faldiga utspädningar för att identifiera rätt dosintervall och utesluta kontaminering. För att undvika kontaminering, börja dosera med den lägsta koncentrationen och arbeta mot den högsta koncentrationen. Se dessutom till att all utrustning som används rengörs regelbundet med aceton och / eller etanol, doserna som appliceras på provet är mycket små och även den minsta korskontaminering kan påverka resultaten.

Låg dödlighet i alla utsatta grupper
Använd högre insekticidkoncentrationer. De doser som används kan alla vara för låga för att orsaka dödlighet i befolkningen. För att identifiera rätt dosintervall, utsätt proverna för flera fler 10-faldiga koncentrerade doser. Se till att insekticidlösningarna inte har gått ut eller försämrats (eventuellt på grund av hög temperatur eller ljusexponering). Om lösningarna har gått ut eller misstänks ha försämrats, gör om lösningarna och se till att lämpliga lagringsförhållanden följs.

Inkonsekvent dödlighet mellan replikat/dagar
Den tid på dagen då insekter utsätts för insektsmedlet kan påverka den resistensnivå som uttrycks, särskilt för metabolisk resistens34. Upprepa detta protokoll under samma tidsfönster varje dag för att undvika tid på dagen som en potentiell variabel som bidrar till förändringar i dödligheten. Andra potentiella faktorer som bidrar till inkonsekvent dödlighet mellan replikat inkluderar i) prover som är differentiellt uppfödda mellan experiment. Se till att alla exemplar är av samma åldersintervall, uppfödda vid samma temperatur och liknande densiteter och livsmedelstillgänglighet. ii) insekticidkoncentrationer som försämras med tiden eller blir mer koncentrerade på grund av acetonavdunstning. Gör om lösningarna och säkerställ korrekta lagringsförhållanden. iii) Inkonsekvent dödlighetspoäng. Se till att samma person får dödlighet eller utveckla ett tydligt protokoll som ska användas konsekvent i hela teamet. Använd blind scoring för att minska bias i dödlighetspoäng.

Insekter som fastnar på sorteringsbrickans yta:
Aceton reagerar på plast som används i detta protokoll, såsom petriskålar. Provet kommer sannolikt att fästa vid ytan om man använder aceton på petriskålar eller liknande plastytor. Denna vidhäftning kan undvikas genom att fodra sorteringsbrickan med vägningspapper eller använda en sorteringsbricka som inte är av plast. Dessutom kan kondens på ytan av plast i sorteringsbrickan eller hållarkopparna leda till att insekter fäster vid kondensationen, eller provet kan vara för kallt och potentiellt frysa till ytan. Justera knockdown-metoden för att minska kondens samtidigt som du förhindrar att proverna blir för kalla/frysta (t.ex. placera vägningspapper mellan proverna och plastsorteringsbrickan).

R-analysfel:
När mortalitetsdata har samlats in kan en mängd komplikationer uppstå under analysen. Den vanligaste orsaken till att en R-kod inte kan slutföra åtgärderna för datafilen är att dataformatet inte matchar koden (t.ex. kolumnrubriker och/eller tomma celler). Om allvarligare komplikationer uppstår, se R-hjälpsidorna som är inbyggda i Rstudio35.

Begränsningar av den ovan beskrivna aktuella tillämpningsmetoden:
Insekticidabsorption via topisk appliceringsmetod efterliknar inte naturlig exponering:
Topisk applicering på den primära kroppen är inte det naturliga sättet att absorbera insektsmedel. I fältet absorberar insekter mestadels insekticider genom benen under den tid de är i kontakt med den insekticidbehandlade ytan eller på sina vingar genom små aerosolpartiklar47,48, snarare än en snabb exponering på den ventrala ytan. Den direkta appliceringen av en känd insekticiddos kommer emellertid att exakt fastställa ett fenotypiskt svar på insekticider, som behövs för genetiska och evolutionära studier eller jämförelser av insekticidkänslighet över rymden eller tiden. Därför är detta tillvägagångssätt fördelaktigt för att testa tekniskt motstånd men kommer inte direkt att mäta praktiskt motstånd (effekten av det faktiska interventionsverktyget i en fältinställning15). Det är dock viktigt att notera att de nuvarande standardmetoderna (t.ex. WHO-rörtester och CDC-flaskbioassays) inte heller kan fånga eller efterlikna aerosolexponering (dvs. genom dimma) insekticidexponering i fältet.

