Summary
מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.
Abstract
כרומטין הוא מבנה מסדר גבוה יותר שאורז דנ"א אאוקריוטי. הכרומטין עובר שינויים דינמיים בהתאם לשלב מחזור התא ובתגובה לגירויים סביבתיים. שינויים אלה חיוניים לשלמות הגנומית, לוויסות אפיגנטי ולתגובות מטבוליות של DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון. הרכבת הכרומטין חיונית לדינמיקה של הכרומטין והיא מזורזת על ידי מלווים של היסטון. למרות מחקרים מקיפים, המנגנונים שבאמצעותם מלווים בהיסטון מאפשרים הרכבת כרומטין נותרו חמקמקים. יתר על כן, התכונות הגלובליות של נוקלאוזומים המאורגנים על ידי מלווים היסטון אינן מובנות היטב. כדי להתמודד עם בעיות אלה, עבודה זו מתארת טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת בשם מסך DNA, המאפשרת לחקור את הפרטים המולקולריים של הרכבת נוקלאוזומים על ידי מלווים היסטון. מסך DNA היא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לספק פלטפורמה אוניברסלית להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. באמצעות וילון DNA נחקרת פונקציית מלווה ההיסטון של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase, ומתגלה המנגנון המולקולרי העומד בבסיס הרכבת ההיסטון של Abo1. וילון DNA מספק גישה ייחודית לחקר דינמיקת הכרומטין.
Introduction
דנ"א אאוקריוטי ארוז במבנה מסדר גבוה יותר המכונה כרומטין 1,2. נוקלאוזומים הם היחידה הבסיסית של כרומטין, המורכבת מכ-147 bp DNA העוטפים את אבני הליבה האוקטמריות 3,4. כרומטין ממלא תפקיד קריטי בתאים אאוקריוטים; לדוגמה, המבנה הקומפקטי מגן על הדנ"א מפני גורמים אנדוגניים ואיומים אקסוגניים5. מבנה הכרומטין משתנה באופן דינמי בהתאם לשלב מחזור התא ולגירויים סביבתיים, ושינויים אלה שולטים בגישה לחלבונים במהלך עסקאות DNA כגון שכפול, שעתוק ותיקון6. דינמיקה של כרומטין חשובה גם ליציבות גנומית ולמידע אפיגנטי.
הכרומטין מווסת באופן דינמי על ידי גורמים שונים, כולל שינויים בזנב היסטון ומארגני כרומטין כגון משפצי כרומטין, חלבונים מקבוצת פוליקומב ומלווי היסטון7. מלווים היסטון מתאמים את ההרכבה והפירוק של נוקלאוזומים באמצעות שיקוע או ניתוק של אבני ליבה 8,9. פגמים במלווים היסטון גורמים לאי יציבות גנומית וגורמים להפרעות התפתחותיות וסרטן 9,10. מלווי היסטון שונים אינם זקוקים לצריכת אנרגיה כימית כמו הידרוליזה ATP כדי להרכיב או לפרק נוקלאוזומים 9,11,12,13. לאחרונה, חוקרים דיווחו כי ATPases המכיל ברומודומיין AAA+ (ATPase הקשור לפעילויות תאיות מגוונות) ממלאים תפקיד בדינמיקה של כרומטין כמו מלווים היסטון 14,15,16,17. ATAD2 אנושי (חלבון המכיל תחום AAA ממשפחת ATPase 2) מקדם את נגישות הכרומטין כדי לשפר את ביטוי הגנים18. כמווסת שעתוק משותף, ATAD2 מווסת את הכרומטין של גורמי שעתוק אונקוגניים14, וביטוי היתר של ATAD2 קשור לפרוגנוזה גרועה בסוגים רבים של סרטן19. Yta7, ההומולוג Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) של ATAD2, מפחית את צפיפות הנוקלאוזומים בכרומטין15. לעומת זאת, Abo1, ההומולוג Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) של ATAD2, מגביר את צפיפות הנוקלאוזומים16. באמצעות טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה בודדת, וילון DNA, השאלה אם Abo1 תורם להרכבת נוקלאוזומים או פירוקו מטופלת17,20.
