Inokuleringsstrategier för att infektera växtrötter med jordburna mikroorganismer
Summary
Detta protokoll presenterar en detaljerad sammanfattning av strategier för att inokulera växtrötter med jordburna mikrober. Exemplifierat för svamparna Verticillium longisporum och Verticillium dahliae beskrivs tre olika rotinfektionssystem. Potentiella tillämpningar och möjliga nedströmsanalyser lyfts fram, och fördelar eller nackdelar diskuteras för varje system.
Abstract
Rhizosfären hyser ett mycket komplext mikrobiellt samhälle där växtrötterna ständigt utmanas. Rötter är i nära kontakt med en mängd olika mikroorganismer, men studier av jordburna interaktioner ligger fortfarande bakom de som utförs på ovanjordiska organ. Även om vissa ympningsstrategier för att infektera modellväxter med modellrotpatogener beskrivs i litteraturen, är det fortfarande svårt att få en omfattande metodologisk översikt. För att ta itu med detta problem beskrivs tre olika rotinokuleringssystem exakt som kan tillämpas för att få insikt i biologin hos rot-mikrobinteraktioner. Som illustration användes Verticillium-arter (nämligen V. longisporum och V. dahliae) som rotinkräktande modellpatogener. Metoderna kan emellertid enkelt anpassas till andra rotkoloniserande mikrober – både patogena och fördelaktiga. Genom att kolonisera växten xylem uppvisar vaskulära jordburna svampar som Verticillium spp. en unik livsstil. Efter rotinvasion sprids de via xylemkärlen akropetalt, når skottet och framkallar sjukdomssymtom. Tre representativa växtarter valdes som modellvärdar: Arabidopsis thaliana, ekonomiskt viktig raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum). Steg-för-steg-protokoll ges. Representativa resultat av patogenicitetsanalyser, transkriptionsanalyser av markörgener och oberoende bekräftelser av reporterkonstruktioner visas. Vidare diskuteras fördelarna och nackdelarna med varje ympningssystem grundligt. Dessa beprövade protokoll kan hjälpa till att tillhandahålla metoder för forskningsfrågor om rot-mikrobinteraktioner. Att veta hur växter klarar av mikrober i jorden är avgörande för att utveckla nya strategier för att förbättra jordbruket.
Introduction
Naturliga jordar är bebodda av ett häpnadsväckande antal mikrober som kan vara neutrala, skadliga eller fördelaktiga för växter1. Många växtpatogener är jordburna, omger rötterna och attackerar det underjordiska organet. Dessa mikroorganismer tillhör en mängd olika klader: svampar, oomyceter, bakterier, nematoder, insekter och vissa virus 1,2. När miljöförhållandena gynnar infektion kommer mottagliga växter att bli sjuka och avkastningen minskar. Effekterna av klimatförändringarna, såsom den globala uppvärmningen och extrema väderförhållanden, kommer att öka andelen jordburna växtpatogener3. Därför kommer det att bli allt viktigare att studera dessa destruktiva mikrober och deras inverkan på livsmedels- och foderproduktionen, men också på naturliga ekosystem. Dessutom finns det mikrobiella mutualister i jorden som tätt interagerar med rötter och främjar växttillväxt, utveckling och immunitet. När de konfronteras med patogener kan växter aktivt rekrytera specifika motståndare i rhizosfären som kan stödja värdöverlevnad genom att undertrycka patogener 4,5,6,7. Mekanistiska detaljer och vägar som är involverade i fördelaktiga rot-mikrobinteraktioner är emellertid ofta fortfarande okända6.
