Summary
고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.
Abstract
크로마틴은 진핵생물 DNA를 포장하는 고차원 구조입니다. 크로마틴은 세포 주기 단계와 환경 자극에 대한 반응에 따라 동적 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 게놈 무결성, 후성유전학적 조절 및 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 대사 반응에 필수적입니다. 염색질 조립은 염색질 역학에 매우 중요하며 히스톤 샤페론에 의해 촉매됩니다. 광범위한 연구에도 불구하고 히스톤 샤페론이 염색질 조립을 가능하게 하는 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 더욱이, 히스톤 샤페론(histone chaperone)에 의해 조직된 뉴클레오솜(nucleosome)의 전반적인 특징은 잘 이해되지 않고 있다. 이 문제를 다루기 위하여는, 이 일은 히스톤 chaperones에 의하여 뉴클레오솜 집합의 분자 세부사항의 수사를 촉진하는 DNA 커튼이라고 지명된 유일한 단 하나 분자 화상 진찰 기술을 기술합니다. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 전반사 형광 현미경(TIRFM)을 결합하여 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 이미징을 위한 범용 플랫폼을 제공하는 하이브리드 기술입니다. DNA 커튼을 사용하여 Abo1의 히스톤 샤페론 기능, Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase를 조사하고 Abo1의 히스톤 조립의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝힙니다. DNA 커튼은 염색질 역학을 연구하기 위한 독특한 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
진핵생물 DNA는 염색질 1,2로 알려진 고차원 구조로 포장되어 있습니다. 뉴클레오솜은 크로마틴의 기본 단위로, 팔각형 코어 히스톤 3,4를 감싸고 있는 약 147bp DNA로 구성됩니다. 염색질은 진핵 세포에서 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 조밀한 구조는 내인성 요인과 외인성 위협으로부터 DNA를 보호한다5. 염색질 구조는 세포주기 단계와 환경 자극에 따라 동적으로 변화하며, 이러한 변화는 복제, 전사 및 복구와 같은 DNA 거래 중에 단백질 접근을 제어한다6. 염색질 역학은 게놈 안정성과 후성유전학적 정보에도 중요합니다.
염색질은 히스톤 꼬리 변형 및 염색질 리모델러, 폴리콤 그룹 단백질 및 히스톤 샤페론과 같은 염색질 조직자를 포함한 다양한 요인에 의해 동적으로 조절됩니다7. 히스톤 샤페론은 코어 히스톤의 증착 또는 분리를 통해 뉴클레오솜의 조립 및 분해를 조정합니다 8,9. 히스톤 샤페론의 결함은 게놈 불안정성을 유발하고 발달 장애와 암을 유발한다 9,10. 다양한 히스톤 샤페론은 뉴클레오솜 9,11,12,13을 조립하거나 분해하기 위해 ATP 가수 분해와 같은 화학적 에너지 소비가 필요하지 않습니다. 최근 연구자들은 브로모도메인 함유 AAA+(다양한 세포 활동과 관련된 ATPase) ATPase가 히스톤 샤페론 14,15,16,17로 염색질 역학에서 역할을 한다고 보고했습니다. 인간 ATAD2(ATPase 계열 AAA 도메인 함유 단백질 2)는 염색질 접근성을 촉진하여 유전자 발현을 향상시킵니다18. 전사 공동-조절자로서, ATAD2는 발암성 전사인자(oncogenic transcriptional factor)의 염색질을 조절하며(14), ATAD2의 과발현은 많은 유형의 암에서 나쁜 예후와 관련이 있다19. ATAD2의 맥주효모균(S. cerevisiae) 상동체인 Yta7은 염색질15의 뉴클레오솜 밀도를 감소시킵니다. 대조적으로, ATAD2의 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) 상동체인 Abo1은 뉴클레오솜 밀도16을 증가시킨다. 독특한 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼을 사용하여 Abo1이 뉴클레오솜 조립 또는 분해에 기여하는지 여부를 다룹니다17,20.
