Summary
Isolering av tungmetallresistente mikrober fra geotermiske fjærer er et hett tema for utvikling av bioremediering og miljøovervåking av biosystemer. Denne studien gir en metodisk tilnærming for å isolere og identifisere tungmetalltolerante bakterier fra varme kilder.
Abstract
Geotermiske kilder er rike på ulike metallioner på grunn av samspillet mellom stein og vann som foregår i den dype akviferen. Videre, på grunn av sesongvariasjon i pH og temperatur, observeres svingninger i elementsammensetning periodisk i disse ekstreme miljøene, og påvirker de miljømessige mikrobielle samfunnene. Extremophilic mikroorganismer som trives i vulkanske termiske ventiler har utviklet motstandsmekanismer for å håndtere flere metallioner som er tilstede i miljøet, og dermed ta del i komplekse metallbiogeokjemiske sykluser. Videre har ekstrememofile og deres produkter funnet et omfattende fotfeste i markedet, og dette gjelder spesielt for deres enzymer. I denne sammenhengen er karakteriseringen funksjonell for utvikling av biosystemer og bioprosesser for miljøovervåking og bioremediering. Til dags dato representerer isolasjon og dyrking under laboratorieforhold av ekstremofile mikroorganismer fortsatt en flaskehals for fullt ut å utnytte sitt bioteknologiske potensial. Dette arbeidet beskriver en strømlinjeformet protokoll for isolering av termofile mikroorganismer fra varme kilder samt deres genotypiske og fenotypiske identifikasjon gjennom følgende trinn: (1) Prøvetaking av mikroorganismer fra geotermiske steder ("Pisciarelli", et vulkansk område av Campi Flegrei i Napoli, Italia); (2) Isolering av tungmetallresistente mikroorganismer; (3) Identifisering av mikrobielle isolasjoner; (4) Fenotypisk karakterisering av isolasjonene. Metodene beskrevet i dette arbeidet kan generelt brukes også for isolering av mikroorganismer fra andre ekstreme miljøer.
Introduction
De ekstreme miljøene på planeten vår er utmerkede kilder til mikroorganismer som er i stand til å tolerere tøffe forhold (dvs. temperatur, pH, saltholdighet, trykk og tungmetaller)1,2, er Island, Italia, USA, New Zealand, Japan, Sentral-Afrika og India, de best anerkjente og studerte vulkanske områdene 3,4,5,6,7,8,9 . Termofile har utviklet seg i tøffe miljøer i en rekke temperaturer fra 45 °C til 80 °C 10,11,12. Termofile mikroorganismer, enten som tilhører de arkaeale eller bakterielle kongedømmene, er et reservoar for studiet av biologisk mangfold, fylogenesis og produksjon av eksklusive biomolekyler for industrielle applikasjoner 13,14,15,16. Faktisk har den kontinuerlige industrielle etterspørselen i det globale markedet i de siste tiårene oppmuntret til utnyttelse av ekstreme og termozymer for sine diversifiserte applikasjoner i flere bioteknologiske felt 17,18,19.
Varme kilder, hvor organismer lever i konsortier, er rike kilder til biologisk mangfold, og representerer dermed et attraktivt habitat for å studere mikrobiell økologi20,21. Videre koloniseres disse vulkanske metallrike områdene ofte av mikroorganismer som har utviklet toleransesystemer for å overleve og tilpasse seg tilstedeværelsen av tungmetaller22,23 og er derfor aktivt involvert i deres biogeokjemiske sykluser. I dag anses tungmetaller som prioriterte miljøgifter for mennesker og miljø. De tungmetallresistente mikroorganismer er i stand til å løse og utfelle metaller ved å transformere dem og ombygge økosystemene sine24,25. Forståelsen av de molekylære mekanismene for tungmetallresistens er et hett tema for å utvikle nye grønne tilnærminger 26,27,28. I denne sammenhengen representerer oppdagelsen av nye tolerante bakterier utgangspunktet for å utvikle nye strategier for miljøbioremediering24,29. I samarbeid med arbeidet med å utforske hydrotermale miljøer gjennom mikrobiologiske prosedyrer og øke kunnskapen om genets rolle(er) som understøtter tungmetalltoleranse, ble det gjennomført en mikrobiell screening i varme kilder i Campi Flegrei i Italia. Dette tungmetallrike miljøet viser en kraftig hydrotermisk aktivitet, fumarol og kokende bassenger, variabel i pH og temperatur i avhengighet av sesongmessighet, nedbør og underjordiske geologiske bevegelser30. I dette perspektivet beskriver vi en lett anvendelig og effektiv måte å isolere bakterier som er resistente mot tungmetaller, for eksempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (navngitt som isolat 1) og Alicyclobacillus mali FL1832 (navngitt som isolat 2) fra Pisciarelli-området i Campi Flegrei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetaking av mikroorganismer fra geotermiske steder
- Velg stedet for prøvetaking ved bruk som kriteriumssteder med ønsket temperatur og pH. Mål de fysiske parametrene gjennom en digital termokoblingssonde, og sett den inn i de valgte bassengene eller gjørmene.
