Summary

Inokuleringsstrategier för att infektera växtrötter med jordburna mikroorganismer

Published: March 01, 2022
doi:

Summary

Detta protokoll presenterar en detaljerad sammanfattning av strategier för att inokulera växtrötter med jordburna mikrober. Exemplifierat för svamparna Verticillium longisporum och Verticillium dahliae beskrivs tre olika rotinfektionssystem. Potentiella tillämpningar och möjliga nedströmsanalyser lyfts fram, och fördelar eller nackdelar diskuteras för varje system.

Abstract

Rhizosfären hyser ett mycket komplext mikrobiellt samhälle där växtrötterna ständigt utmanas. Rötter är i nära kontakt med en mängd olika mikroorganismer, men studier av jordburna interaktioner ligger fortfarande bakom de som utförs på ovanjordiska organ. Även om vissa ympningsstrategier för att infektera modellväxter med modellrotpatogener beskrivs i litteraturen, är det fortfarande svårt att få en omfattande metodologisk översikt. För att ta itu med detta problem beskrivs tre olika rotinokuleringssystem exakt som kan tillämpas för att få insikt i biologin hos rot-mikrobinteraktioner. Som illustration användes Verticillium-arter (nämligen V. longisporum och V. dahliae) som rotinkräktande modellpatogener. Metoderna kan emellertid enkelt anpassas till andra rotkoloniserande mikrober – både patogena och fördelaktiga. Genom att kolonisera växten xylem uppvisar vaskulära jordburna svampar som Verticillium spp. en unik livsstil. Efter rotinvasion sprids de via xylemkärlen akropetalt, når skottet och framkallar sjukdomssymtom. Tre representativa växtarter valdes som modellvärdar: Arabidopsis thaliana, ekonomiskt viktig raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum). Steg-för-steg-protokoll ges. Representativa resultat av patogenicitetsanalyser, transkriptionsanalyser av markörgener och oberoende bekräftelser av reporterkonstruktioner visas. Vidare diskuteras fördelarna och nackdelarna med varje ympningssystem grundligt. Dessa beprövade protokoll kan hjälpa till att tillhandahålla metoder för forskningsfrågor om rot-mikrobinteraktioner. Att veta hur växter klarar av mikrober i jorden är avgörande för att utveckla nya strategier för att förbättra jordbruket.

Introduction

Naturliga jordar är bebodda av ett häpnadsväckande antal mikrober som kan vara neutrala, skadliga eller fördelaktiga för växter1. Många växtpatogener är jordburna, omger rötterna och attackerar det underjordiska organet. Dessa mikroorganismer tillhör en mängd olika klader: svampar, oomyceter, bakterier, nematoder, insekter och vissa virus 1,2. När miljöförhållandena gynnar infektion kommer mottagliga växter att bli sjuka och avkastningen minskar. Effekterna av klimatförändringarna, såsom den globala uppvärmningen och extrema väderförhållanden, kommer att öka andelen jordburna växtpatogener3. Därför kommer det att bli allt viktigare att studera dessa destruktiva mikrober och deras inverkan på livsmedels- och foderproduktionen, men också på naturliga ekosystem. Dessutom finns det mikrobiella mutualister i jorden som tätt interagerar med rötter och främjar växttillväxt, utveckling och immunitet. När de konfronteras med patogener kan växter aktivt rekrytera specifika motståndare i rhizosfären som kan stödja värdöverlevnad genom att undertrycka patogener 4,5,6,7. Mekanistiska detaljer och vägar som är involverade i fördelaktiga rot-mikrobinteraktioner är emellertid ofta fortfarande okända6.

Det är därför viktigt att utöka den allmänna förståelsen av rot-mikrobinteraktioner. Tillförlitliga metoder för att inokulera rötter med jordburna mikroorganismer är nödvändiga för att utföra modellstudier och överföra resultaten till jordbruksapplikationer. Gynnsamma interaktioner i jorden studeras till exempel med Serendipita indica (tidigare känd som Piriformospora indica), kvävefixerande Rhizobium spp. eller mykorrhizala svampar, medan kända jordburna växtpatogener inkluderar Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. och Verticillium spp.1. De två senare är svampsläkten som är globalt fördelade och orsakar kärlsjukdomar2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan infektera hundratals växtarter – till stor del dikotyledoner, inklusive örtartade ettåriga, träiga stauder och många grödor 2,8. Hyfer av Verticillium kommer in i roten och växer både intercellulärt och intracellulärt mot den centrala cylindern för att kolonisera xylemkärlen 2,9. I dessa kärl förblir svampen under större delen av sin livscykel. Eftersom xylemsaften är näringsfattig och bär växtförsvarsföreningar måste svampen anpassa sig till denna unika miljö. Detta åstadkoms genom utsöndring av koloniseringsrelaterade proteiner som gör det möjligt för patogenen att överleva i sin värd10,11. Efter att ha nått rotvaskulaturen kan svampen spridas inom xylemkärlen akropetalt till lövverket, vilket leder till systemisk kolonisering av värden 9,12. Vid denna tidpunkt påverkas växten negativt i tillväxt 9,10,13. Till exempel förekommer stunting och gula löv samt för tidig senescens 13,14,15,16.