전통적으로 생체 분자의 생화학적 특성은 많은 수의 분자를 조사하는 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 또는 co-immunoprecipitation(co-IP)과 같은 벌크 실험에 의해 조사되어 왔으며 평균 특성은21,22를 특성화합니다. 대량 실험에서 분자 하위 상태는 앙상블 평균 효과에 의해 가려지며 생체 분자 상호 작용 조사가 제한됩니다. 대조적으로, 단일 분자 기술은 대량 실험의 한계를 우회하고 생체 분자 상호 작용의 상세한 특성 분석을 가능하게 합니다. 특히, 단일 분자 이미징 기술은 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다23. 그러한 기술 중 하나는 DNA 커튼, 미세 유체 역학 및 전체 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) 24,25을 기반으로 한 독특한 단일 분자 이미징 기술입니다. DNA 커튼에서는 수백 개의 개별 DNA 분자가 지질 이중층에 고정되어 지질 유동성으로 인해 DNA 분자의 2차원 운동을 허용합니다. 유체역학적 흐름이 적용되면 DNA 분자는 이중층의 흐름을 따라 이동하고 확산 장벽에 갇혀 정렬되고 늘어납니다. DNA가 삽입제로 염색되는 동안 형광 표지된 단백질이 주입되고 TIRFM을 사용하여 단일 분자 수준23에서 실시간으로 단백질-DNA 상호 작용을 시각화합니다. DNA 커튼 플랫폼은 확산, 전위 및 충돌과 같은 단백질 이동의 관찰을 용이하게 합니다 26,27,28. 또한, DNA 커튼은 정의된 위치, 방향 및 토폴로지를 가진 DNA에 대한 단백질 매핑에 사용되거나 단백질과 핵산의 상 분리 연구에 적용될 수 있습니다 29,30,31.
이 연구에서 DNA 커튼 기술은 특정 단백질의 직접적인 시각화를 통해 샤페론의 기능에 대한 증거를 제공하는 데 사용됩니다. 또한, DNA 커튼은 처리량이 많은 플랫폼이기 때문에 통계적 신뢰성에 충분한 데이터 수집을 용이하게 합니다. 여기에서는 S. pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase Abo1의 분자 역할을 조사하기 위해 DNA 커튼 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 플로우 셀(flow cell)의 준비
- 이전에 발표된 보고서25에 따라 나노 트렌치 패턴을 포함하는 세척된 용융 실리카 슬라이드를 준비합니다.
- 다이아몬드 코팅된 드릴 비트를 사용하여 세척된 용융 실리카 슬라이드(그림 1A)에 직경 1mm의 구멍 두 개를 뚫습니다( 재료 표 참조).
- 250mTorr의 아르곤 가스와 함께 DC스퍼터 32 ( 재료 표 참조)를 사용하여 슬라이드에 10nm의 두꺼운 알루미늄(Al)을 증착합니다.
- 4% 950K 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)( 재료 표 참조)의 310nm 두께 층을 4,000rpm에서 1분 동안 스핀 코팅하고 180°C의 열판에서 3분 동안 굽습니다.
- 80kV에서 0.724nA 전류로 전자빔(ebeam) 리소그래피(33 )를 사용하여 두 구멍 사이의 PMMA 층 상에 나노 트렌치 패턴을 그립니다.
알림: 나노 트렌치 패턴의 구조와 치수는 그림 1A에 나와 있습니다. - 슬라이드를 현상액(메틸 이소부틸 케톤과 이소프로판올의 1:3 비율, 재료 표 참조)에 2분 동안 담가 ebeam에 노출된 PMMA를 제거합니다.
- 염소(Cl2) 및 삼염화 붕소(BCl3) 가스를 사용하는 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭(ICP-RIE)이 있는 에칭 Al 층.
알림: 이 두 가스는 ebeam에 노출된 영역에서 Al을 제거할 수 있습니다. - 사불화황(SF4), 테트라플루오로메탄(CF4) 및 산소(O2) 가스를 사용하여 슬라이드에 나노 트렌치를 조각합니다( 재료 표 참조).