- Samle 20 g jordprøver (i dette tilfellet fra gjørme i det hydrotermale stedet Pisciarelli Solfatara), og plukk dem opp med en sterilisert skje. Ta minst to prøver for hvert valgte område.
- Sett prøvene i 50 ml sterile polypropylenrør og lukk umiddelbart.
- Mål pH og temperatur med en digital termokoblingssonde ved å sette den direkte inn på prøvetakingsstedet. Skyll sonden forsiktig med deionisert vann etter bruk.
2. Isolering av tungmetallresistente mikroorganismer
MERK: Utfør trinn 2.1-2.7 under en steril biologisk hette.
- Inokuler 2 g av hver innsamlede prøve i 50 ml nytilberedt Luria-Bertani medium (LB), der pH er justert til 4 eller 7 gjennom tillegg av HCl eller NaOH.
- Inkuber prøvene ved samme temperatur på prøvetakingsstedet og ved ±5 °C (55 °C og 60 °C for Pisciarelli-prøver) i en temperaturkontrollert orbital shaker i 24 timer med en ristingshastighet på 180 o/min.
- Plate 200 μL av de dyrkede prøvene på LB agar (pH 4 eller pH 7) og inkuberes i statisk tilstand i 48 timer ved 55 °C eller 60 °C.
- Isoler enkeltkolonier og gjenta strek-plating sykluser (trinn 2.3 og 2.4) minst tre ganger.
- For å forberede -80 °C frosne cellelagre, vokse kulturene over natten (ON) og legge til de voksne cellene 20% glyserol (i et siste volum på 1 ml); bruk en blanding av aceton og tørris for rask frysing.
- For å forberede et inokulum fra en glyserolbestand, inokuler 50 μL i 50 ml LB (pH 4 eller pH 6) og inkubere ved 55 °C eller 60 °C i orbital shaker ved 180 o/min PÅ.
- For å oppnå en vekstprofil, fortynn en prekultur (hentet fra trinn 2,6) til 0,1 OD600 nm i 10 ml LB (pH 4 eller pH 6), vokse cellene ved 55 °C eller 60 °C i 16 timer i orbital shaker, og mål OD600 nm ved 30 min intervaller.
- Lag en vekstkurve fra dataene som er hentet i trinn 2.7 med tid (min) på X-akse og OD600 nm på Y-aksen.
- Realiser den samme vekstkurven som er beskrevet i trinn 2.7 og 2.8, men variere pH (± 1 enhet) av kulturmediet (f.eks. pH 3 og 5 for prøver dyrket ved pH 4) for å bestemme optimal pH for laboratorieforhold.
3. Identifisering av mikrobielle isolasjoner
- Fremstilling av genomisk DNA
- Inokuler isolasjonen som er strødd fra glyserolbestanden i 50 ml LB-medium (pH 4 eller pH 6) og vokse i en orbital shaker ved 55 °C eller 60 °C ved 180 o/min PÅ.
- Høst ON-kulturen ved sentrifugering i 10 min ved 5000 x g. Kast supernatanten.
- Forbered 10 ml bakterier lysis buffer sammensatt av: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100 og lysozym (20 mg / ml) umiddelbart før bruk.
