Summary
Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.
Abstract
Kromatin, ökaryotik DNA'yı paketleyen daha yüksek dereceli bir yapıdır. Kromatin, hücre döngüsü fazına göre ve çevresel uyaranlara yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler genomik bütünlük, epigenetik düzenleme ve replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA metabolik reaksiyonları için gereklidir. Kromatin düzeneği, kromatin dinamiği için çok önemlidir ve histon şaperonları tarafından katalize edilir. Kapsamlı çalışmalara rağmen, histon şaperonlarının kromatin montajını mümkün kıldığı mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Ayrıca, histon şaperonları tarafından düzenlenen nükleozomların küresel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu sorunları ele almak için, bu çalışma, histon şaperonları tarafından nükleozom düzeneğinin moleküler ayrıntılarının araştırılmasını kolaylaştıran DNA perdesi adı verilen benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniğini açıklamaktadır. DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için evrensel bir platform sağlamak üzere lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve toplam iç yansıma floresan mikroskobunu (TIRFM) birleştiren hibrit bir tekniktir. DNA perdesi kullanılarak, Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA + ATPaz olan Abo1'in histon şaperon fonksiyonu araştırılır ve Abo1'in histon düzeneğinin altında yatan moleküler mekanizma ortaya çıkarılır. DNA perdesi, kromatin dinamiklerini incelemek için benzersiz bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Ökaryotik DNA, kromatin 1,2 olarak bilinen daha yüksek dereceli bir yapıda paketlenir. Nükleozom, oktamerik çekirdek histonları 3,4 etrafına sarılmış yaklaşık 147 bp DNA'dan oluşan kromatinin temel birimidir. Kromatin, ökaryotik hücrelerde kritik bir rol oynar; örneğin, kompakt yapı DNA'yı endojen faktörlerden ve dışsal tehditlerdenkorur 5. Kromatin yapısı, hücre siklus fazına ve çevresel uyaranlara göre dinamik olarak değişir ve bu değişiklikler, replikasyon, transkripsiyon ve onarım gibi DNA işlemleri sırasında protein erişimini kontrol eder6. Kromatin dinamiği, genomik stabilite ve epigenetik bilgi için de önemlidir.
Kromatin, histon kuyruğu modifikasyonları ve kromatin yeniden şekillendiriciler, policomb grubu proteinleri ve histon şaperonları7 gibi kromatin düzenleyicileri dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından dinamik olarak düzenlenir. Histon şaperonları, çekirdek histonlarınınbirikmesi veya ayrılması yoluyla nükleozomların birleştirilmesini ve sökülmesini koordine eder 8,9. Histon şaperonlarındaki kusurlar genom kararsızlığına neden olur ve gelişimsel bozukluklara ve kansere neden olur 9,10. Çeşitli histon şaperonları, nükleozomları 9,11,12,13 birleştirmek veya sökmek için ATP hidrolizi gibi kimyasal enerji tüketimine ihtiyaç duymaz. Son zamanlarda araştırmacılar, bromodomain içeren AAA + (çeşitli hücresel aktivitelerle ilişkili ATPaz) ATPazların, histon şaperonları 14,15,16,17 olarak kromatin dinamiklerinde rol oynadığını bildirdi. İnsan ATAD2 (ATPase ailesi AAA alanı içeren protein 2), gen ekspresyonunu geliştirmek için kromatin erişilebilirliğini teşvikeder 18. Transkripsiyonel bir yardımcı düzenleyici olarak ATAD2, onkojenik transkripsiyonel faktörlerin14 kromatinini düzenler ve ATAD2'nin aşırı ekspresyonu birçok kanser türünde kötü prognozile ilişkilidir 19. ATAD2'nin Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloğu olan Yta7, kromatin15'teki nükleozom yoğunluğunu azaltır. Buna karşılık, ATAD2'nin Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloğu olan Abo1, nükleozom yoğunluğunuarttırır 16. Benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesi kullanılarak, Abo1'in nükleozom montajına veya sökülmesine katkıda bulunup bulunmadığıele alınmaktadır 17,20.