באופן מסורתי, התכונות הביוכימיות של ביומולקולות נבדקו על ידי ניסויים בתפזורת כגון בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA) או קו-אימונומשקעים (co-IP), שבהם נבדקים מספר רב של מולקולות, ותכונותיהן הממוצעות מאופיינות21,22. בניסויים בתפזורת, תת-מצבים מולקולריים מוסווים על ידי אפקט ממוצע האנסמבל, וחקירת אינטראקציות ביומולקולריות מוגבלת. לעומת זאת, טכניקות של מולקולות בודדות עוקפות את המגבלות של ניסויים בתפזורת ומאפשרות אפיון מפורט של אינטראקציות ביומולקולריות. בפרט, נעשה שימוש נרחב בטכניקות הדמיה של מולקולות בודדות כדי לחקור אינטראקציות DNA-חלבון וחלבון-חלבון23. טכניקה אחת כזו היא מסך DNA, טכניקת הדמיה ייחודית של מולקולה אחת המבוססת על מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM)24,25. במסך דנ"א, מאות מולקולות דנ"א בודדות מעוגנות לדו-שכבה השומנית, המאפשרת תנועה דו-ממדית של מולקולות דנ"א עקב נזילות השומנים. כאשר זרימה הידרודינמית מופעלת, מולקולות דנ"א נעות לאורך הזרימה על הדו-שכבה ונתקעות במחסום דיפוזיה, שם הן מיושרות ונמתחות. בעוד שהדנ"א מוכתם בחומרים משתלבים, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי מוזרקים, ו-TIRFM משמש לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ"א בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת23. פלטפורמת מסך הדנ"א מאפשרת תצפית על תנועות חלבונים כגון דיפוזיה, טרנסלוקציה והתנגשות 26,27,28. יתר על כן, וילון DNA יכול לשמש למיפוי חלבונים על דנ"א עם מיקומים, כיוונים וטופולוגיות מוגדרות או מיושם לחקר הפרדת פאזה של חלבונים וחומצות גרעין 29,30,31.
בעבודה זו, טכניקת מסך הדנ"א משמשת כדי לספק ראיות לתפקודם של מלווים באמצעות הדמיה ישירה של חלבונים ספציפיים. יתר על כן, מכיוון שמסך DNA הוא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה, הוא מאפשר איסוף נתונים בהיקף מספיק לאמינות סטטיסטית. כאן, הוא מתואר כיצד לבצע את בדיקת מסך ה- DNA בפירוט כדי לחקור את התפקיד המולקולרי של S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תא הזרימה
- הכינו שקופית סיליקה מאוחה מנוקה המכילה תבניות ננו-תעלות בהתאם לדוח25 שפורסם בעבר.
- קדחו שני חורים בקוטר 1 מ"מ במגלשת סיליקה מאוחה נקייה (איור 1A) באמצעות מקדח מצופה יהלום (ראו טבלת חומרים).
- הפקד 250 ננומטר של אלומיניום עבה (Al) על המגלשה באמצעות מרזב DC32 (ראה טבלת חומרים) עם 10 mTorr של גז ארגון.
- יש לצפות שכבה בעובי 310 ננומטר של 4% פולי(מתיל מתקרילט) (PMMA) (ראו טבלת חומרים) ב-4,000 סל"ד למשך דקה אחת ולאפות על פלטה חמה בטמפרטורה של 180°C במשך 3 דקות.
- צייר את תבניות ננו-תעלה על שכבת PMMA בין שני החורים באמצעות ליתוגרפיית קרן אלקטרונים (אלומה)33 עם זרם 0.724 nA ב- 80 kV.
הערה: הארכיטקטורה והממדים של תבניות ננו-תעלות מוצגים באיור 1A. - הסר את PMMA החשוף לאלומה על ידי השריית השקופיות בתמיסה המתפתחת (יחס של 1:3 של מתיל איזובוטיל קטון ואיזופרופנול, ראה טבלת חומרים) למשך 2 דקות.
- תחריט שכבות Al עם תחריט יונים תגובתי פלזמה מצומד אינדוקטיבי (ICP-RIE) באמצעות כלור (Cl2) וגזי בורון טריכלוריד (BCl 3).