- 슬라이드를 Al 에칭액(AZ 300 MIF 현상액, 재료 표 참조)에 10분 동안 담가 나머지 Al 층을 제거합니다.
- 제작 후 슬라이드를 탈 이온수로 헹구고 목욕 형 초음파 발생기를 사용하여 30 분 동안 아세톤으로 초음파 처리합니다.
- 슬라이드를 2% Hellmanex III 용액( 재료 표 참조)에서 자석 교반으로 최소 1일 동안 세척합니다.
- 슬라이드를 아세톤으로 30분 동안 초음파 처리하고 1M NaOH에서 30분 동안 연속적으로 초음파 처리합니다.
- 슬라이드를 탈이온수로 헹구고 질소(N2) 가스로 건조시킵니다.
- 양면 테이프의 중앙에 깨끗한 용지(5mm x 35mm)를 놓습니다. 슬라이드 위에 테이프를 부착하여 두 개의 구멍과 나노 패턴을 종이로 덮습니다.
- 깨끗한 칼날을 사용하여 용지를 절제합니다(그림 1A).
- 양면 테이프 위에 유리 커버슬립을 놓고 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 문질러 미세유체 챔버를 형성합니다(그림 1A).
- 조립된 플로우 셀을 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 놓고 클립으로 고정합니다.
- 플로우 셀을 120°C 진공 오븐에서 45분 동안 굽습니다.
- 핫 글루건을 사용하여 칩 기반 분석용 유체 커넥터( Nanoport)(재료 표 참조)를 열린 각 구멍에 부착하고 두 줄의 루어 잠금 튜브를 연결합니다.
- 탈이온수 3mL가 들어 있는 Luer 잠금 주사기를 연결하고 챔버를 세척합니다.
- 드롭 바이 드롭 연결을 통해 3mL의 지질 완충액 (20mM의 Tris-HCl, pH 8.0 및 100mM의 NaCl)으로 챔버를 세척합니다.
참고: 드롭바이드롭(drop-by-drop) 연결은 챔버에 기포가 주입되는 것을 방지하기 위해 모든 주사기를 플로우 셀에 연결합니다. - 지질 완충액에 있는 0.04x 비오틴화 지질 1mL를 샷당 5분 배양하여 두 번에 챔버에 주입합니다.
참고: 1x 비오틴화 지질 스톡의 제조는 이전에 발표된 보고서34에 설명되어 있습니다. - 챔버를 3mL의 지질 완충액으로 세척하고 슬라이드 표면에서 지질 이중층이 성숙되도록 20분 동안 배양합니다.
- BSA 완충액 1mL(Tris-HCl 40mM, pH 8.0, NaCl 50mM, MgCl2 2mM, BSA 0.2mg/mL)를 넣고 5분 동안 배양하여 슬라이드 표면을 부동태화합니다.
참고: 이 단계는 슬라이드 표면에 대한 단백질의 비특이적 결합을 줄일 수 있습니다. - 0.025mg/mL의 스트렙타비딘을 BSA 완충액 1mL에 2회 주입하고 10분 동안 배양합니다.
- 잔류 스트렙타비딘을 3mL의 BSA 완충액으로 씻어냅니다.
- BSA 완충액 1mL에 ~300pM(30μL)의 비오틴화된 람다 파지 DNA를 2회 발사하고 10분 배양하여 챔버에 주입합니다.
참고: 비오틴화된 람다 DNA의 제조는 이전에 발표된 보고서34에 기재되어 있다.
2. 플로우 셀을 미세유체 시스템에 연결하고 현미경에 로딩
- Abo1 이미징 완충액(Tris-HCl 50mM, pH 8.0, NaCl 100mM, DTT 1mM, ATP 1mM,MgCl2 2mM, 글루코스 1.6% 및 글록시 0.1x, 재료 표 참조)을 준비합니다.
