Summary
A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.
Abstract
A cromatina é uma estrutura de ordem superior que empacota o DNA eucariótico. A cromatina sofre alterações dinâmicas de acordo com a fase do ciclo celular e em resposta a estímulos ambientais. Essas alterações são essenciais para a integridade genômica, regulação epigenética e reações metabólicas do DNA, como replicação, transcrição e reparo. A montagem da cromatina é crucial para a dinâmica da cromatina e é catalisada por chaperonas de histonas. Apesar de extensos estudos, os mecanismos pelos quais as chaperonas de histonas permitem a montagem da cromatina permanecem indefinidos. Além disso, as características globais dos nucleossomos organizados por chaperonas de histonas são pouco compreendidas. Para resolver esses problemas, este trabalho descreve uma técnica única de imagem de molécula única chamada cortina de DNA, que facilita a investigação dos detalhes moleculares da montagem de nucleossomos por chaperonas de histonas. A cortina de DNA é uma técnica híbrida que combina fluidez lipídica, microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM) para fornecer uma plataforma universal para imagens em tempo real de diversas interações proteína-DNA. Usando cortina de DNA, a função de chaperona de histona de Abo1, a Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase, é investigada, e o mecanismo molecular subjacente à montagem de histonas de Abo1 é revelado. A cortina de DNA fornece uma abordagem única para estudar a dinâmica da cromatina.
Introduction
O DNA eucariótico é empacotado em uma estrutura de ordem superior conhecida como cromatina 1,2. O nucleossomo é a unidade fundamental da cromatina, que consiste em aproximadamente 147 pb de DNA envolto em torno das histonas do núcleo octeramérica 3,4. A cromatina desempenha um papel crítico em células eucarióticas; por exemplo, a estrutura compacta protege o DNA de fatores endógenos e ameaças exógenas5. A estrutura da cromatina muda dinamicamente de acordo com a fase do ciclo celular e estímulos ambientais, e essas alterações controlam o acesso às proteínas durante transações de DNA, como replicação, transcrição e reparo6. A dinâmica da cromatina também é importante para a estabilidade genômica e informações epigenéticas.
A cromatina é regulada dinamicamente por vários fatores, incluindo modificações na cauda de histonas e organizadores da cromatina, como remodeladores de cromatina, proteínas do grupo policomb e chaperonas de histonas7. As chaperonas de histonas coordenam a montagem e desmontagem de nucleossomos via deposição ou descolamento de histonas centrais 8,9. Defeitos nas chaperonas de histonas induzem instabilidade do genoma e causam distúrbios do desenvolvimento e câncer 9,10. Várias chaperonas de histonas não necessitam de consumo de energia química, como hidrólise de ATP, para montar ou desmontar nucleossomos 9,11,12,13. Recentemente, pesquisadores relataram que AAA+ contendo bromodomínio (ATPase associada a diversas atividades celulares) ATPases desempenham um papel na dinâmica da cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. A ATAD2 humana (ATPase family AAA domain-containing protein 2) promove a acessibilidade da cromatina para aumentar a expressão gênica18. Como co-regulador transcricional, o ATAD2 regula a cromatina dos fatores transcricionais oncogênicos14, e a superexpressão de ATAD2 está relacionada ao mau prognóstico em muitos tipos de câncer19. Yta7, o homólogo de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) de ATAD2, diminui a densidade nucleossômica na cromatina15. Em contraste, Abo1, o Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homólogo de ATAD2, aumenta a densidade nucleossômica16. Usando uma técnica única de imagem de molécula única, a cortina de DNA, se Abo1 contribui para a montagem ou desmontagem do nucleossomoé abordada 17,20.