הערה: שני גזים אלה יכולים להסיר את ה-Al מאזורים החשופים לאלומות. - חצבו ננו-תעלות במגלשות באמצעות גזי גופרית טטרה-פלואוריד (SF4), טטרה-פלואורומתאן (CF4) וגזי חמצן (O2) (ראו טבלת חומרים).
- הסר את שכבת Al הנותרת על ידי השריית השקופיות ב- Al etchant (מפתח AZ 300 GIF, ראה טבלת חומרים) למשך 10 דקות.
- לאחר הייצור, שטפו את המגלשות במים נטולי יונים, ובצעו סוניקציה באצטון למשך 30 דקות באמצעות סוניק מסוג אמבטיה.
- נקו את המגלשות בתמיסת Hellmanex III 2% (ראו טבלת חומרים) למשך יום אחד לפחות עם ערבוב מגנטי.
- החליקו את המגלשות באצטון במשך 30 דקות וב-1 M NaOH במשך 30 דקות ברציפות.
- יש לשטוף את המגלשות במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בגז חנקן (N2).
- שים נייר נקי (5 מ"מ x 35 מ"מ) על מרכז סרט דו-צדדי. חבר את סרט הדבק מעל השקופית כדי לכסות את שני החורים ואת תבניות הננו עם הנייר.
- הבלו על הנייר באמצעות להב נקי (איור 1A).
- הניחו כיסוי זכוכית על גבי סרט הדבקה דו-צדדי ושפשפו את הכיסוי באמצעות קצה פיפטה כדי ליצור תא מיקרופלואידי (איור 1A).
- מקם את תא הזרימה המורכב בין שתי שקופיות מיקרוסקופ וגזור אותן.
- אופים את תא הזרימה בתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות למשך 45 דקות.
- חבר את מחבר הנוזל (Nanoport) עבור ניתוחים מבוססי שבב (ראה טבלת חומרים) לכל חור פתוח באמצעות אקדח דבק חם וחבר את שני הקווים של צינורות נעילת Luer.
- חברו מזרק Luer lock המכיל 3 מ"ל מים נטולי יונים, ושטפו את החדר.
- שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים (20 מילימול של Tris-HCl, pH 8.0 ו-100 מילימול של NaCl) באמצעות חיבור טיפה אחר טיפה.
הערה: חיבור טיפה אחר טיפה מקשר את כל המזרקים לתא הזרימה כדי למנוע הזרקת בועות אוויר לתא. - הזריקו 1 מ"ל של 0.04x שומן ביוטינילציה בחיץ שומנים לתוך התא בשתי יריות עם 5 דקות דגירה לכל זריקה.
הערה: הכנת מלאי שומנים 1x biotinylated מתואר בדוחשפורסם בעבר 34. - שטפו את התא עם 3 מ"ל של חיץ שומנים ודגרו במשך 20 דקות כדי ששכבת השומנים תתבגר על משטח המגלשה.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר BSA (40 מ"מ של Tris-HCl, pH 8.0, 50 מילימול של NaCl, 2 מילימול של MgCl2 ו- 0.2 מ"ג/מ"ל של BSA) ודגור במשך 5 דקות כדי להפוך את משטח המגלשה לפסיבי.
הערה: שלב זה יכול להפחית את הקישור הלא ספציפי של חלבונים למשטח השקופית. - הזריקו 0.025 מ"ג/מ"ל סטרפטאווידין ב-1 מ"ל של חיץ BSA עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל זריקה.
- שטפו את שאריות הסטרפטאווידין עם 3 מ"ל של מאגר BSA.
- הזריקו ~300 pM (30 μL) של DNA פאג' למבדה ביוטינילציה ב-1 מ"ל של חיץ BSA לתוך התא עם שתי יריות ו-10 דקות דגירה לכל ירייה.
הערה: הכנת DNA של למבדה ביוטינילציה מתוארת בדו"ח34 שפורסם בעבר.
2. חיבור תא זרימה למערכת המיקרופלואידית והטענתו על המיקרוסקופ
- הכן מאגר הדמיה Abo1 (50 mM של Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM של NaCl, 1 mM של DTT, 1 mM של ATP, 2 mM של MgCl2, 1.6% גלוקוז, ו 0.1x של gloxy, ראה טבלה של חומרים).