알림: Gloxy는 형광 염료의 광표백을 줄이는 산소 제거 시스템입니다. 글루코스 산화효소 및 카탈라아제를 이용한 100x 글록시 스톡의 제조는 참고문헌35에 기재되어 있다. - 10mL의 이미징 버퍼가 들어 있는 주사기를 주사기 펌프에 연결하고 미세유체 시스템의 모든 튜브 라인에서 기포를 제거합니다.
- drop-to-drop 연결을 통해 준비된 플로우 셀을 미세유체 시스템과 연결하여 플로우 셀에 기포가 주입되는 것을 방지합니다(그림 1B).
- 플로우 셀(flow cell)과 플로우 셀(flow cell) 홀더를 조립하고 맞춤형 TIRF 현미경에 어셈블리를 장착합니다(그림 1C).
주의: 플로우 셀(flow cell)을 현미경 아래에 놓을 때 대물렌즈의 높이를 조심스럽게 설정하십시오. 플로우 셀이 대물렌즈에 닿지 않아야 합니다. 렌즈가 손상될 수 있습니다. - 플로우 셀(flow cell)의 중앙에 인덱스 매칭 오일을 떨어뜨리고 오일 드롭(oil drop)에 맞춤형 dove 프리즘( 재료 표 참조)을 놓습니다.
3. DNA 커튼을 이용한 Abo1에 의한 히스톤 조립
- 150μL의 이미징 버퍼에 5nM의 Abo1과 12.5nM의 Cy5 표지된 H3-H4 히스톤 이량체(Cy5-H3-H4)( 재료 표 참조)를 혼합합니다. 모든 단백질은 이전에 발표된 보고서17에 따라 제조되었습니다.
- 혼합물을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
알림: Cy5의 광표백을 방지하려면 어둠 속에서 배양을 해야 합니다. - 100μL의 샘플 루프를 통해 이미징 버퍼에 ~20pM(2μL)의 YOYO-1 염료를 주입하여 람다 DNA 분자를 염색합니다.
- 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 실행하고 488nm 레이저를 켜서 DNA 커튼이 잘 형성되었는지 확인합니다.
참고: DNA 커튼이 잘 형성된 경우, YOYO-1로 염색된 DNA 분자는 흐름이 있는 장벽에서 정렬된 선으로 표시됩니다. 늘어난 선은 흐름이 꺼지면 반동하고 장벽에서 멀리 확산됩니다. - 고염 완충액 2mL(NaCl 200mM 및MgCl2 40mM)를 주입하여 DNA에서 YOYO-1 염료를 제거합니다.
- YOYO-1 염료를 제거한 후, 미리 배양된 단백질 시료를 주입합니다.
- 단백질이 DNA 커튼에 도달하면 주사기 펌프를 끄고 차단 밸브를 끄고 Abo1에 의한 히스톤 로딩을 위해 15분 동안 배양합니다.
- 결합되지 않은 Abo1과 히스톤 단백질을 5분 동안 씻어냅니다.
- 차단 밸브를 켜고 유량 주입을 재개합니다.
- 637nm 레이저를 켜고 버퍼 흐름이 켜져 있는 동안 형광 단백질을 이미지화합니다.
- 히스톤 단백질이 DNA에 로드되었는지 확인하기 위해 버퍼 흐름을 일시적으로 끕니다(그림 2C).
- 이미지 획득 프로그램으로 DNA 커튼 이미지를 수집합니다( 재료 표 참조).
참고: 완충액 흐름이 일시적으로 멈추면 DNA는 전체 내부 반사의 소멸장에서 반동하고 DNA에 결합된 형광 표지 단백질이 사라집니다.
4. 데이터 분석
- 이미지 획득 프로그램으로 촬영한 이미지를 이미지 시퀀스로 TIFF 형식으로 변환합니다.
참고: 모든 데이터는 참고 문헌20에 설명된 대로 이미지 J(NIH)를 사용하여 분석되었습니다. - 이미지 염기서열에서 단일 DNA 분자를 선택하고 카이모그래프를 그립니다.