Tradicionalmente, as propriedades bioquímicas de biomoléculas têm sido examinadas por experimentos em massa, como o ensaio de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) ou a co-imunoprecipitação (co-IP), nos quais um grande número de moléculas é sondado e suas propriedades médias sãocaracterizadas21,22. Em experimentos em massa, os sub-estados moleculares são velados pelo efeito ensemble-average, e a sondagem de interações biomoleculares é restrita. Em contraste, técnicas de molécula única contornam as limitações dos experimentos em massa e permitem a caracterização detalhada das interações biomoleculares. Em particular, técnicas de imagem de molécula única têm sido amplamente utilizadas para estudar interações DNA-proteína e proteína-proteína23. Uma dessas técnicas é a cortina de DNA, uma técnica única de imagem de molécula única baseada em microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM)24,25. Em uma cortina de DNA, centenas de moléculas individuais de DNA estão ancoradas à bicamada lipídica, o que permite o movimento bidimensional das moléculas de DNA devido à fluidez lipídica. Quando o fluxo hidrodinâmico é aplicado, as moléculas de DNA se movem ao longo do fluxo na bicamada e ficam presas em uma barreira de difusão, onde são alinhadas e esticadas. Enquanto o DNA é corado com agentes intercalantes, proteínas fluorescentemente marcadas são injetadas, e o TIRFM é usado para visualizar interações proteína-DNA em tempo real em nível de moléculaúnica 23. A plataforma de cortina de DNA facilita a observação de movimentos de proteínas como difusão, translocação e colisão 26,27,28. Além disso, a cortina de DNA pode ser utilizada para mapeamento de proteínas no DNA com posições, orientações e topologias definidas ou aplicada ao estudo da separação de fases de proteínas e ácidos nucléicos 29,30,31.
Neste trabalho, a técnica de cortina de DNA é usada para fornecer evidências da função de chaperonas através da visualização direta de proteínas específicas. Além disso, como a cortina de DNA é uma plataforma de alto rendimento, ela facilita uma extensão de coleta de dados suficiente para a confiabilidade estatística. Aqui, descreve-se como conduzir o ensaio de cortina de DNA em detalhes para investigar o papel molecular de S. pombe bromodomain contendo AAA+ ATPase Abo1.
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Protocol
1. Preparação da célula de fluxo
- Prepare uma lâmina de sílica fundida limpa contendo padrões de nano-trincheira seguindo o relatório25 publicado anteriormente.
- Faça dois furos com 1 mm de diâmetro em uma lâmina de sílica fundida limpa (Figura 1A) usando uma broca revestida de diamante (consulte a Tabela de Materiais).
- Deposite 250 nm de alumínio espesso (Al) na lâmina usando a pulverização DC32 (ver Tabela de Materiais) com 10 mTorr de gás argônio.
- Spin-coat uma camada de 310 nm de espessura de 4% 950K poli(metacrilato de metila) (PMMA) (ver Tabela de Materiais) a 4.000 rpm por 1 min e asse em uma placa quente a 180 °C por 3 min.
- Desenhe os padrões de nano-trincheiras na camada de PMMA entre os dois furos usando litografia de feixe de elétrons (ebeam)33 com corrente de 0,724 nA a 80 kV.
NOTA: A arquitetura e as dimensões dos padrões de nano-trincheira são mostradas na Figura 1A. - Remova o PMMA exposto ao feixe mergulhando as lâminas na solução reveladora (proporção 1:3 de metilisobutilcetona e isopropanol, ver Tabela de Materiais) por 2 minutos.
- Camadas de Etch Al com corrosão iônica reativa a plasma indutivamente acoplado (ICP-RIE) usando cloro (Cl2) e tricloreto de boro (BCl3).
NOTA: Estes dois gases podem remover o Al das áreas expostas ao feixe. - Esculpir nano-trincheiras nas lâminas usando tetrafluoreto de enxofre (SF4), tetrafluorometano (CF4) e gases de oxigênio (O2) (ver Tabela de Materiais).
- Remova a camada de Al restante mergulhando os slides em Al etchant (desenvolvedor AZ 300 MIF, consulte Tabela de Materiais) por 10 minutos.
- Após a fabricação, enxaguar as lâminas com água deionizada e sonicar em acetona por 30 min usando um sonicador tipo banho.
- Limpe as lâminas em solução de Hellmanex III a 2% (ver Tabela de Materiais) durante pelo menos 1 dia com agitação magnética.
- Sonicar as lâminas em acetona por 30 min e NaOH 1 M por 30 min sucessivamente.