- Resuspend pellet i 180 μL av bakterier lysis buffer. Inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Følg retningslinjene som er angitt av et genomisk DNA-rensesett (materialfortegnelse) for å trekke ut genomisk DNA.
- Kvantifisere det ekstraherte genomiske DNA-et og dets renhet ved UV-Vis-måling. For renhet bestemme forhold-OD 260/280 nm og OD 260/230 nm.
- Vurder integriteten til det genomiske DNA ved å laste 200 ng av hver prøve på en 0,8% agarose gel og sammenligne størrelsesfordelingen med en høyvekts molekylær markør.
- Provisjon til en ekstern tjeneste 16S rRNA fragmentforberedelse, sekvensering og komparativ analyse av sekvensen oppnådd (1000 bp) med de som er tilstede i nukleotiddatabasen til US National Center for Biotechnology Information (NCBI)33.
- For å bekrefte data fra 16S rRNA-sekvensering, utfør også automatisert ribotyping på det fordøyde kromosomale DNA-et (ekstern tjeneste, materialfortegnelse).
- I tilfelle der specie-identifikasjonen ikke bare kan bestemmes med ribotypingsdata, må du bestille en MALDI-TOF MS-analyse for fettsyreidentifikasjon.
- For å utføre en fylogenetisk analyse av slekten identifisert, analyser 16S rRNA-sekvensen av isolasjonen med BLASTn34. Sekvenser med identiteter fra 99 % til 97 % må brukes til å bygge en justering med flere sekvenser ved hjelp av CLUSTAL Omega35. Konstruer et nabotre ved hjelp av standardalternativet ClustalW2 (Simple Phylogeny).
4. Tungmetaller og antibiotika mottakelighet
- Inokuler isolen fra et glyserollager (se trinn 2.5) og vokse den i 200 ml LB under de optimale pH- og temperaturforholdene som tidligere er bestemt.
- Fortynn hver prekultur ved 0,1 OD600 nm i 5 ml LB-medium (ved riktig pH) som inneholder økende konsentrasjoner av tungmetaller. Konsentrasjonene varierer fra 0,01-120 mM for tungmetaller [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] eller 0,5-1 mg/ml for antibiotika [Ampicillin, Bacitracin, Kloramfenikol, Ciprofloxacin, Erytromycin, Kanamycin, Streptomycin, Tetracyklin og Vancomycin].
- Utfør tungmetall- og antibiotikabehandlinger separat. Bruk et 50 ml polypropylenrør og utvid cellene i en temperaturkontrollert orbital shaker med en ristingshastighet på 180 o/min ved 55 °C eller 60 °C i 16 timer for hver tilstand/behandling.
- Beregn minimum hemmende konsentrasjon (MIC) enten for antibiotika eller tungmetaller ved å identifisere konsentrasjonsverdiene i rørene der mikrobiell vekst ikke forekommer, det vil si å bestemme verdiene som fullstendig hemmer celleveksten etter 16 timer.
- Kontroller at konsentrasjonen er hemmende og ikke dødelig for cellene ved å plate 200 μL av kulturen som vokser til verdien som anses som MIC på LB-agarplater (ved riktig pH og temperatur) og verifisere tilstedeværelsen av kolonier etter ON inkubasjon.
MERK: Siden kulturen på LB agarplaten bare er levedyktig ved 4 °C i noen uker, for å bevare isolasjonene i lengre tid, ble glyserollagrene tilberedt og lagret ved -80 °C. For MIC-bestemmelse ble minst tre uavhengige replikeringer ved hjelp av uavhengige kulturer utført. Standardavviket ble beregnet blant triplikatforsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøveområde
Denne protokollen illustrerer en metode for isolering av tungmetallresistente bakterier fra en varm kilde. I denne studien ble Pisciarelli-området, et syresulfisk geotermisk miljø, brukt som prøvetakingssted (figur 1). Dette økosystemet er preget av strømmen av aggressive svovelholdige væsker avledet fra vulkanske aktiviteter. Det har vist seg at de mikrobielle samfunnene i syre-sulfidiske geotermiske systemer blir utsatt for ekstremt selektivt trykk laget av tilstedeværelsen av høye konsentrasjoner av tungmetaller. Prøvene ble samlet inn i to forskjellige perioder av året (april og september) fra 2,21 et gjørmebasseng marginalt med hensyn til et boblende gjørmebasseng. I gjørmebassenget ble det registrert svingninger i pH-verdiene (~pH 6 i april og ~pH 5 i september), mens temperaturen var ~55 °C i begge tilfeller. Imidlertid ble det også registrert høyere temperaturer i gjørmebassenget (~ 70 °C) i andre år32.