הערה: Gloxy היא מערכת לניקוי חמצן המפחיתה את ההלבנה של צבעים פלואורסצנטיים. הכנת מלאי גלוקסי 100x עם גלוקוז אוקסידאז וקטלאז מתוארת בהפניה35. - חבר מזרק המכיל 10 מ"ל של חיץ הדמיה למשאבת מזרק והסר בועות בכל קווי הצינור במערכת המיקרופלואידית.
- חברו את תא הזרימה המוכן למערכת המיקרופלואידית באמצעות חיבור טיפה לטיפה כדי למנוע הזרקת בועות לתוך תא הזרימה (איור 1B).
- הרכיבו את מחזיקי תאי הזרימה ותאי הזרימה והרכיבו את המכלול על מיקרוסקופ TIRF שנבנה במיוחד (איור 1C).
זהירות: כאשר מכניסים את תא הזרימה מתחת למיקרוסקופ, קבעו בזהירות את גובה עדשת המטרה. אסור שתא הזרימה ייגע בעדשת המטרה. זה יכול להזיק לעדשה. - הורידו שמן תואם אינדקס במרכז תא הזרימה והניחו מנסרת יונה בהתאמה אישית (ראו טבלת חומרים) על טיפת השמן.
3. הרכבת היסטון על ידי Abo1 באמצעות וילון DNA
- ערבבו 5 ננומטר של Abo1 ו-12.5 ננומטר של דימר היסטון H3-H4 עם תווית Cy5 (Cy5-H3-H4) (ראו טבלת חומרים) ב-150 מיקרוליטר של מאגר הדמיה. כל החלבונים הוכנו בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר.
- דוגרים על התערובת על קרח במשך 15 דקות.
הערה: כדי למנוע הלבנה של Cy5, הדגירה חייבת להיעשות בחושך. - הזריקו ~20 pM (2 μL) של צבע YOYO-1 במאגר הדמיה דרך לולאת דגימה של 100 μL כדי להכתים מולקולות DNA של למדא.
- הפעל תוכנת הדמיה (ראה טבלת חומרים) והפעל את הלייזר של 488 ננומטר כדי לבדוק אם וילונות הדנ"א בנויים היטב.
הערה: אם וילונות הדנ"א בנויים היטב, מולקולות הדנ"א, המוכתמות ב-YOYO-1, מוצגות כקווים מיושרים במחסום בנוכחות זרימה. הקווים המתוחים נרתעים ומתרחקים מהמכשול כאשר הזרימה כבויה. - הזריקו 2 מ"ל של מאגר מלח גבוה (200 מילימול של NaCl ו-40 מילימול של MgCl2) כדי לסלק את צבע YOYO-1 מהדנ"א.
- לאחר הסרת צבע YOYO-1, יש להזריק את דגימת החלבון שהודגרה מראש.
- כאשר החלבונים מגיעים לווילון הדנ"א, כבו את משאבת המזרק, כבו את שסתום הסגירה ודגרו 15 דקות על העמסת היסטון על ידי Abo1.
- שטפו את חלבוני ה-Abo1 וההיסטון הלא קשורים למשך 5 דקות.
- הפעל את שסתום הכיבוי וחדש את הזרקת הזרימה.
- הפעל את הלייזר של 637 ננומטר וצלם את החלבונים הפלואורסצנטיים בזמן שזרימת המאגר מופעלת.
- כבו באופן זמני את זרימת החיץ כדי לבדוק אם חלבוני היסטון נטענים על דנ"א (איור 2C).
- אסוף תמונות מסך DNA באמצעות תוכנית לרכישת תמונות (ראה טבלת חומרים).
הערה: כאשר זרימת החיץ נפסקת באופן זמני, הדנ"א נרתע מהשדה האוונסנטי של השתקפות פנימית כוללת, וחלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לדנ"א נעלמים.
4. ניתוח נתונים
- המר את התמונות שצולמו על-ידי התוכנית לרכישת תמונות לתבנית TIFF כרצפי תמונות.
הערה: כל הנתונים נותחו באמצעות תמונה J (NIH) כמתואר בהפניה20. - בחרו מולקולת דנ"א בודדת מתוך רצפי התמונות וציירו קימוגרף.