En medlem av detta släkte är Verticillium longisporum, som är mycket anpassad till brassicaceous värdar, såsom den agronomiskt viktiga oljeväxtrapsen, blomkålen och modellväxten Arabidopsis thaliana12. Flera studier kombinerade V. longisporum och A. thaliana för att få omfattande insikter i jordburna kärlsjukdomar och de resulterande rotförsvarssvaren 13,15,16,17. Enkel känslighetstestning kan realiseras genom att använda V. longisporum / A. thaliana modellsystem och väletablerade genetiska resurser är tillgängliga för båda organismerna. Nära besläktad med V. longisporum är patogenen Verticillium dahliae. Även om båda svamparterna utför en liknande vaskulär livsstil och invasionsprocess, är deras förökningseffektivitet från rötter till löv och de framkallade sjukdomssymtomen i A. thaliana olika: medan V. longisporum vanligtvis inducerar tidig senescens, resulterar V. dahliae-infektion i vissnande18. Nyligen presenterade en metodologisk sammanfattning olika rotinokuleringsstrategier för att infektera A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, vilket hjälpte till att planera experimentella inställningar19. På fältet orsakar V. longisporum ibland betydande skador i rapsproduktion12, medan V. dahliae har ett mycket brett värdområde som omfattar flera odlade arter, såsom vinrankor, potatis och tomat8. Detta gör båda patogenerna ekonomiskt intressanta modeller att studera.

Således använder följande protokoll både V. longisporum och V. dahliae som modellrotpatogener för att exemplifiera möjliga metoder för rotinokulationer. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum) valdes som modellvärdar. Detaljerade beskrivningar av metoderna finns i texten nedan och den medföljande videon. Fördelar och nackdelar för varje ympningssystem diskuteras. Sammantaget kan denna protokollsamling hjälpa till att identifiera en lämplig metod för specifika forskningsfrågor i samband med rot-mikrobinteraktioner.

Protocol

1. Media för svampkulturer och växtinokuleringssystem Flytande potatisdextrosbuljong (PDB): Förbered 21 g / L PDB i ultrarent vatten i en värmestabil kolv. Flytande Czapek dextrosbuljong (CDB): Förbered 42 g / L CDB i ultrarent vatten i en värmestabil kolv. Medium för petriskålens ympningssystem: Förbered en värmestabil kolv med 1,5 g /L Murashige och Skoog medium (MS) och 8 g/L agar i ultrarent vatten.OBS: Undvik socker i detta medium eftersom det kommer att l…

Representative Results

Enligt protokollet odlades och ympades växterna med V. longisporum (stam Vl4325) eller V. dahliae (isolera JR218). Olika scenarier utformades för att bevisa effektiviteten och för att lyfta fram vissa funktioner i de givna protokollen. Representativa resultat visas. Expressionell induktion av gener som är involverade i den antimikrobiella indol-glukosinolat (IG) biosyntesen är en tillförlitlig indikator för utvä…

Discussion

På grund av de enorma avkastningsförluster som orsakas av jordburna fytopatogener1 krävs en förbättring av jordbruksstrategier eller grödor. Den begränsade insikten i patogenesen av jordburna sjukdomar hindrar utvecklingen av mer resistenta växter. Underliggande patomekanismer måste undersökas, för vilka en robust metodologisk plattform krävs. Rapporterade inokuleringsförfaranden har visat att multifaktoriella händelser i rot-mikrobinteraktioner kan dissekeras väl genom att kombiner…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner Tim Iven och Jaqueline Komorek för tidigare arbete med dessa metoder, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institutionen för farmaceutisk biologi, Universitetet i Würzburg, Tyskland) för att tillhandahålla den utrustning och de resurser som behövs för detta arbete, och Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (båda university of Würzburg) för kritisk korrekturläsning av manuskriptet. Denna studie stöddes av “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).

Materials

Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

References

  1. Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
  2. Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
  3. Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
  4. Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
  5. Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
  6. Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
  7. Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
  8. Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
  9. Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
  10. Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
  11. Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
  12. Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
  13. Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
  14. Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
  15. Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
  16. Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
  17. Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
  18. Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
  19. Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
  20. Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
  21. Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  23. Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
  24. Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
  25. Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
  26. Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
  27. Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
  28. Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
  29. Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
  30. Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).

Play Video

Cite This Article
Marsell, A., Fröschel, C. Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms. J. Vis. Exp. (181), e63446, doi:10.3791/63446 (2022).

View Video