참고 : kymograph는 시간의 함수로 단일 DNA 분자에 결합 된 각 히스톤 단백질의 형광 강도 변화를 보여줄 수 있습니다. - 카이모그래프에서 형광 강도 프로파일을 생성하고 여러 가우스 함수에 맞춥니다.
- 형광 강도 프로파일에서 피크의 중심 좌표를 수집합니다. 이 단계에서 히스톤 형광의 최소 강도를 얻을 수 있습니다.
- 프로파일에서 수집된 모든 피크 강도를 최소 강도로 나눕니다. 이 단계에서 DNA에 결합된 H3-H4 이량체의 수를 추정합니다.
- 다른 DNA 분자에 대해 4.2-4.5단계를 수행합니다.
- Bin 크기가 1kbp인 H3-H4 이량체의 결합 분포에 대한 히스토그램을 생성합니다. 분석된 분자의 수는 300개 이상입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 작업은 DNA 커튼 분석을 위한 플로우 셀 준비 절차를 설명합니다(그림 1A). DNA 커튼 분석은 Abo1에 의한 DNA에 대한 히스톤 H3-H4 이량체 조립의 연구를 촉진했습니다. 먼저, 삽입 염료인 YOYO-1로 DNA 분자를 염색하여 DNA 커튼 형성을 확인했습니다. 녹색 선은 병렬 배열로 표시되었는데, 이는 YOYO-1이 DNA 분자에 삽입되어 유체역학적 흐름 하에서 확산 장벽에서 잘 정렬되고 늘어났음을 나타냅니다(그림 2A). YOYO-1이 DNA와 히스톤 단백질의 상호작용을 방해할 가능성을 배제하기 위해, 히스톤 단백질을 첨가하기 전에 고염 완충액으로 DNA에서 YOYO-1을 제거하였다. Abo1이 없는 상태에서 Cy5-H3-H4 이량체를 DNA 커튼에 주입했을 때 Cy5-H3-H4는 DNA에 결합하지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 DNA에 자발적으로 결합하지 않았음을 나타냅니다(그림 2B). Cy5-H3-H4에 Abo1을 주입했을 때 DNA 분자에서 적색 형광 반점이 관찰되어 Abo1이 H3-H4 이량체를 DNA에 로드한다는 것을 시사합니다(그림 2C). 완충액 흐름은 Cy5-H3-H4 이량체가 DNA에 결합하는 동안 슬라이드 표면에 결합하지 않도록 일시적으로 차단되었습니다. 흐름이 꺼졌을 때, DNA 분자가 증발장에서 반동했기 때문에 DNA에 결합된 형광 표지 단백질이 사라졌습니다. 대조적으로, 표면에 흡착된 단백질은 동일하게 유지되었습니다. 형광 신호는 흐름이 없을 때 사라졌다가 흐름이 재개되었을 때 다시 나타났으며, 이는 H3-H4 이량체가 DNA에 결합한다는 것을 시사합니다(그림 2C). H3-H4 이량체가 DNA에 결합하는 것은 카이모그래프에서도 확인되었는데, 흐름이 꺼질 때마다 형광 신호가 사라졌습니다(그림 2D). Abo1은 AAA+ ATPase이기 때문에, Abo1의 히스톤 로딩 활성에 대한 ATP 가수분해의 효과를 조사하였다16. 뉴클레오티드(Apo)가 없거나 ADP가 있는 경우(그림 2E)에 DNA 커튼에 형광 반점이 거의 나타나지 않았으며, 이는 H3-H4 이량체가 Apo 상태 또는 ADP의 존재 하에서 DNA에 거의 결합하지 않음을 나타냅니다. 그림 2F는 그림 2B, C 및 그림 2E의 정량 분석을 보여주며, ATP가 존재할 때 DNA에 결합된 H3-H4 이량체의 수가 증가한다는 것을 보여줍니다. 결과는 ATP 가수분해가 Abo1에 의한 DNA에 H3-H4 로딩에 필수적임을 시사합니다(그림 2E,F).