הערה: הקימוגרף יכול להראות את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות של כל חלבון היסטון הקשור למולקולת דנ"א יחידה כפונקציה של זמן. - צור את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות מהקימוגרף והתאם אותו למספר פונקציות גאוסיות.
- אסוף את הקואורדינטות המרכזיות של הפסגות מפרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות. בשלב זה, ניתן להשיג את העוצמה המינימלית של פלואורסצנטיות היסטון.
- חלק את כל עוצמות השיא שנאספו מהפרופילים בעוצמה מינימלית. מספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א מוערך בשלב זה.
- בצע שלבים 4.2-4.5 עבור מולקולות דנ"א אחרות.
- צור היסטוגרמה להתפלגות הקישור של דימרים H3-H4 בגודל סל של 1 kbp. מספר המולקולות שנותחו הוא לפחות 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבודה זו מתארת את הליך הכנת תאי הזרימה לבדיקת מסך הדנ"א (איור 1A). בדיקת מסך הדנ"א אפשרה את המחקר של הרכבת דימר היסטון H3-H4 על DNA על ידי Abo1. ראשית, היווצרות מסך הדנ"א נבדקה על ידי צביעת מולקולות דנ"א ב-YOYO-1, צבע מצטלב. קווים ירוקים הוצגו במערכים מקבילים, מה שמצביע על כך ש-YOYO-1 הצטלב למולקולות דנ"א, שהיו מיושרות היטב ונמתחו במחסום דיפוזיה תחת זרימה הידרודינמית (איור 2A). כדי לשלול את האפשרות ש-YOYO-1 מעכב את האינטראקציה של DNA וחלבוני היסטון, YOYO-1 הוסר מהדנ"א עם חיץ מלח גבוה לפני הוספת חלבוני היסטון. כאשר דימרים של Cy5-H3-H4 הוזרקו לתוך מסך הדנ"א בהיעדר Abo1, Cy5-H3-H4 לא נקשר לדנ"א, מה שמצביע על חוסר קשירה ספונטנית של דימרים H3-H4 לדנ"א (איור 2B). כאשר Cy5-H3-H4 הוזרק עם Abo1, נקטה פלואורסצנטית אדומה נראתה על מולקולות דנ"א, מה שמרמז על כך ש-Abo1 טוען דימרים H3-H4 על דנ"א (איור 2C). זרימת החיץ כובתה באופן זמני כדי להבטיח שדימרים Cy5-H3-H4 לא ייקשרו למשטח המגלשה תוך קשירה לדנ"א. כאשר הזרימה כובתה, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי הקשורים לדנ"א נעלמו מכיוון שמולקולות דנ"א נרתעו מהשדה האוונסנטי. לעומת זאת, חלבונים שנספגים לפני השטח נותרו זהים. האותות הפלואורסצנטיים נעלמו בהיעדר זרימה והופיעו שוב כאשר הזרימה חודשה, מה שמרמז על כך שדימרים H3-H4 נקשרים לדנ"א (איור 2C). הקישור של דימרים H3-H4 לדנ"א אושר גם על-ידי הקימוגרף, שבו אותות הפלואורסצנטיות נעלמו בכל פעם שהזרימה כבתה (איור 2D). מכיוון ש-Abo1 הוא AAA+ ATPase, נבדקה ההשפעה של הידרוליזה ATP על פעילות העמסת ההיסטון של Abo116. מעט פונקטה פלואורסצנטית הופיעה במסך הדנ"א בהיעדר נוקלאוטיד (Apo) או בנוכחות ADP (איור 2E), מה שמצביע על כך שדימרים H3-H4 כמעט ולא נקשרים לדנ"א במצב אפו או בנוכחות ADP. איור 2F מציג ניתוחים כמותיים של איור 2B,C ואיור 2E, ומראה שמספר הדימרים H3-H4 הקשורים לדנ"א גדל בנוכחות ATP. התוצאות מצביעות על כך שהידרוליזה של ATP חיונית להעמסת H3-H4 על דנ"א על-ידי Abo1 (איור 2E,F).