Aktuella applikationsanalyser kan endast bedöma kontaktabsorptionsinsekticider:
Denna metod är avsedd för insekticider som arbetar genom kontakt och absorption av insektsmedlet och inte för användning med orala insekticider, såsom borsyra som vanligen används i attraktiva giftiga sockerbeten49.

Metodens betydelse:
Den aktuella appliceringsmetoden bygger vidare på väletablerade standarder för insekticidbioassays genom att beräkna den dödliga dosen (inte koncentrationen) och mäta teknisk (inte praktisk) resistens15. Nedan ges fördelarna och nackdelarna med denna metod jämfört med befintliga insekticidkänslighetsanalyser.

Beräkning av dödlig dos:
Denna metod bestämmer den dödliga dosen av insektsmedlet, snarare än den dödliga koncentrationen som CDC och WHO bioassays använder för att fastställa den diskriminerande dosen11. Den dödliga dosen är mer meningsfull eftersom det är en kvantifierad mängd insektsmedel som är känd för att framkalla dödlighet. Däremot tar den dödliga koncentrationen inte hänsyn till hur mycket insektsmedel organismen faktiskt förvärvar. Vid användning av den dödliga dosberäkningen kan skillnader mellan köns- eller storleksberoende känslighetsprofiler observeras och kvantifieras mer exakt, vilket gör denna mätning ännu mer mångsidig.

Tekniskt motstånd:
Denna metod bedömer teknisk resistans, vilket är motstånd mätt i standardiserade, kontrollerade miljöer. Sådana mätningar är lämpliga för övervakning av spridningen av insekticidresistens och koppling av fenotypisk resistens med potentiella markörer15. På grund av den minskade variationen i dödlighet till följd av den aktuella applikationsbioassayn möjliggör det bättre identifiering av nya resistensmarkörer. På grund av den onaturliga exponeringen av insekticider för myggan är denna analys emellertid inte lämplig för uppskattning av effekten av en specifik intervention i en specifik population. Andra analyser behövs för mätningar av sådant praktiskt motstånd15.

Provets anpassningsförmåga:
Denna metod kan praktiseras på andra viktiga leddjur som skadedjur (t.ex. Colorado potatisbagge), husskadedjur (t.ex. kackerlackor och vägglöss) eller pollinatorer (t.ex. bin) med enkla förändringar av knockdown-metoden och / eller insekticiddosen, volymen och / eller koncentrationen (som beskrivits ovan). Den enkla anpassningsförmågan kan hjälpa till att analogisera forskning om insekticidresistens inom olika forskningsområden. Användningen av ett LD50-värde istället för en dödlig koncentration som dödar 50% av proverna (LC50) möjliggör noggrann jämförelse mellan arter.

Kostnad:
I likhet med CDC-flaskbioassays och WHO-rörtester är kostnaderna för att köra den aktuella applikationsanalysen minimala (se materialförteckningen). De viktigaste delarna av utrustningen är sprutan (cirka $ 70) och dispensern (cirka $ 100), som kan återanvändas över analyser.