다음으로, 뉴클레 오솜이 생체 내Widom 601 서열에 대한 특이성을 갖지 않음에도 불구하고 Abo1이 시험관 내 무작위 서열보다 히스톤에 대한 결합 친화도가 10배 더 높은 Widom 601 서열에 히스톤을 우선적으로 로드하는지 여부를 테스트했습니다. DNA 커튼은 한쪽 끝 또는 내부에 Widom 601 반복을 포함하는 람다 DNA로 형성되었습니다(그림 3A,B). 각 DNA 구조체에 대한 H3-H4 이량체의 결합 풍경을 얻었습니다(그림 3C,D). Cy5-H3-H4의 결합 위치는 각 형광 푼크툼17,41에 대한 2D 가우스 피팅의 중심 위치로부터 추정되었습니다. Abo1의 H3-H4 로딩 활성이 DNA 서열에 의존하는 경우, 결합 분포는 Widom 601 서열로 치우쳐 있을 것입니다. 그림 3C,D는 각각 끝(10회 반복) 및 내부(5회 반복)에 Widom 601 반복을 포함하는 람다 DNA에서 Abo1에 의한 H3-H4 이량체의 결합 분포 히스토그램을 표시합니다. 다중 Widom 601 반복에 대한 우선적 결합은 없었고, 결합 분포는 무작위적이었으며, 이는 Abo1이 Widom 601 서열에 대한 선호도를 갖지 않고 대신 서열 독립적인 방식으로 DNA에 H3-H4를 로드한다는 것을 시사합니다(그림 3C,D).
그림 1: 플로우 셀(flow cell) 준비. (A) 플로우 셀 조립 및 DNA 커튼 시스템의 개략도. 미세유체 챔버는 용융 실리카 슬라이드와 양면 테이프로 접착된 유리 커버슬립 사이에 형성될 수 있습니다. 챔버의 유체역학적 흐름 하에서 많은 양의 람다 DNA 분자가 지질 이중층의 유동성으로 인해 확산 장벽(여기서는 나노 트렌치)에 정렬되고 커튼처럼 늘어납니다. 확산 장벽을 확대하여 볼 때, 나노 트렌치는 1.5μm 피치, 350nm 너비 및 1.4μm 깊이의 톱니 패턴을 가지고 있습니다. (B) 주사기 펌프, 차단 밸브 및 샘플 루프가 있는 6방향 샘플 주입 밸브로 구성된 미세유체 시스템의 사진. (C) 슬라이드 홀더 구성 요소(왼쪽), 홀더 및 플로우 셀 조립(가운데), 맞춤형 TIRF 현미경에 장착된 완전히 조립된 플로우 셀(오른쪽)의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단일 분자 DNA 커튼을 사용한 Abo1에 의한 히스톤 로딩의 시각화. (A) YOYO-1(녹색)로 염색된 DNA 분자가 확산 장벽에서 잘 정렬된 DNA 커튼의 이미지. (B) Abo1이 없는 Cy5-H3-H4(빨간색)의 이미지. (C) 버퍼 흐름의 존재(위)와 부재(아래)에서 Abo1에 의해 로드된 Cy5-H3-H4(빨간색)의 이미지. (D) (C)의 단일 DNA 분자에서 추출한 카이모그래프. 흐름이 일시적으로 꺼지면 Cy5 형광 신호가 사라지고 Cy5-H3-H4가 DNA에 결합하지만 슬라이드 표면에는 결합하지 않음을 나타냅니다. (E) 뉴클레오티드(Apo) 없이 Abo1에 의해 로드된 Cy5-H3-H4의 이미지(상단). ADP가 있는 상태에서 Abo1에 의해 로드된 Cy5-H3-H4의 이미지(아래). (F) 뉴클레오티드에 따라 Abo1에 의해 로드된 Cy5-H3-H4의 정량화. 오차 막대는 표준 편차를 세 배로 나타냅니다. 각 실험에는 100-200개의 분자 분석이 포함되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Abo1에 의한 H3-H4의 시퀀스 독립적 로딩. (A) 람다 DNA의 한쪽 끝은 스트렙타비딘을 통해 비오틴화된 지질에 고정되어 있고, 다른 쪽 끝에는 Widom 601 서열의 10회 반복이 포함되어 있습니다(상단). 