- Enxaguar as lâminas com água deionizada e secar com um gás nitrogênio (N2).
- Coloque um papel limpo (5 mm x 35 mm) no centro da fita dupla face. Fixe a fita sobre a lâmina para cobrir os dois orifícios e os nanopadrões com o papel.
- Excique o papel usando uma lâmina limpa (Figura 1A).
- Coloque uma tampa de vidro em cima da fita dupla face e esfregue a lamínula usando uma ponta de pipeta para formar uma câmara microfluídica (Figura 1A).
- Coloque a célula de fluxo montada entre duas lâminas de microscópio e prenda-as.
- Asse a célula de fluxo em forno a vácuo a 120 °C por 45 min.
- Conecte o conector de fluido (Nanoport) para as análises baseadas em chips (consulte Tabela de Materiais) a cada orifício aberto usando uma pistola de cola quente e conecte as duas linhas de tubulação Luer lock.
- Conecte uma seringa Luer lock contendo 3 mL de água deionizada e lave a câmara.
- Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 e 100 mM de NaCl) através da conexão gota-a-gota.
NOTA: A conexão gota a gota liga todas as seringas à célula de fluxo para evitar a injeção de bolhas de ar na câmara. - Injetar 1 mL de lipídio biotinilado 0,04x em tampão lipídico na câmara em dois disparos com 5 min de incubação por disparo.
NOTA: A preparação de 1x estoque lipídico biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente34. - Lavar a câmara com 3 mL de tampão lipídico e incubar por 20 min para que a bicamada lipídica seja maturada na superfície da lâmina.
- Adicionar 1 mL de tampão BSA (40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2 e 0,2 mg/mL de BSA) e incubar por 5 min para passivar a superfície da lâmina.
NOTA: Esta etapa pode reduzir a ligação inespecífica de proteínas à superfície da lâmina. - Injetar 0,025 mg/mL de estreptavidina em 1 mL de tampão BSA com duas doses e 10 min de incubação por injeção.
- Lavar a estreptavidina residual com 3 ml de tampão BSA.
- Injetar ~300 pM (30 μL) de DNA de fagos lambda biotinilados em 1 mL de tampão BSA na câmara com dois tiros e 10 min de incubação por disparo.
NOTA: A preparação de DNA lambda biotinilado é descrita em um relatório publicado anteriormente34.
2. Conectando a célula de fluxo ao sistema microfluídico e carregando-a no microscópio
- Preparar tampão de imagem Abo1 (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 1 mM de TDT, 1 mM de ATP, 2 mM de MgCl2, 1,6% de glicose e 0,1x de gloxy, ver Tabela de Materiais).
NOTA: Gloxy é um sistema de sequestro de oxigênio que reduz o fotobranqueamento de corantes fluorescentes. A preparação de estoque de gloxy 100x com glicose oxidase e catalase é descrita na referência35. - Conecte uma seringa contendo 10 mL de tampão de imagem a uma bomba de seringa e remova as bolhas em todas as linhas de tubulação no sistema microfluídico.
- Acoplar a célula de fluxo preparada com o sistema microfluídico através de conexão gota-gota para evitar a injeção de bolhas na célula de fluxo (Figura 1B).
- Monte a célula de fluxo e os suportes de célula de fluxo e monte o conjunto em um microscópio TIRF personalizado (Figura 1C).
CUIDADO: Quando a célula de fluxo for colocada sob o microscópio, ajuste cuidadosamente a altura da lente objetiva. A célula de fluxo não deve tocar na lente objetiva. Isso pode danificar a lente. - Índice de queda de óleo correspondente no centro da célula de fluxo e coloque um prisma de pomba feito sob medida (consulte Tabela de Materiais) na gota de óleo.
3. Montagem de Histone por Abo1 usando cortina de DNA
- Misturar 5 nM de Abo1 e 12,5 nM de dímero de histona H3-H4 marcado com Cy5 (Cy5-H3-H4) (ver Tabela de Materiais) em 150 μL de tampão de imagem. Todas as proteínas foram preparadas seguindo relato publicado anteriormente17.
- Incubar a mistura no gelo por 15 min.