Det är därför viktigt att utöka den allmänna förståelsen av rot-mikrobinteraktioner. Tillförlitliga metoder för att inokulera rötter med jordburna mikroorganismer är nödvändiga för att utföra modellstudier och överföra resultaten till jordbruksapplikationer. Gynnsamma interaktioner i jorden studeras till exempel med Serendipita indica (tidigare känd som Piriformospora indica), kvävefixerande Rhizobium spp. eller mykorrhizala svampar, medan kända jordburna växtpatogener inkluderar Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. och Verticillium spp.1. De två senare är svampsläkten som är globalt fördelade och orsakar kärlsjukdomar2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan infektera hundratals växtarter – till stor del dikotyledoner, inklusive örtartade ettåriga, träiga stauder och många grödor 2,8. Hyfer av Verticillium kommer in i roten och växer både intercellulärt och intracellulärt mot den centrala cylindern för att kolonisera xylemkärlen 2,9. I dessa kärl förblir svampen under större delen av sin livscykel. Eftersom xylemsaften är näringsfattig och bär växtförsvarsföreningar måste svampen anpassa sig till denna unika miljö. Detta åstadkoms genom utsöndring av koloniseringsrelaterade proteiner som gör det möjligt för patogenen att överleva i sin värd10,11. Efter att ha nått rotvaskulaturen kan svampen spridas inom xylemkärlen akropetalt till lövverket, vilket leder till systemisk kolonisering av värden 9,12. Vid denna tidpunkt påverkas växten negativt i tillväxt 9,10,13. Till exempel förekommer stunting och gula löv samt för tidig senescens 13,14,15,16.
En medlem av detta släkte är Verticillium longisporum, som är mycket anpassad till brassicaceous värdar, såsom den agronomiskt viktiga oljeväxtrapsen, blomkålen och modellväxten Arabidopsis thaliana12. Flera studier kombinerade V. longisporum och A. thaliana för att få omfattande insikter i jordburna kärlsjukdomar och de resulterande rotförsvarssvaren 13,15,16,17. Enkel känslighetstestning kan realiseras genom att använda V. longisporum / A. thaliana modellsystem och väletablerade genetiska resurser är tillgängliga för båda organismerna. Nära besläktad med V. longisporum är patogenen Verticillium dahliae. Även om båda svamparterna utför en liknande vaskulär livsstil och invasionsprocess, är deras förökningseffektivitet från rötter till löv och de framkallade sjukdomssymtomen i A. thaliana olika: medan V. longisporum vanligtvis inducerar tidig senescens, resulterar V. dahliae-infektion i vissnande18. Nyligen presenterade en metodologisk sammanfattning olika rotinokuleringsstrategier för att infektera A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, vilket hjälpte till att planera experimentella inställningar19. På fältet orsakar V. longisporum ibland betydande skador i rapsproduktion12, medan V. dahliae har ett mycket brett värdområde som omfattar flera odlade arter, såsom vinrankor, potatis och tomat8. Detta gör båda patogenerna ekonomiskt intressanta modeller att studera.
Således använder följande protokoll både V. longisporum och V. dahliae som modellrotpatogener för att exemplifiera möjliga metoder för rotinokulationer. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum) valdes som modellvärdar. Detaljerade beskrivningar av metoderna finns i texten nedan och den medföljande videon. Fördelar och nackdelar för varje ympningssystem diskuteras. Sammantaget kan denna protokollsamling hjälpa till att identifiera en lämplig metod för specifika forskningsfrågor i samband med rot-mikrobinteraktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av de enorma avkastningsförluster som orsakas av jordburna fytopatogener1 krävs en förbättring av jordbruksstrategier eller grödor. Den begränsade insikten i patogenesen av jordburna sjukdomar hindrar utvecklingen av mer resistenta växter. Underliggande patomekanismer måste undersökas, för vilka en robust metodologisk plattform krävs. Rapporterade inokuleringsförfaranden har visat att multifaktoriella händelser i rot-mikrobinteraktioner kan dissekeras väl genom att kombiner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Tim Iven och Jaqueline Komorek för tidigare arbete med dessa metoder, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institutionen för farmaceutisk biologi, Universitetet i Würzburg, Tyskland) för att tillhandahålla den utrustning och de resurser som behövs för detta arbete, och Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (båda university of Würzburg) för kritisk korrekturläsning av manuskriptet. Denna studie stöddes av “Deutsche Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