다른 람다 DNA는 람다 DNA 내부에 Widom 601 염기서열의 5개 반복을 포함하고 있다(아래). (B) Widom 601 반복을 포함하는 람다 DNA를 사용한 DNA 커튼 분석의 개략도. (씨,디) Widom 601을 포함하는 람다 DNA에서 Cy5-H3-H4의 결합 분포 히스토그램은 끝(C)과 내부(D)에서 반복됩니다. H3-H4가 Abo1에 의해 조립될 때 DNA에 대한 염기서열 특이성은 없습니다. 오차 막대는 70% 신뢰구간으로42 를 부트스트랩하여 구합니다. (C)와 (D)의 총 이벤트는 각각 312개와 252개입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
단일 분자 이미징 기술로서, DNA 커튼은 DNA 대사 반응을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다43. DNA 커튼은 지질 유동성, 미세유체역학 및 TIRFM을 연결하는 하이브리드 시스템입니다. 다른 단일 분자 기술과 달리 DNA 커튼은 단백질-DNA 상호 작용의 고처리량 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 따라서 DNA 커튼 기술은 염기서열 특이적 연관성, DNA와 함께 단백질 이동, DNA 17,20,26에 대한 단백질-단백질 충돌을 포함한 분자 상호 작용의 메커니즘을 조사하는 데 적합합니다. 또한 DNA 커튼의 고처리량 특성으로 인해 통계적 신뢰성을 보장하기에 충분한 데이터를 수집할 수 있습니다. DNA 커튼은 운동 매개 변수, 확산 계수, 속도 및 진행도 17,26,27,30을 포함하여 단백질의 생체 물리 화학적 특성의 조사를 용이하게합니다. 중요하게도, DNA 커튼은 뉴클레오솜 증착의 결합 환경을 결정하는데 사용될 수 있으며, 이는 뉴클레오솜(30)의 고유한 서열 선호도를 나타낸다.
DNA 커튼 분석에서 고품질 데이터를 얻기 위해서는 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 먼저, 지질 이중층이 슬라이드 표면에 적절하게 형성되어야 합니다. 지질 이중층의 유동성은 DNA 분자가 슬라이드에서 이동하고 유체역학적 흐름이 있는 경우 확산 장벽에 정렬될 수 있도록 합니다. 지질 이중층은 또한 미세유체 챔버의 표면을 부동태화하여 표면에 단백질이 비특이적으로 흡착되는 것을 방지합니다. 지질 이중층에 의한 패시베이션이 완전하지 않기 때문에 형광 표지된 단백질이 표면에 비특이적으로 흡착되어 결과를 잘못 해석할 수 있습니다. 그러나 표면에 붙어있는 단백질은 일시적인 흐름을 켜고 끄는 것으로 DNA 결합 단백질과 구별할 수 있는데, 이는 흐름이 멈추면 DNA 결합 단백질이 사라지기 때문입니다. 둘째, 형광단의 광표백을 억제해야 합니다. 많은 단일 분자 형광 이미징 방법은 광표백을 줄이기 위해 산소 제거 시스템을 채택합니다. 여러 산소 제거 시스템이 개발되었으며 그 중 가장 인기 있는 것은 글록시입니다. 포도당 산화효소와 카탈라아제로 구성된 글록시는 효소로 용액 내 분자 산소를 감소시키지만 pH를 44,45,46으로 낮춥니다. 낮은 pH는 생리학적 조건과 양립할 수 없으며 지질 유동성을 감소시킵니다. pH 감소를 지연시키려면 (1) 탈기된 탈이온수로 이미징 버퍼를 준비해야 하고, (2) 버퍼를 즉시 사용해야 하며, (3) 버퍼를 밀봉하여 사용할 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다.
