Summary
DNA-gardin, en billeddannelsesteknik med højt gennemløb, giver en platform til visualisering i realtid af forskellige protein-DNA-interaktioner. Den nuværende protokol anvender DNA-gardinteknikken til at undersøge den biologiske rolle og molekylære mekanisme af Abo1, en Schizosaccharomyces pombe bromdomæne-indeholdende AAA + ATPase.
Abstract
Kromatin er en højere ordens struktur, der pakker eukaryot DNA. Kromatin gennemgår dynamiske ændringer i henhold til cellecyklusfasen og som reaktion på miljømæssige stimuli. Disse ændringer er afgørende for genomisk integritet, epigenetisk regulering og DNA-metaboliske reaktioner såsom replikation, transkription og reparation. Kromatinsamling er afgørende for kromatindynamik og katalyseres af histonchaperoner. På trods af omfattende undersøgelser forbliver de mekanismer, hvormed histonchaperoner muliggør kromatinsamling, undvigende. Desuden er de globale træk ved nukleosomer organiseret af histonchaperoner dårligt forstået. For at løse disse problemer beskriver dette arbejde en unik enkeltmolekyle billeddannelsesteknik ved navn DNA-gardin, som letter undersøgelsen af de molekylære detaljer af nukleosomsamling af histonchaperoner. DNA-gardin er en hybridteknik, der kombinerer lipidfluiditet, mikrofluidik og total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) for at give en universel platform til realtidsbilleddannelse af forskellige protein-DNA-interaktioner. Ved hjælp af DNA-gardin undersøges histonchaperonfunktionen af Abo1, Schizosaccharomyces pombe bromdomæne-indeholdende AAA + ATPase, og den molekylære mekanisme, der ligger til grund for histonsamling af Abo1, afsløres. DNA-gardin giver en unik tilgang til at studere kromatindynamik.
Introduction
Eukaryot DNA pakkes i en højere ordens struktur kendt som kromatin 1,2. Nukleosom er den grundlæggende enhed af kromatin, som består af ca. 147 bp DNA viklet rundt om de oktameriske kernehistoner 3,4. Kromatin spiller en kritisk rolle i eukaryote celler; for eksempel beskytter den kompakte struktur DNA mod endogene faktorer og eksogene trusler5. Kromatinstrukturen ændres dynamisk i henhold til cellecyklusfasen og miljømæssige stimuli, og disse ændringer styrer proteinadgang under DNA-transaktioner såsom replikation, transkription og reparation6. Kromatindynamik er også vigtig for genomisk stabilitet og epigenetisk information.
Kromatin reguleres dynamisk af forskellige faktorer, herunder histonhalemodifikationer og kromatinarrangører såsom kromatinremodeller, polycombgruppeproteiner og histonchaperoner7. Histonchaperoner koordinerer samling og demontering af nukleosomer via aflejring eller frigørelse af kernehistoner 8,9. Defekter i histonchaperoner inducerer genomstabilitet og forårsager udviklingsforstyrrelser og kræft 9,10. Forskellige histonchaperoner behøver ikke kemisk energiforbrug som ATP-hydrolyse for at samle eller adskille nukleosomer 9,11,12,13. For nylig rapporterede forskere, at bromdomæneholdige AAA + (ATPase forbundet med forskellige cellulære aktiviteter) ATPaser spiller en rolle i kromatindynamikken som histonchaperoner 14,15,16,17. Human ATAD2 (ATPase-familie AAA-domæneholdigt protein 2) fremmer kromatintilgængelighed for at forbedre genekspression18. Som transkriptionel co-regulator regulerer ATAD2 kromatin af onkogene transkriptionelle faktorer14, og overekspressionen af ATAD2 er relateret til dårlig prognose i mange typer kræft19. Yta7, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homolog af ATAD2, nedsætter nukleosomdensitet i kromatin15. I modsætning hertil øger Abo1, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homolog af ATAD2, nukleosomtæthed16. Ved hjælp af en unik enkeltmolekyle-billeddannelsesteknik adresseres DNA-gardin, uanset om Abo1 bidrager til nukleosomsamling eller demontering17,20.
Traditionelt er biomolekylernes biokemiske egenskaber blevet undersøgt ved bulkeksperimenter såsom elektroforetisk mobilitetsskiftassay (EMSA) eller co-immunudfældning (co-IP), hvor et stort antal molekyler undersøges, og deres gennemsnitlige egenskaber karakteriseres21,22. I bulkeksperimenter er molekylære understater sløret af ensemble-gennemsnitseffekten, og sondering af biomolekylære interaktioner er begrænset. I modsætning hertil omgår enkeltmolekyleteknikker begrænsningerne ved bulkeksperimenter og muliggør detaljeret karakterisering af biomolekylære interaktioner. Især er billeddannelsesteknikker med et enkelt molekyle blevet anvendt i vid udstrækning til at studere DNA-protein- og protein-proteininteraktioner23. En sådan teknik er DNA-gardin, en unik enkeltmolekylebilleddannelsesteknik baseret på mikrofluidik og total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRFM)24,25. I et DNA-gardin er hundredvis af individuelle DNA-molekyler forankret til lipiddobbeltlaget, hvilket tillader todimensionel bevægelse af DNA-molekyler på grund af lipidfluiditet. Når hydrodynamisk strømning påføres, bevæger DNA-molekyler sig langs strømmen på dobbeltlaget og sidder fast ved en diffusionsbarriere, hvor de justeres og strækkes. Mens DNA farves med interkalerende midler, injiceres fluorescerende mærkede proteiner, og TIRFM bruges til at visualisere protein-DNA-interaktioner i realtid på et enkeltmolekyleniveau23. DNA-gardinplatformen letter observationen af proteinbevægelser såsom diffusion, translokation og kollision 26,27,28. Desuden kan DNA-gardin bruges til proteinkortlægning på DNA med definerede positioner, orienteringer og topologier eller anvendes til undersøgelse af faseseparation af protein og nukleinsyrer 29,30,31.
I dette arbejde bruges DNA-gardinteknikken til at tilvejebringe bevis for chaperonernes funktion gennem direkte visualisering af specifikke proteiner. Da DNA-gardin desuden er en platform med høj kapacitet, letter det en grad af dataindsamling, der er tilstrækkelig til statistisk pålidelighed. Her beskrives det, hvordan man udfører DNA-gardinassay i detaljer for at undersøge den molekylære rolle af S. pombe bromdomæne-indeholdende AAA+ ATPase Abo1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af flowcellen
- Forbered et renset smeltet silicaobjektglas indeholdende nano-grøftmønstre efter tidligere offentliggjort rapport25.
- Bor to huller med en diameter på 1 mm i et renset smeltet silicaglas (figur 1A) ved hjælp af et diamantbelagt bor (se materialetabellen).
- Afsæt 250 nm tykt aluminium (Al) på objektglasset ved hjælp af DC-sputter32 (se materialetabel) med 10 mTorr argongas.
- Spin-coat et 310 nm tykt lag af 4% 950K poly(methylmethacrylat) (PMMA) (se tabel over materialer) ved 4.000 rpm i 1 min og bages på en varm plade ved 180 °C i 3 min.
- Tegn nano-grøftmønstrene på PMMA-laget mellem de to huller ved hjælp af elektronstrålelitografi33 med 0,724 nA strøm ved 80 kV.
BEMÆRK: Nanogravmønstrenes arkitektur og dimensioner er vist i figur 1A. - Den stråleeksponerede PMMA fjernes ved at lægge objektglassene i blød i udviklingsopløsningen (forholdet 1:3 methylisobutylketon og isopropanol, se materialetabellen) i 2 minutter.
- Ætsning af Al-lag med induktivt koblet plasmareaktiv ionætsning (ICP-RIE) ved anvendelse af klor (Cl2) og bortrichloridgasser (BCl3).
BEMÆRK: Disse to gasser kan fjerne Al fra stråleudsatte områder. - Skær nano-skyttegrave på diasene ved hjælp af svovltetrafluorid (SF4), tetrafluormethan (CF4) og ilt (O2) gasser (se tabel over materialer).
- Fjern det resterende Al-lag ved at lægge lysbillederne i blød i Al etchant (AZ 300 MIF-udvikler, se materialetabel) i 10 min.
- Efter fremstillingen skylles diasene med deioniseret vand og sonikeres i acetone i 30 minutter ved hjælp af en bad-type sonikator.
- Rengør objektglassene i 2% Hellmanex III-opløsning (se materialetabel) i mindst 1 dag under magnetisk omrøring.
- Sonikere diasene i acetone i 30 min og 1 M NaOH i 30 min successivt.
- Skyl objektglassene med deioniseret vand og tør med en nitrogengas (N2).
- Sæt et rent papir (5 mm x 35 mm) på midten af dobbeltklæbende tape. Fastgør båndet over diaset for at dække de to huller og nanomønstrene med papiret.
- Punktafgifter papiret med et rent blad (figur 1A).
- Sæt et glasdæksel oven på den dobbeltsidede tape, og gnid dæksedlen ved hjælp af en pipettespids for at danne et mikrofluidisk kammer (figur 1A).
- Placer den samlede flowcelle mellem to mikroskopglas og klip dem.
- Bag flowcellen i en 120 °C vakuumovn i 45 min.
- Fastgør væskekonnektoren (Nanoport) til de chipbaserede analyser (se materialetabellen) til hvert åbent hul ved hjælp af en varm limpistol, og forbind de to linjer Luer-låserør.
- Tilslut en Luer lock sprøjte indeholdende 3 ml deioniseret vand og vask kammeret.
- Vask kammeret med 3 ml lipidbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,0 og 100 mM NaCl) via drop-by-drop-forbindelsen.
BEMÆRK: Drop-by-drop-forbindelse forbinder alle sprøjter til flowcellen for at undgå at injicere luftbobler i kammeret. - Injicer 1 ml 0,04x biotinyleret lipid i lipidbuffer i kammeret i to skud med 5 minutters inkubation pr. Skud.
BEMÆRK: Fremstilling af 1x biotinyleret lipidbestand er beskrevet i en tidligere offentliggjort rapport34. - Vask kammeret med 3 ml lipidbuffer og inkuber i 20 minutter, så lipiddobbeltlaget modnes på diasoverfladen.
- Der tilsættes 1 ml BSA-buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mMMgCl2 og 0,2 mg/ml BSA) og inkuberes i 5 minutter for at passivere diasoverfladen.
BEMÆRK: Dette trin kan reducere den uspecifikke binding af proteiner til glidefladen. - Injicer 0,025 mg/ml streptavidin i 1 ml BSA-buffer med to skud og 10 minutters inkubation pr. skud.
- Vask den resterende streptavidin ud med 3 ml BSA-buffer.
- Injicer ~ 300 pM (30 μL) biotinyleret lambdafag-DNA i 1 ml BSA-buffer i kammeret med to skud og 10 minutters inkubation pr. Skud.
BEMÆRK: Fremstilling af biotinyleret lambda-DNA er beskrevet i en tidligere offentliggjort rapport34.
2. Tilslutning af flowcelle til det mikrofluidiske system og indlæsning af det på mikroskopet
- Forbered Abo1-billedbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mMMgCl2, 1,6% glucose og 0,1x gloxy, se materialetabel).
BEMÆRK: Gloxy er et iltrensningssystem, der reducerer fotoblegning af fluorescerende farvestoffer. Fremstilling af 100x gloxy stock med glucoseoxidase og katalase er beskrevet i reference35. - Tilslut en sprøjte indeholdende 10 ml billedbuffer til en sprøjtepumpe, og fjern bobler i alle slangeledninger i det mikrofluidiske system.
- Sammenkæd den forberedte flowcelle med det mikrofluidiske system via drop-to-drop-forbindelse for at undgå bobleinjektion i flowcellen (figur 1B).
- Saml flowcelle- og flowcelleholderne, og monter enheden på et specialbygget TIRF-mikroskop (figur 1C).
FORSIGTIG: Når flowcellen sættes under mikroskopet, skal du omhyggeligt indstille objektivlinsens højde. Flowcellen må ikke berøre objektivlinsen. Dette kan beskadige linsen. - Drop indeks, der matcher olie på midten af flowcellen, og sæt et specialfremstillet dueprisme (se materialetabel) på oliedråben.
3. Histonsamling af Abo1 ved hjælp af DNA-gardin
- Bland 5 nM Abo1 og 12,5 nM Cy5-mærket H3-H4 histondimer (Cy5-H3-H4) (se materialetabel) i 150 μL billedbuffer. Alle proteiner blev fremstillet efter tidligere offentliggjort rapport17.
- Inkuber blandingen på is i 15 min.
BEMÆRK: For at undgå fotoblegning af Cy5 skal inkubationen ske i mørke. - Injicer ~ 20 pM (2 μL) YOYO-1-farvestof i billeddannelsesbuffer gennem en 100 μL prøvesløjfe for at plette lambda-DNA-molekyler.
- Kør billedbehandlingssoftware (se materialetabellen), og tænd 488 nm-laseren for at kontrollere, om DNA-gardinerne er velformede.
BEMÆRK: Hvis DNA-gardiner er velformede, vises DNA-molekylerne, der er farvet med YOYO-1, som justerede linjer ved en barriere i nærvær af strømning. De strakte linjer trækker sig tilbage og diffunderer væk fra barrieren, når strømmen er slukket. - Injicer 2 ml høj saltbuffer (200 mM NaCl og 40 mM MgCl2) for at fjerne YOYO-1 farvestof fra DNA.
- Når YOYO-1-farvestoffet er fjernet, injiceres den præinkuberede proteinprøve.
- Når proteinerne når DNA-gardinet, skal du slukke for sprøjtepumpen, slukke for afspærringsventilen og inkubere 15 minutter for histonpåfyldning med Abo1.
- De ubundne Abo1- og histonproteiner vaskes ud i 5 min.
- Tænd for afspærringsventilen, og genoptag flowinjektionen.
- Tænd 637 nm-laseren, og tag billeder af de fluorescerende proteiner, mens bufferstrømmen er tændt.
- Sluk midlertidigt bufferstrømmen for at kontrollere, om histonproteiner er indlæst på DNA (figur 2C).
- Indsaml DNA-gardinbilleder med et billedoptagelsesprogram (se materialetabel).
BEMÆRK: Når bufferstrømmen forbigående stopper, trækker DNA sig tilbage fra det evanescent felt med total intern refleksion, og fluorescerende mærkede proteiner bundet til DNA forsvinder.
4. Analyse af data
- Transformér de billeder, der er taget af billedoptagelsesprogrammet, til TIFF-format som billedsekvenser.
BEMÆRK: Alle data blev analyseret ved hjælp af billede J (NIH) som beskrevet i reference20. - Vælg et enkelt DNA-molekyle fra billedsekvenserne og tegn en kymograf.
BEMÆRK: Kymografen kan vise ændringen i fluorescensintensiteten af hvert histonprotein bundet til et enkelt DNA-molekyle som en funktion af tiden. - Opret fluorescensintensitetsprofilen fra kymografen, og tilpas den med flere gaussiske funktioner.
- Saml midterkoordinaterne for toppe fra fluorescensintensitetsprofilen. I dette trin kan den mindste intensitet af histonfluorescens opnås.
- Opdel alle spidsintensiteter indsamlet fra profilerne med minimumsintensitet. Antallet af H3-H4-dimerer bundet til DNA estimeres i dette trin.
- Udfør trin 4.2-4.5 for andre DNA-molekyler.
- Opret et histogram til bindingsfordeling af H3-H4-dimerer med 1 kbp binstørrelse. Antallet af analyserede molekyler er mindst 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbejde beskriver proceduren for flowcelleforberedelse til DNA-gardinassay (figur 1A). DNA-gardinassayet lettede undersøgelsen af histon H3-H4-dimersamling på DNA af Abo1. Først blev DNA-gardindannelse kontrolleret ved farvning af DNA-molekyler med YOYO-1, et interkalerende farvestof. Grønne linjer blev vist i parallelle arrays, hvilket indikerer, at YOYO-1 interkalerede i DNA-molekyler, som var veljusterede og strakte sig ved en diffusionsbarriere under hydrodynamisk strømning (figur 2A). For at udelukke muligheden for, at YOYO-1 forhindrer interaktionen mellem DNA- og histonproteiner, blev YOYO-1 fjernet fra DNA med en høj saltbuffer, før histonproteiner blev tilsat. Når Cy5-H3-H4-dimerer blev injiceret i DNA-gardinet i fravær af Abo1, bandt Cy5-H3-H4 ikke til DNA, hvilket indikerer mangel på spontan binding af H3-H4-dimerer til DNA (figur 2B). Når Cy5-H3-H4 blev injiceret med Abo1, blev rød fluorescerende punkteret set på DNA-molekyler, hvilket tyder på, at Abo1 indlæser H3-H4-dimerer på DNA (figur 2C). Bufferstrømmen blev forbigående slukket for at sikre, at Cy5-H3-H4-dimerer ikke binder til glidefladen, mens de binder til DNA. Når strømmen blev slukket, forsvandt fluorescerende mærkede proteiner bundet til DNA, fordi DNA-molekyler trak sig tilbage fra det evanescent felt. I modsætning hertil forblev proteiner adsorberet til overfladen de samme. De fluorescerende signaler forsvandt i fravær af strømning og dukkede op igen, da strømmen blev genoptaget, hvilket tyder på, at H3-H4-dimerer binder til DNA (figur 2C). Bindingen af H3-H4-dimerer til DNA blev også bekræftet af kymografen, hvor fluorescenssignalerne forsvandt, når strømmen blev slukket (figur 2D). Fordi Abo1 er en AAA+ ATPase, blev effekten af ATP-hydrolyse på histonbelastningsaktivitet af Abo1 undersøgt16. Få fluorescerende punkterede optrådte i DNA-gardinet enten i fravær af nukleotid (Apo) eller i nærvær af ADP (figur 2E), hvilket indikerer, at H3-H4-dimerer sjældent binder til DNA hverken i Apo-tilstand eller i nærvær af ADP. Figur 2F viser kvantitative analyser af figur 2B, C og figur 2E, der viser, at antallet af H3-H4-dimerer bundet til DNA stiger i nærvær af ATP. Resultaterne tyder på, at ATP-hydrolyse er afgørende for H3-H4-belastning på DNA af Abo1 (figur 2E, F).
Dernæst blev det testet, om Abo1 fortrinsvis indlæser histoner til Widom 601-sekvensen, som har en ti gange højere bindingsaffinitet til histoner end tilfældige sekvenser in vitro, selvom nukleosomer ikke har nogen specificitet for Widom 601-sekvensen in vivo 36,37,38,39,40. DNA-gardinet blev dannet med lambda-DNA, der indeholder Widom 601-gentagelser i den ene ende eller internt (figur 3A, B). Det bindende landskab af H3-H4-dimerer på hver DNA-konstruktion blev opnået (figur 3C, D). Bindingsplaceringen af Cy5-H3-H4 blev estimeret fra midterpositionen af 2D Gaussisk tilpasning for hvert fluorescerende punkt17,41. Hvis Abo1's H3-H4-belastningsaktivitet afhænger af DNA-sekvensen, vil bindingsfordelingen være skæv mod Widom 601-sekvensen. Figur 3C,D viser bindingsfordelingshistogrammerne for H3-H4-dimerer af Abo1 på lambda-DNA indeholdende Widom 601-gentagelser i henholdsvis slutningen (ti gentagelser) og internt (fem gentagelser). Der var ingen præferencebinding til de mange Widom 601-gentagelser, og bindingsfordelingen var tilfældig, hvilket tyder på, at Abo1 ikke har nogen præference for Widom 601-sekvensen, men i stedet indlæser H3-H4 på DNA på en sekvensuafhængig måde (figur 3C, D).
Figur 1: Klargøring af flowcelle. (A) Skemaer over flowcellesamling og DNA-gardinsystem. Det mikrofluidiske kammer kan dannes mellem et smeltet silicaglas og et glasdæksel, der sidder fast sammen med dobbeltsidet tape. Under den hydrodynamiske strømning i kammeret justeres en stor mængde lambda-DNA-molekyler ved en diffusionsbarriere (en nano-grøft her) på grund af fluiditeten af lipiddobbeltlaget og strækkes som et gardin. I den forstørrede visning af diffusionsbarrieren har nanograven savtandsmønstre med 1,5 μm stigning, 350 nm bredde og 1,4 μm dybde. B) Fotografi af det mikrofluidiske system bestående af en sprøjtepumpe, en afspærringsventil og en 6-vejs prøveinjektionsventil med en prøvesløjfe. (C) Billeder af diasholderkomponenter (venstre), samlingen af holdere og flowcelle (midten) og den fuldt monterede flowcelle monteret på et specialfremstillet TIRF-mikroskop (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visualisering af histonbelastning af Abo1 ved hjælp af enkeltmolekyle DNA-gardin. (A) Billede af DNA-gardin, hvor DNA-molekyler farvet med YOYO-1 (grøn) er godt justeret ved en diffusionsbarriere. (B) Billeder af Cy5-H3-H4 (rød) uden Abo1. (C) Billeder af Cy5-H3-H4 (rød) indlæst af Abo1 i tilstedeværelse (øverst) og fravær (nederst) af bufferstrømmen. D) Kymograf ekstraheret fra et enkelt DNA-molekyle fra (C). Når strømmen er forbigående slukket, forsvinder Cy5-fluorescenssignalerne, hvilket indikerer, at Cy5-H3-H4 binder til DNA, men ikke til diasoverfladen. (E) Billede af Cy5-H3-H4 indlæst af Abo1 uden nukleotid (Apo) (øverst). Billede af Cy5-H3-H4 indlæst af Abo1 i nærværelse af ADP (nederst). F) Kvantificering af Cy5-H3-H4 indlæst af Abo1 i henhold til nukleotider. Fejlbjælker viser standardafvigelsen i tre eksemplarer. Hvert eksperiment involverede analyse af 100-200 molekyler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sekvensuafhængig belastning af H3-H4 af Abo1. (A) Den ene ende af lambda-DNA'et er forankret til biotinyleret lipid via streptavidin, og den anden ende indeholder ti gentagelser af Widom 601-sekvensen (øverst). Det andet lambda-DNA indeholder fem gentagelser af Widom 601-sekvensen inde i lambda-DNA (nederst). (B) Skematisk oversigt over DNA-gardinassay med lambda-DNA indeholdende Widom 601-gentagelser. (C,D) Bindingsfordelingshistogrammer af Cy5-H3-H4 på lambda-DNA indeholdende Widom 601 gentages i slutningen (C) og internt (D). Der er ingen sekvensspecificitet for DNA, når H3-H4 samles af Abo1. Fejlbjælker opnås ved at bootstrapping42 med et 70% konfidensinterval. Det samlede antal hændelser er henholdsvis 312 og 252 for (C) og (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en enkeltmolekyle billeddannelsesteknik er DNA-gardin blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge DNA-metaboliske reaktioner43. DNA-gardin er et hybridsystem, der sammenkæder lipidfluiditet, mikrofluidik og TIRFM. I modsætning til andre enkeltmolekyleteknikker muliggør DNA-gardin visualisering i realtid med høj kapacitet af protein-DNA-interaktioner. Derfor er DNA-gardinteknikken velegnet til at undersøge mekanismen bag molekylære interaktioner, herunder sekvensspecifik forening, proteinbevægelse sammen med DNA og protein-proteinkollision på DNA 17,20,26. Derudover muliggør DNA-gardinets høje kapacitet indsamling af tilstrækkelige data til at sikre statistisk pålidelighed. DNA-gardin letter undersøgelsen af proteiners biofysisk-kemiske egenskaber, herunder kinetiske parametre, diffusionskoefficient, hastighed og processivitet 17,26,27,30. Det er vigtigt, at DNA-gardin kan bruges til at bestemme bindingslandskabet for nukleosomaflejring, hvilket indikerer den iboende sekvenspræference for nukleosomer30.
Flere punkter skal overvejes for at opnå data af høj kvalitet fra DNA-gardinassayet. For det første skal lipiddobbeltlaget være passende dannet på diasoverfladen. Fluiditeten af lipiddobbeltlaget tillader DNA-molekyler at bevæge sig på diaset og justeres ved en diffusionsbarriere i nærvær af hydrodynamisk strømning. Lipiddobbeltlaget passiverer også overfladen af det mikrofluidiske kammer for at forhindre uspecifik adsorption af proteiner til overfladen. Fordi passiveringen af lipiddobbeltlaget ikke er fuldstændig, adsorberes fluorescerende mærkede proteiner uspecifikt til overfladen, hvilket fører til forkert fortolkning af resultaterne. Imidlertid kan de overfladefastlåste proteiner skelnes fra DNA-bundne ved at tænde og slukke for den forbigående strømning, fordi DNA-bundne proteiner forsvinder, når strømmen stopper. For det andet skal fotoblegning af fluoroforer undertrykkes. Mange enkeltmolekyle fluorescensbilleddannelsesmetoder vedtager et iltrensningssystem for at reducere fotoblegning. Flere iltrensningssystemer er blevet udviklet, hvoraf den mest populære er gloxy. Gloxy, der består af glucoseoxidase og katalase, reducerer enzymatisk molekylære oxygener i opløsning, men sænker pH 44,45,46. Lav pH er ikke kompatibel med fysiologiske tilstande og reducerer lipidfluiditet. For at forsinke faldet i pH skal (1) billedbufferen fremstilles med afgasset deioniseret vand, (2) bufferen skal straks anvendes, og (3) bufferen skal forsegles og opbevares på is indtil brug.
En unik platform blev udviklet for at forbedre DNA-gardinsystemet, hvor udskårne nanograve fungerer som diffusionsbarrierer i stedet for kromnanomønstre25. Da disse nanograve er mere robuste under barske rengøringsforhold med stærke opløsningsmidler, tillader de gentagelig, klarere billeddannelse. DNA-gardinteknikken har dog flere begrænsninger. Under kontinuerlig laserbelysning fotobleges fluoroforerne, der mærker proteiner, hvilket gør langtidsmålinger udfordrende. DNA-gardin virker ikke ved lav pH (lavere end ~ 6), fordi lipiddobbeltlaget ikke er fluidisk. Derudover forstyrrer fluorescensbaggrunden og den uspecifikke binding af proteiner til diasoverfladen enkeltmolekylebilleddannelse, når proteinkoncentrationen er høj. En anden ulempe ved DNA-gardinet er, at DNA-gardinets rumlige opløsning er ~ 1 kbp / pixel, så bevægelsen af proteiner ved mindre end 1 kbp ikke kan observeres. Derudover anvender DNA-gardin kontinuerligt hydrodynamisk kraft på proteiner på DNA. Men kraften ved strømning er svag (mindre end 1 pN), og derfor er det udfordrende, at histoner eller nukleosomer bevæger sig langs DNA i gardinet. Det blev også rapporteret, at nukleosomer sjældent glider langs DNA uden kromatinremodelere47. Hvis histoner eller nukleosomer glider langs DNA, vil de fleste af dem forblive i endeområdet af DNA i gardinet. Vi så dog ikke den partiske fordeling. På den anden side, hvis histoner eller nukleosomer afstrømning fra DNA-enden, ville de blive udtømt i slutningen af DNA. Det overholdt vi heller ikke.
Dette arbejde viser, at DNA-gardinassay er en enkeltmolekyle-billeddannelsesplatform, der er ideel til undersøgelse af kromatindynamik. DNA-gardin kan anvendes til at studere den proces, hvormed histonchaperoner, såsom bromdomæneholdige AAA+ ATPaser, samler kromatin. Den biologiske funktion af bromdomæneholdige AAA+ ATPaser er kontroversiel. Mangel på human ATAD2 eller S. cerevisiae Yta7 nedregulerer genekspression via kromatinkondensation18. I modsætning hertil øger S. pombe Abo1 nukleosomtætheden16. Enkeltmolekylestudierne viser, at Abo1 katalyserer histon H3-H4, der belastes på DNA. Det er vist, at histonbelastningsaktiviteten af Abo1 er afhængig af ATP-hydrolyse (figur 2C, E, F). Desuden viser bindingsfordelingen af H3-H4-dimerer, at H3-H4-dimerer indlæses på DNA af Abo1 på en sekvensuafhængig måde (figur 3). Afslutningsvis kan DNA-gardinet bruges til at optrævle Abo1's biologiske rolle som histonchaperon i histonsamling. Ved hjælp af DNA-gardinteknikken vil nukleosomdannelse af Abo1 og andre histonchaperoner som CAF-1 og FACT blive undersøgt i fremtiden.
Baseret på denne protokol kan DNA-gardinassay anvendes til at observere kromatinreorganisering ved at ombygge komplekser, der translokerer og omarrangerer nukleosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne sætter pris på den venlige støtte til Abo1 og Cy5-H3-H4 af professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., og Juwon Jang, Ph.D., i KAIST, Sydkorea. Dette arbejde støttes af National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), intramural forskningsfond (1.210115.01) fra Ulsan National Institute of Science and Technology og Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