OBS: Para evitar o fotoclareamento do Cy5, a incubação deve ser feita no escuro. - Injetar ~20 pM (2 μL) de corante YOYO-1 em tampão de imagem através de uma alça de amostra de 100 μL para corar moléculas de DNA lambda.
- Execute o software de imagem (consulte a Tabela de Materiais) e ligue o laser de 488 nm para verificar se as cortinas de DNA estão bem formadas.
NOTA: Se as cortinas de DNA são bem formadas, as moléculas de DNA, que são coradas com YOYO-1, são mostradas como linhas alinhadas em uma barreira na presença de fluxo. As linhas esticadas recuam e se difundem para longe da barreira quando o fluxo é desligado. - Injetar 2 mL de tampão salino alto (200 mM de NaCl e 40 mM de MgCl2) para eliminar o corante YOYO-1 do DNA.
- Após a remoção do corante YOYO-1, injete a amostra de proteína pré-incubada.
- Quando as proteínas atingirem a cortina de DNA, desligue a bomba da seringa, desligue a válvula de desligamento e incube 15 min para carregamento de histona por Abo1.
- Lave as proteínas Abo1 e histonas não ligadas por 5 min.
- Ligue a válvula de desligamento e retome a injeção de fluxo.
- Ligue o laser de 637 nm e obtenha imagens das proteínas fluorescentes enquanto o fluxo tampão está ligado.
- Desligue transitoriamente o fluxo tampão para verificar se as proteínas de histonas estão carregadas no DNA (Figura 2C).
- Coletar imagens de cortina de DNA com um programa de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Quando o fluxo tampão pára transitoriamente, o DNA recua para fora do campo evanescente de reflexão interna total, e as proteínas fluorescentemente marcadas ligadas ao DNA desaparecem.
4. Análise dos dados
- Transformar as imagens obtidas pelo programa de aquisição de imagens em formato TIFF como sequências de imagens.
OBS: Todos os dados foram analisados utilizando-se a Imagem J (NIH) conforme descrito na Referência20. - Escolha uma única molécula de DNA das sequências de imagem e desenhe um quimógrafo.
NOTA: O quimógrafo pode mostrar a mudança na intensidade de fluorescência de cada proteína de histona ligada a uma única molécula de DNA em função do tempo. - Crie o perfil de intensidade de fluorescência a partir do quimógrafo e encaixe-o com múltiplas funções gaussianas.
- Coletar as coordenadas centrais dos picos do perfil de intensidade de fluorescência. Nesta etapa, pode-se obter a intensidade mínima de fluorescência de histonas.
- Divida todas as intensidades de pico coletadas dos perfis pela intensidade mínima. O número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA é estimado nesta etapa.
- Execute as etapas 4.2-4.5 para outras moléculas de DNA.
- Crie um histograma para a distribuição de ligação de dímeros H3-H4 com tamanho de compartimento de 1 kbp. O número de moléculas analisadas é de pelo menos 300.