독특한 플랫폼은 새겨진 나노 트렌치가 크롬 나노 패턴 대신 확산 장벽 역할을하는 DNA 커튼 시스템을 개선하기 위해 개발되었습니다25. 이러한 나노 트렌치는 강한 용매를 사용하는 가혹한 세척 조건에서 더 견고하기 때문에 반복 가능하고 선명한 이미징이 가능합니다. 그러나 DNA 커튼 기술에는 몇 가지 한계가 있습니다. 지속적인 레이저 조명 하에서 단백질을 표지하는 형광단은 광표백되어 장시간 측정이 어렵습니다. DNA 커튼은 지질 이중층이 유체가 아니기 때문에 낮은 pH(~6 미만)에서 작동하지 않습니다. 또한 형광 배경과 슬라이드 표면에 대한 단백질의 비특이적 결합은 단백질 농도가 높을 때 단일 분자 이미징을 방해합니다. DNA 커튼의 또 다른 단점은 DNA 커튼의 공간 해상도가 ~1kbp/픽셀이므로 1kbp 미만에서 단백질의 이동을 관찰할 수 없다는 것입니다. 또한 DNA 커튼은 DNA의 단백질에 유체역학적 힘을 지속적으로 가합니다. 그러나 흐름에 의한 힘은 약하기 때문에(1pN 미만) 히스톤이나 뉴클레오솜이 커튼의 DNA를 따라 이동하는 것은 어렵습니다. 또한 뉴클레오솜(nucleosome)은 염색질 리모델링제(chromatin remodeler) 없이 DNA를 따라 미끄러지는 경우가 드물다고 보고되었다47. 히스톤이나 뉴클레오솜이 DNA를 따라 미끄러지면 대부분은 커튼에 있는 DNA의 끝 영역에 머물러 있습니다. 그러나 편향된 분포는 확인되지 않았습니다. 반면에, 히스톤이나 뉴클레오솜이 DNA 끝에서 흘러나오면 DNA 끝에서 고갈됩니다. 우리도 이것을 관찰하지 못했습니다.
이 연구는 DNA 커튼 분석이 염색질 역학을 조사하는 데 이상적인 단일 분자 이미징 플랫폼임을 보여줍니다. DNA 커튼은 브로모도메인 함유 AAA+ ATPase와 같은 히스톤 샤페론이 염색질을 조립하는 과정을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 브로모도메인 함유 AAA+ ATPase의 생물학적 기능은 논란의 여지가 있습니다. 인간 ATAD2 또는 S. cerevisiae Yta7의 결핍은 염색질 축합을 통해 유전자 발현을 하향 조절한다18. 대조적으로, S. pombe Abo1은 뉴클레오솜 밀도를 증가시킵니다16. 단일 분자 연구는 Abo1이 DNA에 히스톤 H3-H4 로딩을 촉매한다는 것을 보여줍니다. Abo1의 히스톤 로딩 활성은 ATP 가수 분해에 의존하는 것으로 나타났습니다 (그림 2C, E, F). 또한, H3-H4 이량체의 결합 분포는 H3-H4 이량체가 서열과 무관한 방식으로 Abo1에 의해 DNA에 로드됨을 보여줍니다(그림 3). 결론적으로, DNA 커튼은 히스톤 조립에서 히스톤 샤프론으로서의 Abo1의 생물학적 역할을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. DNA 커튼 기술을 사용하여 Abo1 및 CAF-1 및 FACT와 같은 다른 히스톤 샤페론에 의한 뉴클레오솜 형성이 향후 연구될 것입니다.
이 프로토콜을 기반으로 DNA 커튼 분석은 뉴클레오솜을 전위하고 재배열하는 복합체를 리모델링하여 염색질 재구성을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 한국과학기술원(KAIST)의 송지준 교수, Carol Cho 박사, 장주원 교수의 Abo1 및 Cy5-H3-H4에 대한 친절한 지원에 감사드립니다. 본 연구는 국립연구재단 지원금(NRF-2020R1A2B5B01001792), 울산과학기술원 교내 연구비(1.210115.01), 기초과학연구원(IBS-R022-D1)의 지원을 받고 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