לאחר מכן, נבדק האם Abo1 מעדיף לטעון היסטונים לרצף Widom 601, שיש לו זיקה קשירה גבוהה פי עשרה להיסטונים מאשר רצפים אקראיים במבחנה, למרות שלנוקלאוזומים אין ספציפיות לרצף Widom 601 in vivo 36,37,38,39,40. מסך הדנ"א נוצר עם דנ"א למדא שמכיל חזרות Widom 601 בקצה אחד או באופן פנימי (איור 3A,B). התקבל נוף הקישור של דימרים H3-H4 על כל מבנה דנ"א (איור 3C,D). מיקום הקשירה של Cy5-H3-H4 הוערך מהמיקום המרכזי של התאמת גאוס דו-ממדית לכל נקב פלואורסצנטי17,41. אם פעילות ההעמסה H3-H4 של Abo1 תלויה ברצף הדנ"א, אז התפלגות הקישור תהיה מוטה לכיוון רצף Widom 601. איור 3C,D מציג את היסטוגרמות התפלגות הקישור של דימרים H3-H4 על-ידי Abo1 על דנ"א למדא המכיל Widom 601 חזרות בסוף (עשר חזרות) ופנימיות (חמש חזרות), בהתאמה. לא הייתה קשירה מועדפת לחזרות מרובות של Widom 601, והתפלגות הקשירה הייתה אקראית, מה שמרמז על כך של-Abo1 אין העדפה כלשהי לרצף Widom 601 אלא טוען את H3-H4 על דנ"א באופן בלתי תלוי ברצף (איור 3C,D).
איור 1: הכנת תא זרימה. (A) סכמות של הרכבת תאי זרימה ומערכת וילונות DNA. התא המיקרופלואידי יכול להיווצר בין מגלשת סיליקה מאוחה לבין כיסוי זכוכית המודבק יחד עם סרט דו-צדדי. תחת הזרימה ההידרודינמית בתא, כמות גדולה של מולקולות דנ"א למדא מיושרות במחסום דיפוזיה (ננו-תעלה כאן) בגלל הנזילות של דו-שכבת השומנים ונמתחות כמו וילון. בתצוגה המוגדלת של מחסום הדיפוזיה, לתעלה ננו-תעלה יש תבניות שיני מסור עם פסיעה של 1.5 מיקרומטר, רוחב של 350 ננומטר ועומק של 1.4 מיקרומטר. (B) צילום של המערכת המיקרופלואידית המורכבת ממשאבת מזרק, שסתום כיבוי ושסתום הזרקת דגימה 6 כיוונים עם לולאת דגימה. (C) תמונות של רכיבי מחזיק השקופיות (משמאל), מכלול המחזיקים ותא הזרימה (באמצע), ותא הזרימה המורכב במלואו המורכב על מיקרוסקופ TIRF בהתאמה אישית (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה של העמסת היסטון על-ידי Abo1 באמצעות וילון דנ"א של מולקולה אחת. (A) תמונה של וילון דנ"א, שבו מולקולות דנ"א מוכתמות ב-YOYO-1 (ירוק) מיושרות היטב במחסום דיפוזיה. (B) תמונות של Cy5-H3-H4 (אדום) ללא Abo1. (C) תמונות של Cy5-H3-H4 (אדום) שנטענו על-ידי Abo1 בנוכחות (למעלה) ובהיעדר (למטה) של זרימת חיץ. (D) קימוגרף המופק ממולקולת דנ"א יחידה מ-(C). כאשר הזרימה כבויה באופן זמני, אותות הפלואורסצנטיות של Cy5 נעלמים, מה שמצביע על כך ש-Cy5-H3-H4 נקשר לדנ"א אך לא למשטח ההחלקה. (E) תמונה של Cy5-H3-H4 נטענת על ידי Abo1 ללא נוקלאוטיד (Apo) (למעלה). תמונה של Cy5-H3-H4 נטענה על ידי Abo1 בנוכחות ADP (למטה). (F) כימות Cy5-H3-H4 שנטען על ידי Abo1 לפי נוקלאוטידים. קווי שגיאה מתארים את סטיית התקן במשולש. כל ניסוי כלל ניתוח של 100-200 מולקולות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: טעינה בלתי תלויה ברצף של H3-H4 על-ידי Abo1. (A) קצה אחד של דנ"א הלמדא מעוגן לשומנים ביוטיניליים באמצעות סטרפטווידין, והקצה השני מכיל עשר חזרות של רצף