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Representative Results
Este trabalho descreve o procedimento de preparação de células de fluxo para o ensaio de cortina de DNA (Figura 1A). O ensaio de cortina de DNA facilitou o estudo da montagem de dímeros de histona H3-H4 no DNA por Abo1. Primeiro, a formação de cortinas de DNA foi verificada pela coloração de moléculas de DNA com YOYO-1, um corante intercalante. Linhas verdes foram mostradas em arranjos paralelos, indicando que YOYO-1 intercalou em moléculas de DNA, que estavam bem alinhadas e esticadas em uma barreira de difusão sob fluxo hidrodinâmico (Figura 2A). Para excluir a possibilidade de YOYO-1 dificultar a interação de DNA e proteínas histonas, YOYO-1 foi removido do DNA com um alto tampão salino antes da adição de proteínas histonas. Quando dímeros Cy5-H3-H4 foram injetados na cortina de DNA na ausência de Abo1, Cy5-H3-H4 não se ligou ao DNA, indicando uma falta de ligação espontânea dos dímeros H3-H4 ao DNA (Figura 2B). Quando Cy5-H3-H4 foi injetado com Abo1, punctas fluorescentes vermelhos foram vistos em moléculas de DNA, sugerindo que Abo1 carrega dímeros H3-H4 no DNA (Figura 2C). O fluxo tampão foi desligado transitoriamente para garantir que os dímeros Cy5-H3-H4 não se ligassem à superfície da lâmina enquanto se ligavam ao DNA. Quando o fluxo foi desligado, as proteínas fluorescentemente marcadas ligadas ao DNA desapareceram porque as moléculas de DNA recuaram para fora do campo evanescente. Em contraste, as proteínas adsorvidas à superfície permaneceram as mesmas. Os sinais fluorescentes desapareceram na ausência de fluxo e reapareceram quando o fluxo foi retomado, sugerindo que dímeros H3-H4 se ligam ao DNA (Figura 2C). A ligação dos dímeros H3-H4 ao DNA também foi confirmada pelo quimógrafo, no qual os sinais de fluorescência desapareciam sempre que o fluxo era desligado (Figura 2D). Como a Abo1 é uma ATPase AAA+, o efeito da hidrólise de ATP sobre a atividade de carga de histonas de Abo1 foi examinado16. Poucos pontos fluorescentes apareceram na cortina de DNA na ausência de nucleotídeo (Apo) ou na presença de ADP (Figura 2E), indicando que dímeros H3-H4 raramente se ligam ao DNA no estado Apo ou na presença de ADP. A Figura 2F mostra as análises quantitativas da Figura 2B,C e da Figura 2E, mostrando que o número de dímeros H3-H4 ligados ao DNA aumenta na presença de ATP. Os resultados sugerem que a hidrólise de ATP é essencial para a carga de H3-H4 no DNA por Abo1 (Figura 2E,F).
Em seguida, testou-se se Abo1 carrega preferencialmente histonas na sequência Widom 601, que tem uma afinidade de ligação dez vezes maior com histonas do que sequências aleatórias in vitro, embora os nucleossomos não tenham especificidade para a sequência Widom 601 invivo36,37,38,39,40. A cortina de DNA foi formada com DNA lambda que contém repetições Widom 601 em uma extremidade ou internamente (Figura 3A,B). A paisagem de ligação dos dímeros H3-H4 em cada construção de DNA foi obtida (Figura 3C,D). O local de ligação do Cy5-H3-H4 foi estimado a partir da posição central do ajuste Gaussiano 2D para cada ponto fluorescente17,41. Se a atividade de carregamento de H3-H4 de Abo1 depende da sequência de DNA, então a distribuição de ligação seria inclinada para a sequência Widom 601. A Figura 3C,D mostra os histogramas de distribuição de ligação dos dímeros H3-H4 por Abo1 em DNA lambda contendo repetições Widom 601 no final (dez repetições) e internamente (cinco repetições), respectivamente. Não houve ligação preferencial às múltiplas repetições Widom 601, e a distribuição de ligação foi aleatória, sugerindo que Abo1 não tem preferência pela sequência Widom 601, mas carrega H3-H4 no DNA de maneira independente da sequência (Figura 3C,D).