Antal exemplar som behövs:
Minst 20-25 prover bör användas per topisk applikationsanalyskopp. Minst fem insekticidkoncentrationer rekommenderas att testas per experiment, med minst tre replikat som rekommenderas för proceduren. Sammantaget resulterar detta i minst 300-375 prover som behövs för ett komplett test, jämförbart med antalet prover som behövs för att utföra resistensintensitetstester med HJÄLP av WHO-rörtester eller CDC-flaskbioassays. Men om minskad variabilitet uppnås med den aktuella applikationsbioassay, kan samma antal prover leda till mer statistisk kraft för att jämföra känslighetsdata över tid eller rum.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av en CAREER-utmärkelse från National Science Foundation till SH under prisnummer 2047572. Vi tackar Damien Rivera för hans hjälp med fruktflugeuppfödning och förberedelse för aktuell applikationsanalys, Dr. Ganetzky vid University of Wisconsin-Madison för att dela sin Canton-S fruktflugstam, Centers for Disease Control and Prevention för att dela Rockefeller-stammen och USA: s Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology för att dela IICC-isolinstammen. Figur 1 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Thomas Scientific 20A00L068 Acetone aliquot storage
1.5 mL screw cap tubes Thomas Scientific 1182K23 Insecticide dilution storage
15 mL conical tubes VWR 339651 Insecticide dilution storage
20 mL glass scintillation vials Fisher Scientific 0334125D Fruit fly weighing
25 μL syringe Fisher Scientific 14815288 Topical applicator
Acetone Fisher Scientific AC423240040 ACS 99.6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC strain) USDA CMAVE NA Insecticide resistant
Aedes aegypti (Rockefeller strain) CDC NA Insecticide susceptible
Analytical scale Fisher Scientific 14-557-409 Precision up to 0.1 mg
Aspirator Amazon 6.49986E+11 Mosquito collection device
Bench paper VWR 89126-794 Place under workspace
Cotton swabs Amazon B092S8JVQN Use for sorting insects
Cotton wool balls Amazon B0769MKZWT Use for sucrose solution
Dispenser Fisher Scientific 1482225 Repeater pipettor
Drosophila melanogaster (Canton-S strain) University of Wisconsin-Madison NA Insecticide susceptible
Fine-tipped paint brushes Amazon B07KT2X1BK Use for sorting insects
Fruit fly stock bottles Fisher Scientific AS355 Use for rearing and sorting fruit flies
Hand-held CO2 dispenser Fisher Scientific NC1710679 Use for knocking down insects
Holding cups Amazon B08DXG7V1S Clear plastic
Ice pack Amazon B08QDWMMW5 Use for knocking down fruit flies
Ice trays Amazon 9301085269 Use for knocking down insects
Insect forceps Amazon B07B4767WR Insect forceps
Insecticide Sigma-Aldrich Inc 45423-250MG Deltamethrin
Labeling stickers Amazon B07Q4X9GWX 3/4" Color dot stickers
Labeling tape Amazon B00X6A1GYK White tape
Netting Amazon B07F2PHHWV Use for covering holding cups and insect handling tent
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712H371 100 mm x 15 mm
PVC Pipe Lowe’s 23971 Insect handling tent materials
Rubber bands Amazon B00006IBRU Use for securing mesh/net on cups
Sucrose Amazon B01J78INO0 Granulated White Sugar
Weighing paper VWR 12578-165 4" x 4"