וידום 601 (למעלה). הדנ"א השני של למבדה מכיל חמש חזרות של רצף וידום 601 בתוך דנ"א למבדה (למטה). (B) סכמה של בדיקת מסך DNA עם DNA lambda המכיל Widom 601 חוזר. (ג,ד) היסטוגרמות התפלגות קשירה של Cy5-H3-H4 על DNA lambda המכיל Widom 601 חוזרות בסוף (C) ובאופן פנימי (D). אין ספציפיות לרצף דנ"א כאשר H3-H4 מורכב על ידי Abo1. קווי שגיאה מתקבלים על ידי bootstrapping42 עם רווח בר-סמך של 70%. סך כל האירועים הוא 312 ו- 252 עבור (C) ו- (D), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כטכניקת הדמיה של מולקולה יחידה, נעשה שימוש נרחב בווילון הדנ"א כדי לחקור תגובות מטבוליות של דנ"א43. וילון DNA הוא מערכת היברידית המשרשרת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ו-TIRFM. שלא כמו טכניקות אחרות של מולקולות בודדות, מסך DNA מאפשר הדמיה בזמן אמת בתפוקה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA. לכן, טכניקת מסך הדנ"א מתאימה לחקירת המנגנון מאחורי אינטראקציות מולקולריות, כולל קשר ספציפי לרצף, תנועת חלבונים יחד עם דנ"א, והתנגשות חלבון-חלבון בדנ"א 17,20,26. בנוסף, אופי התפוקה הגבוהה של מסך הדנ"א מאפשר איסוף של מספיק נתונים כדי להבטיח אמינות סטטיסטית. מסך DNA מאפשר לחקור את התכונות הביו-פיסיקוכימיות של חלבונים, כולל פרמטרים קינטיים, מקדם דיפוזיה, מהירות ותהליכות 17,26,27,30. חשוב לציין, ניתן להשתמש בווילון דנ"א כדי לקבוע את נוף הקישור של שקיעת נוקלאוזומים, המציין את העדפת הרצף הפנימי של נוקלאוזומים30.
יש לקחת בחשבון מספר נקודות כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה מבדיקת מסך ה- DNA. ראשית, דו-שכבת השומנים חייבת להיווצר כראוי על משטח השקופית. הנזילות של דו-שכבת השומנים מאפשרת למולקולות DNA לנוע על המגלשה ולהיות מיושרות במחסום דיפוזיה בנוכחות זרימה הידרודינמית. דו-שכבתי השומנים גם פסיביים את פני השטח של החדר המיקרופלואידי כדי למנוע ספיחה לא ספציפית של חלבונים אל פני השטח. מכיוון שהפסיבציה על ידי דו-שכבת השומנים אינה שלמה, חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי נספגים באופן לא ספציפי לפני השטח, מה שמוביל לפרשנות שגויה של התוצאות. עם זאת, ניתן להבדיל בין החלבונים הדבוקים בפני השטח לבין חלבונים הקשורים לדנ"א על ידי הפעלה וכיבוי של הזרימה החולפת מכיוון שחלבונים הקשורים לדנ"א נעלמים כאשר הזרימה נפסקת. שנית, יש לדכא פוטו-הלבנה של פלואורופורים. שיטות הדמיה פלואורסצנטיות רבות של מולקולה בודדת מאמצות מערכת לניקוי חמצן כדי להפחית את ההלבנה. פותחו מספר מערכות לניקוי חמצן, הפופולרית שבהן היא גלוקסי. גלוקסי, המורכב מגלוקוז אוקסידאז וקטלאז, מפחית אנזימטית חמצן מולקולרי בתמיסה אך מוריד את ה- pH 44,45,46. pH נמוך אינו תואם תנאים פיזיולוגיים ומפחית נזילות שומנים. כדי לעכב את הירידה ב-pH, (1) יש להכין את מאגר ההדמיה עם מים נטולי גזים שעברו דה-יוניזציה, (2) יש להשתמש במאגר באופן מיידי, ו-(3) יש לאטום את המאגר ולאחסן אותו על קרח עד לשימוש.