Figura 1: Preparação da célula de fluxo. (A) Esquemas de montagem de células de fluxo e sistema de cortina de DNA. A câmara microfluídica pode ser formada entre uma lâmina de sílica fundida e uma lamínula de vidro presa com fita dupla face. Sob o fluxo hidrodinâmico na câmara, uma grande quantidade de moléculas de DNA lambda são alinhadas em uma barreira de difusão (uma nano-trincheira aqui) por causa da fluidez da bicamada lipídica e esticadas como uma cortina. Na visão ampliada da barreira de difusão, a nano-trincheira tem padrões de dentes de serra com passo de 1,5 μm, largura de 350 nm e profundidade de 1,4 μm. (B) Fotografia do sistema microfluídico constituído por uma bomba de seringa, uma válvula de fecho e uma válvula de injeção de amostras de 6 vias com uma alça de amostra. (C) Fotos dos componentes do suporte de lâminas (esquerda), a montagem dos suportes e da célula de fluxo (meio) e a célula de fluxo totalmente montada montada em um microscópio TIRF feito sob medida (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visualização do carregamento de histonas por Abo1 usando cortina de DNA de molécula única. (A) Imagem da cortina de DNA, onde moléculas de DNA coradas com YOYO-1 (verde) estão bem alinhadas em uma barreira de difusão. (B) Imagens de Cy5-H3-H4 (vermelho) sem Abo1. (C) Imagens de Cy5-H3-H4 (vermelho) carregado por Abo1 na presença (superior) e ausência (inferior) de fluxo tampão. (D) Quimógrafo extraído de uma única molécula de DNA de (C). Quando o fluxo é temporariamente desligado, os sinais de fluorescência Cy5 desaparecem, indicando que Cy5-H3-H4 se liga ao DNA, mas não à superfície da lâmina. (E) Imagem de Cy5-H3-H4 carregado por Abo1 sem nucleotídeo (Apo) (topo). Imagem de Cy5-H3-H4 carregado por Abo1 na presença de ADP (fundo). (F) Quantificação de Cy5-H3-H4 carregado por Abo1 de acordo com nucleotídeos. As barras de erro representam o desvio padrão em triplicata. Cada experimento envolveu a análise de 100-200 moléculas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Carregamento independente de sequência de H3-H4 por Abo1. (A) Uma extremidade do DNA lambda é ancorada ao lipídio biotinilado via estreptavidina, e a outra extremidade contém dez repetições da sequência Widom 601 (topo). O outro DNA lambda contém cinco repetições da sequência Widom 601 dentro do DNA lambda (abaixo). (B) Esquema do ensaio de cortina de DNA com DNA lambda contendo repetições Widom 601. (C,D) Histogramas de distribuição de ligação de Cy5-H3-H4 em DNA lambda contendo repetições Widom 601 no final (C) e internamente (D). Não há especificidade de sequência para o DNA quando H3-H4 é montado por Abo1. As barras de erro são obtidas pelo bootstrapping42 com um intervalo de confiança de 70%. O total de eventos é de 312 e 252 para (C) e (D), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Como uma técnica de imagem de molécula única, a cortina de DNA tem sido usada extensivamente para sondar reações metabólicas do DNA43. A cortina de DNA é um sistema híbrido que concatena fluidez lipídica, microfluídica e TIRFM. Ao contrário de outras técnicas de molécula única, a cortina de DNA permite a visualização em tempo real de alto rendimento das interações proteína-DNA. Portanto, a técnica de cortina de DNA é adequada para investigar o mecanismo por trás das interações moleculares, incluindo associação seqüência-específica, movimento de proteínas junto com o DNA e colisão proteína-proteína no DNA 17,20,26. Além disso, a natureza de alto rendimento da cortina de DNA permite a coleta de dados suficientes para garantir a confiabilidade estatística. A cortina de DNA facilita a investigação das propriedades biofísico-químicas das proteínas, incluindo parâmetros cinéticos, coeficiente de difusão, velocidade e processividade 17,26,27,30. É importante ressaltar que a cortina de DNA pode ser usada para determinar a paisagem de ligação da deposição de nucleossomos, o que indica a preferência de sequência intrínseca dos nucleossomos30.
Vários pontos precisam ser considerados para obter dados de alta qualidade a partir do ensaio de cortina de DNA. Primeiro, a bicamada lipídica deve ser adequadamente formada na superfície da lâmina. A fluidez da bicamada lipídica permite que as moléculas de DNA se movam sobre a lâmina e sejam alinhadas em uma barreira de difusão na presença de fluxo hidrodinâmico. A bicamada lipídica também passiva a superfície da câmara microfluídica para evitar a adsorção inespecífica de proteínas à superfície. Como a passivação pela bicamada lipídica não é completa, proteínas marcadas fluorescentemente são adsorvidas inespecificamente à superfície, levando a uma interpretação incorreta dos resultados. No entanto, as proteínas presas à superfície podem ser distinguidas das ligadas ao DNA ligando e desligando o fluxo transitório porque as proteínas ligadas ao DNA desaparecem quando o fluxo para. Em segundo lugar, o fotoclareamento de fluoróforos precisa ser suprimido. Muitos métodos de imagem de fluorescência de molécula única adotam um sistema de remoção de oxigênio para reduzir o fotoclareamento. Vários sistemas de remoção de oxigênio foram desenvolvidos, o mais popular dos quais é o gloxy. Gloxy, consistindo de glicose oxidase e catalase, reduz enzimaticamente os oxigênios moleculares em solução, mas reduz o pH 44,45,46. O pH baixo não é compatível com as condições fisiológicas e reduz a fluidez lipídica. Para retardar a diminuição do pH, (1) o tampão de imagem precisa ser preparado com água deionizada desgaseificada, (2) o tampão deve ser usado imediatamente e (3) o tampão deve ser selado e armazenado em gelo até o uso.
Uma plataforma única foi desenvolvida para melhorar o sistema de cortina de DNA no qual nano-trincheiras esculpidas servem como barreiras de difusão em vez de nano-padrões de cromo25. Como essas nanotrincheiras são mais robustas sob condições de limpeza severas com solventes fortes, elas permitem imagens repetíveis e mais claras. No entanto, a técnica de cortina de DNA tem várias limitações. Sob iluminação contínua a laser, os fluoróforos que marcam as proteínas são fotobranqueados, tornando as medições de longo prazo desafiadoras. A cortina de DNA não funciona em pH baixo (menor que ~6) porque a bicamada lipídica não é fluídica. Além disso, o fundo da fluorescência e a ligação inespecífica de proteínas à superfície da lâmina perturbam a imagem de uma única molécula quando a concentração de proteínas é alta. Outra desvantagem da cortina de DNA é que a resolução espacial da cortina de DNA é de ~1 kbp/pixel, de modo que o movimento de proteínas a menos de 1 kbp não pode ser observado. Além disso, a cortina de DNA aplica continuamente força hidrodinâmica às proteínas no DNA. Mas a força pelo fluxo é fraca (menos de 1 pN) e, portanto, é desafiador que histonas ou nucleossomos se movam ao longo do DNA na cortina. Também foi relatado que nucleossomos raramente deslizam ao longo do DNA sem remodeladores de cromatina47. Se histonas ou nucleossomos deslizarem ao longo do DNA, a maioria deles ficará na região final do DNA na cortina. No entanto, não observamos a distribuição enviesada. Por outro lado, se histonas ou nucleossomos escoarem do DNA terminam, eles seriam esgotados no final do DNA. Também não observamos isso.
Este trabalho demonstra que o ensaio de cortina de DNA é uma plataforma de imagem de molécula única ideal para investigar a dinâmica da cromatina. A cortina de DNA pode ser aplicada para estudar o processo pelo qual chaperonas de histonas, como as ATPases AAA+ contendo bromodomínio, montam a cromatina. A função biológica das ATPases AAA+ contendo bromodomínio é controversa. A falta de ATAD2 ou Yta7 humanos diminui a expressão gênica via condensação da cromatina18. Em contraste, S. pombe Abo1 aumenta a densidade nucleossômica16. Os estudos de molécula única mostram que Abo1 catalisa a carga de histona H3-H4 no DNA. Mostra-se que a atividade de carga de histonas de Abo1 é dependente da hidrólise de ATP (Figura 2C,E,F). Além disso, a distribuição de ligação dos dímeros H3-H4 mostra que os dímeros H3-H4 são carregados no DNA por Abo1 de forma independente de sequência (Figura 3). Em conclusão, a cortina de DNA pode ser usada para desvendar o papel biológico de Abo1 como chaperona de histonas na montagem de histonas. Usando a técnica de cortina de DNA, a formação de nucleossomos por Abo1 e outras chaperonas de histonas como CAF-1 e FACT será estudada no futuro.
Com base nesse protocolo, o ensaio de cortina de DNA pode ser usado para observar a reorganização da cromatina por meio do remodelamento de complexos que translocam e rearranjam nucleossomos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio gentil para Abo1 e Cy5-H3-H4 pelo Professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., e Juwon Jang, Ph.D., em KAIST, Coreia do Sul. Este trabalho é apoiado pela National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), pelo fundo de pesquisa intramuros (1.210115.01) do Ulsan National Institute of Science and Technology e pelo Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
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