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Vector-borne diseases. World Health Organization. , https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/vector-borne-diseases (2020).
  2. World Health Organization. Global plan for insecticide resistance management in malaria vectors. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/44846 (2012).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60 (1), 537-559 (2015).
  4. Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45 (1), 371-391 (2000).
  5. World Health Organization. Monitoring and managing insecticide resistance in Aedes mosquito populations. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/204588 (2016).
  6. World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes (Second edition). World Health Organization. , http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241511575/en/ (2016).
  7. McAllister, J. C., Scott, M. CONUS manual for evaluating insecticide resistance in mosquitoes using the CDC bottle bioassay kit. Centers for Disease Control and Prevention. , https://www.cdc.gov/zika/pdfs/CONUS-508.pdf (2020).
  8. Duneau, D., et al. Signatures of insecticide selection in the genome of Drosophila melanogaster. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3469-3480 (2018).
  9. Pittendrigh, B., Reenan, R., ffrench-Constant, R. H., Ganetzky, B. Point mutations in the Drosophila sodium channel gene para associated with resistance to DDT and pyrethroid insecticides. Molecular & General Genetics: MGG. 256 (6), 602-610 (1997).
  10. Rinkevich, F. D., Du, Y., Dong, K. Diversity and convergence of sodium channel mutations involved in resistance to pyrethroids. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 93-100 (2013).
  11. Lissenden, N., et al. Review and meta-analysis of the evidence for choosing between specific pyrethroids for programmatic purposes. Insects. 12 (9), 826 (2021).
  12. Owusu, H. F., Chitnis, N., Müller, P. Insecticide susceptibility of Anopheles mosquitoes changes in response to variations in the larval environment. Scientific Reports. 7 (1), 3667 (2017).
  13. Brito-Sierra, C. A., Kaur, J., Hill, C. A. Protocols for testing the toxicity of novel insecticidal chemistries to mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e57768 (2019).
  14. Burgess, E. R., King, B. H., Geden, C. J. Oral and topical insecticide response bioassays and associated statistical analyses used commonly in veterinary and medical entomology. Journal of Insect Science. 20 (6), 1-9 (2020).
  15. Namias, A., Jobe, N. B., Paaijmans, K. P., Huijben, S. The need for practical insecticide-resistance guidelines to effectively inform mosquito-borne disease control programs. eLife. 10 (1), 65655 (2021).
  16. Zhu, X., et al. Manipulating solid forms of contact insecticides for infectious disease prevention. Journal of the American Chemical Society. 141 (1), 16858-16864 (2019).
  17. Dang, K., Singham, G. V., Doggett, S. L., Lilly, D. G., Lee, C. Y. Effects of different surfaces and insecticide carriers on residual insecticide bioassays against bed bugs, Cimex spp. (Hemiptera: Cimicidae). Journal of Economic Entomology. 110 (2), 558-566 (2017).
  18. Spielmeyer, A., Schetelig, M. F., Etang, J. High-throughput analysis of insecticides on malaria vectors using liquid chromatography tandem mass spectrometry. PLoS ONE. 14 (2), 0211064 (2019).
  19. Bagi, J., et al. When a discriminating dose assay is not enough: measuring the intensity of insecticide resistance in malaria vectors. Malaria Journal. 14 (1), 210 (2015).
  20. Pridgeon, J. W., Becnel, J. J., Clark, G. G., Linthicum, K. J. Permethrin induces overexpression of multiple genes in Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 46 (3), 1-8 (2009).
  21. World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications. World Health Organization. , https://apps.who.int/iris/handle/10665/70070 (2009).
  22. Estep, A. S., et al. Quantification of permethrin resistance and kdr alleles in Florida strains of Aedes aegypti (L.) and Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (10), 0006544 (2018).
  23. Waits, C. M., et al. A comparative analysis of resistance testing methods in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) from St. Johns County, Florida. Florida Entomologist. 100 (3), 571-577 (2017).
  24. Kostromytska, O. S., Wu, S., Koppenhöfer, A. M. Diagnostic dose assays for the detection and monitoring of resistance in adults from Listronotus maculicollis (Coleoptera: Curculionidae) populations. Journal of Economic Entomology. 111 (5), 2329-2339 (2018).
  25. Aktar, W., Sengupta, D., Chowdhury, A. Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards. Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).
  26. Maïga, H., et al. Guidelines for routine colony maintenance of Aedes mosquito species. IAEA Physical and Chemical Sciences. , http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