Isolasjon og identifikasjon
De innsamlede prøvene ble inokulert i LB medium og inkubert i 24 timer ved 55 °C og 60 °C som rapportert tidligere, og dermed satt laboratorieforholdene for veksten av celleprøvene for å etterligne de miljøkjemiske fysiske forholdene. For å favorisere cellevekst ble enkeltkolonier strødd på platen og isolert etter flere fortynninger (minst 3) i et rikt flytende medium; de isolerte stammene viste optimal veksttemperatur ved 55 °C og 60 °C (figur 2). For å identifisere de nye isolasjonene ble det utført et genomisk DNA-preparat og 16S rRNA-sekvensering og fettsyrer massespektrometrianalyse ble oppnådd som en ekstern tjeneste. Som rapportert er analysen av fettsyrene en kraftig bioanalytisk metode som hjelper til med presis identifisering av bakterier når den kombineres med andre tilnærminger36. Flere justeringer av 16S rRNA ble brukt til å bygge det fylogenetiske treet for å identifisere de nærmeste slektningene37.
Test av tungmetallfølsomhet
Sameksistensen av giftige molekyler karakteriserer solfatariske miljøer. Spesielt er varme kilder i Pisciarelli preget av høye nivåer av CO2, H2S, NH4 i sameksistens med As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Av denne grunn ble det utført en fenotypisk karakterisering av de isolerte mikroorganismer i nærvær av en økende konsentrasjon av tungmetaller, som rapportert i tabell 1. Interessant nok viste isolering 1 høyere toleranse for As(V) og V(V). Den høye motstanden mot både arsenat og vanadate kan skyldes deres kjemiske strukturer; Faktisk er begge ionene lik fosfationene, noe som tyder på at V (V) og As (V) kan tas opp av celler gjennom fosfattransportsystemer. Disse isolasjonene viste seg også å være motstandsdyktige mot Cd(II), selv om MIC-verdien var relativt lav. Dette resultatet kan forklares med fraværet av Cd(II) i utvalget. Selv om de to mikroorganismer ble samplet på samme sted, viste de forskjellige heavy metal-motstandsprofiler. Imidlertid ble de samplet i forskjellige perioder, og pekte dermed på den sesongavhengige variasjonen i tungmetallkonsentrasjonen som den viktigste drivkraften som former sammensetningen av mikrobielle samfunn og deres differensialmotstand mot tungmetaller39. Fra disse komparative dataene har det vist seg at isoler 1 har en sterk motstand mot As(V), mens isoler 2 for As(III). Ytterligere genetiske undersøkelser er nødvendig for å avdekke molekylære motstandsmekanismer og bedre forstå hvordan fenotypene påvirkes av det selektive trykket fra varme kilder.
Antibiotikaresistens tester
De mikrobielle stammene utviklet seg i ekstreme miljøer viser vanligvis motstand mot forskjellige antibiotika. Sammenhengen mellom tungmetallresistens og antibiotika er velkjent40. Av denne grunn testet vi resistensen mot antibiotika for begge isolasjoner (tabell 2). Isoler 1 viste høy følsomhet for alle testede antibiotika, selv når lave konsentrasjoner ble brukt. I motsetning er isoler 2 resistent mot alle antibiotika testet, med unntak av kloramfenikol og tetracyklin. Interessant nok var de bestemte MIC-verdiene mot ampicillin, erytromycin, kanamycin, streptomycin og vancomycin sammenlignbare med andre antibiotikaresistente bakterier og enda høyere for bacitracin og ciprofloxacin41. Disse fascinerende dataene fortjener videre undersøkelser; sannsynligvis, på grunn av tilfeldige mutasjoner eller horisontal genoverføring, har mikroorganismen fått antibiotikaresistens, noe som kan representere en selektiv fordel under slike ekstreme miljøforhold.
Figur 1. Prøvetakingssted: solfatarisk område i Pisciarelli, Campi Flegrei (Napoli, Italia). Prøvetakingsstedet ligger på 40° 49' 45,3" N - 14° 08' 49,9 E, i det geotermiske området Pisciarelli fumarole. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Skjematisk representasjon av den eksperimentelle prosedyren. Mikroorganismer prøves i varme kilder, dyrkes i laboratoriet, isoleres gjennom gjentatt striper og plating, og genotypisk identifisert ved 16S rRNA-sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Metallioner | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Som (III) | 1,9 mM | 41 mM |
| Som (V) | 117 mM | 11 mM |
| CD (II) | 0,9 mM | 0,8 μM |
| Co (II) | 2 mM | 3 mM |
| Co (III) | 2,75 mM | n.a. |
| Cr (VI) | 0,25 mM | n.a. |
| Cu (II) | 4,1 mM | 0,5 mM |
| Hg (II) | 20 μM | 17 μM |
| Ni (II) | 1,3 mM | 30 mM |
| V (V) | 128 mM | n.a |
Tabell 1. MIC-verdier mot tungmetallioner av isolasjonene. MICer betraktes som de minimale konsentrasjonsverdiene som fullstendig hemmer celleveksten etter 16 timer; verdiene rapporteres som gjennomsnitt av tre eksperimenter.
| Antibiotika | Isoler 1 | Isoler 2 |
| Ampicillin | n.d. | 20 μg/ml |
| Bacitracin | n.d. | 700 μg/ml |
| Kloramfenikol | n.d. | <0,5 μg/ml |
| Ciprofloxacin | n.d. | >1 mg/ml |
| Erythromycin | n.d. | 70 μg/ml |
| Kanamycin | n.d. | 80 μg/ml |
| Streptomycin | n.d. | 70 μg/ml |
| Tetracycline | n.d. | <0,5 μg/ml |
| Vancomycin | n.d. | 1 μg/ml |
Tabell 2. MIC-verdier mot antibiotika av isolasjonene. MICer betraktes som de minimale konsentrasjonene som fullstendig hemmer celleveksten etter 16 timer; verdiene rapporteres som gjennomsnitt av tre eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varme kilder inneholder et uutnyttet mangfold av mikrobiomer med like variert metabolsk kapasitet12. Utviklingen av strategier for isolering av mikroorganismer som effektivt kan konvertere tungmetaller til mindre giftige forbindelser10 representerer et forskningsområde av økende interesse over hele verden. Dette dokumentet tar sikte på å beskrive en strømlinjeformet tilnærming for screening og isolering av mikrober med evnen til å motstå giftige kjemikalier. Metoden som beskrives kan enkelt modifiseres for å isolere mikrober fra forskjellige miljøkilder som vann, mat, jord eller sediment. Imidlertid er det noen begrensninger i denne teknikken relatert til avhengigheten av mikrobiell dyrking. Derfor vil dette oppsettet ikke være egnet for å isolere bakterier fra et miljø som ikke er lett å dyrke. En måte å løse dette problemet på er å bruke forskjellige bakterielle medier (dvs. selektive medier eller pre-tilpasningsstrategier) og lengre inkubasjonstider42.
Likevel forventes det at flertallet av arter av interesse for bioremediering vil vokse under forholdene som er beskrevet her. Denne protokollen har noen fordeler i forhold til tradisjonelle plating teknikker, vurderer at selektive agar media for kjemikalier er ukjent så langt. Bruken av MIC for å identifisere resistente mikrober er en rask strategi som skal utnyttes på individuelle isolasjoner som åpner veien for karakterisering av nye arter eller nye stammer. Denne studien viser nytten av en slik metode for å velge miljømikroorganismer som kan bidra til effektiv bioremediering ved å inaktivere miljøgiftene og konvertere dem til ufarlige produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 og av GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Vi takker Dr. Monica Piochi og Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) for identifisering og karakterisering av geotermisk sted.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , Springer. Dordrecht. (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , Elsevier, Academic Press. 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma'in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -M., Apostol, L. -C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , Springer. Cham. 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G.
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