פלטפורמה ייחודית פותחה לשיפור מערכת וילונות הדנ"א שבה ננו-תעלות מגולפות משמשות כמחסומי דיפוזיה במקום ננו-תבניות כרום25. מכיוון שתעלות ננו אלה עמידות יותר בתנאי ניקוי קשים עם ממיסים חזקים, הן מאפשרות הדמיה חוזרת וברורה יותר. עם זאת, לטכניקת מסך הדנ"א יש מספר מגבלות. תחת תאורת לייזר רציפה, הפלואורופורים המסמנים חלבונים עוברים פוטו-אקונומיקה, מה שהופך מדידות ארוכות טווח למאתגרות. וילון DNA אינו פועל ב- pH נמוך (נמוך מ ~ 6) מכיוון ששכבת השומנים אינה פלואידית. בנוסף, הרקע הפלואורסצנטי והקישור הלא ספציפי של חלבונים למשטח השקופיות מפריעים לדימות של מולקולה בודדת כאשר ריכוז החלבונים גבוה. חסרון נוסף של מסך הדנ"א הוא שהרזולוציה המרחבית של וילון הדנ"א היא ~1 kbp לפיקסל, כך שלא ניתן להבחין בתנועת חלבונים במהירות של פחות מ-1kbp. בנוסף, מסך הדנ"א מפעיל באופן רציף כוח הידרודינמי על חלבונים על גבי הדנ"א. אבל כוח הזרימה חלש (פחות מ-1 pN), ולכן מאתגר שהיסטונים או נוקלאוזומים נעים לאורך הדנ"א בווילון. כמו כן דווח כי נוקלאוזומים מחליקים לעתים רחוקות לאורך הדנ"א ללא משפצי כרומטין47. אם היסטונים או נוקלאוזומים מחליקים לאורך הדנ"א, רובם יישארו באזור הקצה של הדנ"א בווילון. עם זאת, לא ראינו את ההתפלגות המוטה. מצד שני, אם היסטונים או נוקלאוזומים נגרמים מקצה הדנ"א, הם יתרוקנו בסוף הדנ"א. גם את זה לא קיימנו.
עבודה זו מדגימה כי בדיקת מסך הדנ"א היא פלטפורמת הדמיה של מולקולה בודדת אידיאלית לחקר דינמיקת הכרומטין. ניתן ליישם וילון DNA כדי לחקור את התהליך שבו מלווים היסטון כגון AAA+ ATPases המכיל ברומודומיין מרכיבים כרומטין. הפונקציה הביולוגית של AAA+ ATPases המכיל ברומודומיין שנויה במחלוקת. חוסר ATAD2 אנושי או S. cerevisiae Yta7 מוריד את ביטוי הגנים באמצעות עיבוי כרומטין18. לעומת זאת, S. pombe Abo1 מגביר את צפיפות הנוקלאוזומים16. מחקרי המולקולה הבודדת מראים כי Abo1 מזרז העמסת היסטון H3-H4 על דנ"א. ניתן לראות שפעילות העמסת ההיסטון של Abo1 תלויה בהידרוליזה של ATP (איור 2C,E,F). יתר על כן, התפלגות הקישור של דימרים H3-H4 מראה שדימרים H3-H4 נטענים על דנ"א על-ידי Abo1 באופן שאינו תלוי ברצף (איור 3). לסיכום, ניתן להשתמש במסך הדנ"א כדי לפענח את תפקידו הביולוגי של Abo1 כמלווה היסטון בהרכבת היסטון. באמצעות טכניקת מסך הדנ"א, היווצרות נוקלאוזומים על ידי Abo1 ומלווי היסטון אחרים כגון CAF-1 ו- FACT ייחקרו בעתיד.
בהתבסס על פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בבדיקת מסך DNA כדי לצפות בארגון מחדש של הכרומטין על ידי שיפוץ קומפלקסים המשנים ומסדרים מחדש נוקלאוזומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מעריכים את התמיכה האדיבה ב- Abo1 וב- Cy5-H3-H4 על ידי פרופסור ג'י-ג'ון סונג, קרול צ'ו, Ph.D. וג'וון ג'אנג, Ph.D., ב- KAIST, דרום קוריאה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הקרן הלאומית למחקר (NRF-2020R1A2B5B01001792), קרן מחקר אינטרמורלית (1.210115.01) של המכון הלאומי למדע וטכנולוגיה של אולסן, והמכון למדע בסיסי (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