  27. Gjullin, C. M., Hegarty, C. P., Bollen, W. B. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of aedes mosquito eggs. Journal of Cellular Physiology. 17 (2), 193-202 (1941).
  28. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420 (1), 27-44 (2008).
  29. Jass, A., Yerushalmi, G. Y., Davis, H. E., Donini, A., MacMillan, H. A. An impressive capacity for cold tolerance plasticity protects against ionoregulatory collapse in the disease vector Aedes aegypti. Journal of Experimental Biology. 222 (1), 214056 (2019).
  30. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., Vandenbrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Scientific Reports. 5 (1), 15298 (2015).
  31. Jung, Y., Kennedy, A., Chiu, H., Mohammad, F., Claridge-Chang, A., Anderson, D. J. Neurons that function within an integrator to promote a persistent behavioral state in Drosophila. Neuron. 105 (2), 322-333 (2020).
  32. Aldridge, R. L., Kaufman, P. E., Bloomquist, J. R., Gezan, S. A., Linthicum, K. J. Impact of topical application site on the efficacy of permethrin and malathion to Culex quinquefasciatus. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (4), 300-307 (2016).
  33. Rinkevich, F. D., et al. Distinct roles of the DmNav and DSC1 channels in the action of DDT and pyrethroids. Neuro Toxicology. 47 (1), 99-106 (2015).
  34. Balmert, N. J., Rund, S. S. C., Ghazi, J. P., Zhou, P., Duffield, G. E. Time-of-day specific changes in metabolic detoxification and insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Journal of Insect Physiology. 64 (1), 30-39 (2014).
  35. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. R Core Team. , https://www.r-project.org/ (2021).
  36. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), 0146021 (2015).
  37. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3 (2), 302-303 (1987).
  38. Ravichandran, S. Data analysis through SAS with special emphasis on Probit analysis. National Academy of Agricultural Research Management (NAARM). , https://naarm.org.in/VirtualLearning/vic/e-chapters/Probit_Analysis-ravichandran.pdf (2021).
  39. Smith, L. B., et al. CYP-mediated resistance and cross-resistance to pyrethroids and organophosphates in Aedes aegypti in the presence and absence of kdr. Pesticide Biochemistry and Physiology. 160 (1), 119-126 (2019).
  40. Finney, D. J. Probit Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge, England. (1971).
  41. Silva, J. J., Kouam, C. N., Scott, J. G. Levels of cross-resistance to pyrethroids conferred by the Vssc knockdown resistance allele 410L+1016I+1534C in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 15 (7), 0009549 (2021).
  42. Fan, Y., Scott, J. G. The F1534C voltage-sensitive sodium channel mutation confers 7- to 16-fold resistance to pyrethroid insecticides in Aedes aegypti. Pest Management Science. 76 (1), 2251-2259 (2020).
  43. Miller, A. L. E., Tindall, K., Leonard, B. R. Bioassays for monitoring insecticide resistance. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2129 (2010).
  44. Glunt, K. D., et al. Long-lasting insecticidal nets no longer effectively kill the highly resistant Anopheles funestus of southern Mozambique. Malaria Journal. 14 (1), 298 (2015).
  45. ffrench-Constant, R. H., Roush, R. T. Resistance detection and documentation: the relative roles of pesticidal and biochemical assays. Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T., Tabashnik, B. E. , Springer. Boston, MA. (1990).
  46. Akdag, K., et al. Synthesis and larvicidal and adult topical activity of some hydrazide-hydrazone derivatives against Aedes aegypti. Marmara Pharmaceutical Journal. 18 (1), 120-125 (2014).
  47. Richards, S. L., Byrd, B. D., Reiskind, M. H., White, A. V. Assessing insecticide resistance in adult mosquitoes: perspectives on current methods. Environmental Health Insights. 14 (1), (2020).
  48. Cooperband, M., Golden, F., Clark, G., Jany, W., Allan, S. Prallethrin-induced excitation increases contact between sprayed ultra-low volume droplets and flying mosquitoes (Diptera: Culicidae) in a wind tunnel. Journal of Medical Entomology. 47 (1), 1099-1106 (2010).
  49. Barbosa, D. S., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Evaluation of attractive toxic sugar baits (ATSB) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in laboratory. Tropical Biomedicine. 36 (2), 578-586 (2019).

Tags

Biologi utgåva 179
Aktuell applikationsbioassay för att kvantifiera insekticidtoxicitet för myggor och fruktflugor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jensen, B. M., Althoff, R. A.,… More

Jensen, B. M., Althoff, R. A., Rydberg, S. E., Royster, E. N., Estep, A., Huijben, S. Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies. J. Vis. Exp. (179), e63391, doi:10.3791/63391 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter