Summary

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Published: March 01, 2022
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Summary

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Abstract

La rizosfera alberga una comunidad microbiana altamente compleja en la que las raíces de las plantas son constantemente desafiadas. Las raíces están en estrecho contacto con una amplia variedad de microorganismos, pero los estudios sobre las interacciones transmitidas por el suelo aún están detrás de los realizados en los órganos sobre el suelo. Aunque algunas estrategias de inoculación para infectar plantas modelo con patógenos de raíces modelo se describen en la literatura, sigue siendo difícil obtener una visión general metodológica completa. Para abordar este problema, se describen con precisión tres sistemas diferentes de inoculación radicular que se pueden aplicar para obtener información sobre la biología de las interacciones raíz-microbio. A modo de ejemplo, las especies de Verticillium (a saber, V. longisporum y V. dahliae) se emplearon como patógenos modelo invasores de raíces. Sin embargo, los métodos se pueden adaptar fácilmente a otros microbios colonizadores de raíces, tanto patógenos como beneficiosos. Al colonizar el xilema de la planta, los hongos vasculares transmitidos por el suelo como Verticillium spp. exhiben un estilo de vida único. Después de la invasión de la raíz, se propagan a través de los vasos del xilema acropétalo, llegan al brote y provocan síntomas de enfermedad. Se eligieron tres especies de plantas representativas como huéspedes modelo: Arabidopsis thaliana, colza de importancia económica (Brassica napus) y tomate (Solanum lycopersicum). Se dan protocolos paso a paso. Se muestran resultados representativos de ensayos de patogenicidad, análisis transcripcionales de genes marcadores y confirmaciones independientes por parte de constructos reporteros. Además, se discuten a fondo las ventajas y desventajas de cada sistema de inoculación. Estos protocolos probados pueden ayudar a proporcionar enfoques para preguntas de investigación sobre las interacciones raíz-microbio. Saber cómo las plantas hacen frente a los microbios en el suelo es crucial para desarrollar nuevas estrategias para mejorar la agricultura.

Introduction

Los suelos naturales están habitados por un número asombroso de microbios que pueden ser neutros, dañinos o beneficiosos para las plantas1. Muchos patógenos de plantas son transmitidos por el suelo, rodean las raíces y atacan el órgano subterráneo. Estos microorganismos pertenecen a una amplia variedad de clados: hongos, oomicetos, bacterias, nematodos, insectos y algunos virus 1,2. Una vez que las condiciones ambientales favorecen la infección, las plantas susceptibles se enfermarán y los rendimientos de los cultivos disminuirán. Los efectos del cambio climático, como el calentamiento global y los fenómenos meteorológicos extremos, aumentarán la proporción de patógenos de plantas transmitidos por el suelo3. Por lo tanto, será cada vez más importante estudiar estos microbios destructivos y su impacto en la producción de alimentos y piensos, pero también en los ecosistemas naturales. Además, hay mutualistas microbianos en el suelo que interactúan estrechamente con las raíces y promueven el crecimiento, el desarrollo y la inmunidad de las plantas. Cuando se enfrentan a patógenos, las plantas pueden reclutar activamente oponentes específicos en la rizosfera que pueden apoyar la supervivencia del huésped mediante la supresión de patógenos 4,5,6,7. Sin embargo, los detalles mecanicistas y las vías involucradas en las interacciones beneficiosas entre la raíz y el microbio a menudo aún sedesconocen 6.

Por lo tanto, es esencial ampliar la comprensión general de las interacciones raíz-microbio. Se necesitan métodos confiables para inocular raíces con microorganismos transmitidos por el suelo para realizar estudios de modelos y transferir los hallazgos a aplicaciones agrícolas. Se estudian las interacciones beneficiosas en el suelo, por ejemplo, con Serendipita indica (anteriormente conocida como Piriformospora indica), Rhizobium spp. fijador de nitrógeno u hongos micorrícicos, mientras que los patógenos conocidos de plantas transmitidas por el suelo incluyen Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. y Verticillium spp.1. Estos dos últimos son géneros fúngicos que están distribuidos globalmente y causan enfermedades vasculares2. Verticillium spp. (Ascomycota) puede infectar a cientos de especies de plantas, en gran parte dicotiledóneas, incluidas las plantas herbáceas anuales, las plantas leñosas perennes y muchas plantas de cultivo 2,8. Las hifas de Verticillium entran en la raíz y crecen tanto intercelular como intracelularmente hacia el cilindro central para colonizar los vasos del xilema 2,9. En estos vasos, el hongo permanece durante la mayor parte de su ciclo de vida. Como la savia del xilema es pobre en nutrientes y lleva compuestos de defensa de las plantas, el hongo debe adaptarse a este entorno único. Esto se logra mediante la secreción de proteínas relacionadas con la colonización que permiten que el patógeno sobreviva en su huésped10,11. Después de llegar a la vasculatura de la raíz, el hongo puede propagarse dentro de los vasos del xilema acropétalo al follaje, lo que conduce a la colonización sistémica del huésped 9,12. En este punto, la planta se ve afectada negativamente en el crecimiento 9,10,13. Por ejemplo, se produce retraso en el crecimiento y hojas amarillas, así como senescencia prematura 13,14,15,16.

Un miembro de este género es Verticillium longisporum, que está altamente adaptado a los huéspedes de brassicácea, como la colza de importancia agronómica, la coliflor y la planta modelo Arabidopsis thaliana12. Varios estudios combinaron V. longisporum y A. thaliana para obtener una amplia información sobre las enfermedades vasculares transmitidas por el suelo y las respuestas de defensa radicular resultantes 13,15,16,17. Las pruebas de susceptibilidad directas se pueden realizar utilizando el sistema modelo V. longisporum / A. thaliana y hay recursos genéticos bien establecidos disponibles para ambos organismos. Estrechamente relacionado con V. longisporum está el patógeno Verticillium dahliae. Aunque ambas especies de hongos realizan un estilo de vida vascular similar y un proceso de invasión, su eficiencia de propagación desde las raíces hasta las hojas y los síntomas de la enfermedad provocada en A. thaliana son diferentes: mientras que V. longisporum generalmente induce senescencia temprana, la infección por V. dahliae resulta en marchitamiento18. Recientemente, un resumen metodológico presentó diferentes estrategias de inoculación radicular para infectar A. thaliana con V. longisporum o V. dahliae, ayudando en la planificación de configuraciones experimentales19. En el campo, V. longisporum ocasionalmente causa daños significativos en la producción de colza12, mientras que V. dahliae tiene un rango de huéspedes muy amplio que comprende varias especies cultivadas, como vid, papa y tomate8. Esto hace que ambos patógenos sean modelos económicamente interesantes para estudiar.

Por lo tanto, los siguientes protocolos utilizan tanto V. longisporum como V. dahliae como patógenos de raíz modelo para ejemplificar posibles enfoques para las inoculaciones radiculares. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza oleaginosa (Brassica napus) y tomate (Solanum lycopersicum) fueron elegidos como huéspedes modelo. Las descripciones detalladas de las metodologías se pueden encontrar en el texto a continuación y en el video que lo acompaña. Se discuten las ventajas y desventajas para cada sistema de inoculación. En conjunto, esta colección de protocolos puede ayudar a identificar un método adecuado para preguntas de investigación específicas en el contexto de las interacciones raíz-microbio.

Protocol

1. Medios para cultivos de hongos y sistemas de inoculación de plantas Caldo líquido de dextrosa de patata (PDB): Preparar 21 g/L de PDB en agua ultrapura en un matraz termoestable. Caldo líquido de dextrosa Czapek (CDB): Prepare 42 g/L CDB en agua ultrapura en un matraz termoestable. Medio para el sistema de inoculación de placas de Petri: Preparar un matraz termoestable con 1,5 g/L murashige y Skoog medio (MS) y 8 g/L de agar en agua ultrapura.NOTA: Evite el azúca…

Representative Results

Siguiendo el protocolo, las plantas fueron cultivadas e inoculadas con V. longisporum (cepa Vl4325) o V. dahliae (aislado JR218). Se diseñaron varios escenarios para demostrar la efectividad y resaltar algunas capacidades de los protocolos dados. Se muestran resultados representativos. La inducción expresional de genes implicados en la biosíntesis antimicrobiana de indol-glucosinolato (IG) es un indicador fiable para…

Discussion

Debido a las tremendas pérdidas de rendimiento causadas por los fitopatógenos transmitidos por el suelo1, se requiere una mejora de las estrategias agrícolas o las variedades de cultivos. La limitada comprensión de la patogénesis de las enfermedades transmitidas por el suelo dificulta el desarrollo de plantas más resistentes. Es necesario explorar los mecanismos patológicos subyacentes, para lo cual se requiere una plataforma metodológica robusta. Los procedimientos de inoculación reporta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a Tim Iven y Jaqueline Komorek por su trabajo previo en estos métodos, al grupo de Wolfgang Dröge-Laser (Departamento de Biología Farmacéutica, Universidad de Würzburg, Alemania) por proporcionar el equipo y los recursos necesarios para este trabajo, y a Wolfgang Dröge-Laser, así como a Philipp Kreisz (ambos de la Universidad de Würzburg) por la revisión crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por la “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).

Materials

Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

References

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Cite This Article
Marsell, A., Fröschel, C. Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms. J. Vis. Exp. (181), e63446, doi:10.3791/63446 (2022).

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