Geleneksel olarak, biyomoleküllerin biyokimyasal özellikleri, çok sayıda molekülün incelendiği elektroforetik hareketlilik kaydırma testi (EMSA) veya ko-immünopresipitasyon (co-IP) gibi toplu deneylerle incelenmiştir ve ortalama özellikleri karakterize edilmiştir21,22. Toplu deneylerde, moleküler alt durumlar, topluluk ortalaması etkisi ile örtülür ve biyomoleküler etkileşimlerin araştırılması kısıtlanır. Buna karşılık, tek moleküllü teknikler, toplu deneylerin sınırlamalarını ortadan kaldırır ve biyomoleküler etkileşimlerin ayrıntılı karakterizasyonunu sağlar. Özellikle, tek moleküllü görüntüleme teknikleri, DNA-protein ve protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır23. Böyle bir teknik, mikroakışkanlara ve toplam iç yansıma floresan mikroskobuna (TIRFM) dayanan benzersiz bir tek moleküllü görüntüleme tekniği olan DNA perdesidir24,25. Bir DNA perdesinde, yüzlerce ayrı DNA molekülü, lipid akışkanlığı nedeniyle DNA moleküllerinin iki boyutlu hareketine izin veren lipid çift tabakasına bağlanır. Hidrodinamik akış uygulandığında, DNA molekülleri çift tabaka üzerindeki akış boyunca hareket eder ve hizalandıkları ve gerildikleri bir difüzyon bariyerinde sıkışırlar. DNA, interkalasyon ajanları ile boyanırken, floresan etiketli proteinler enjekte edilir ve TIRFM, protein-DNA etkileşimlerini tek molekül seviyesinde gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için kullanılır23. DNA perde platformu, difüzyon, translokasyon ve çarpışma gibi protein hareketlerinin gözlemlenmesini kolaylaştırır 26,27,28. Ayrıca, DNA perdesi, tanımlanmış konumlar, yönelimler ve topolojiler ile DNA üzerinde protein haritalaması için kullanılabilir veya protein ve nükleik asitlerin faz ayrımı çalışmasına uygulanabilir 29,30,31.
Bu çalışmada, DNA perdesi tekniği, spesifik proteinlerin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla şaperonların işlevine kanıt sağlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, DNA perdesi yüksek verimli bir platform olduğundan, istatistiksel güvenilirlik için yeterli miktarda veri toplamayı kolaylaştırır. Burada, S. pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz Abo1'in moleküler rolünü araştırmak için DNA perdesi testinin nasıl yapılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Akış hücresinin hazırlanması
- Daha önce yayınlanmış rapor25'i izleyerek nano hendek desenleri içeren temizlenmiş kaynaşmış bir silika lam hazırlayın.
- Elmas kaplı bir matkap ucu kullanarak temizlenmiş erimiş bir silika slaytta (Şekil 1A) 1 mm çapında iki delik açın (bkz. Malzeme Tablosu).
- 10 mTorr argon gazı ile DC püskürtme32 ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak slayt üzerine 250 nm kalın alüminyum (Al) biriktirin.
- 310 nm kalınlığında %4 950K poli(metil metakrilat) (PMMA) (Malzeme Tablosuna bakınız) tabakasını 4.000 rpm'de 1 dakika döndürün ve 180 °C'de sıcak bir plaka üzerinde 3 dakika pişirin.
- 80 kV'da 0.724 nA akımla elektron ışını (ebeam) litografisi33 kullanarak iki delik arasındaki PMMA tabakası üzerindeki nano hendek desenlerini çizin.
NOT: Nano hendek desenlerinin mimarisi ve boyutları Şekil 1A'da gösterilmiştir. - Slaytları gelişmekte olan çözeltiye (1:3 oranında metil izobütil keton ve izopropanol, bkz. Malzeme Tablosu) 2 dakika bekleterek ebeam'e maruz kalan PMMA'yı çıkarın.
- Klor (Cl2) ve bor triklorür (BCl 3) gazları kullanılarak endüktif olarak eşleştirilmiş plazma-reaktif iyon aşındırma (ICP-RIE) ile aşındırma Al katmanları.
NOT: Bu iki gaz, ışına maruz kalan alanlardan Al'ı çıkarabilir. - Kükürt tetraflorür (SF4), tetraflorometan (CF4) ve oksijen (O2) gazları kullanarak slaytlar üzerinde nano hendekler açın (bkz.
- Slaytları 10 dakika boyunca Al etchant'ta (AZ 300 MIF geliştirici, Malzeme Tablosuna bakın) bekleterek kalan Al katmanını çıkarın.
- İmalattan sonra, slaytları deiyonize su ile durulayın ve banyo tipi bir sonikatör kullanarak 30 dakika boyunca asetonda sonikat yapın.
- Slaytları %2 Hellmanex III solüsyonunda (Malzeme Tablosuna bakınız) manyetik karıştırma ile en az 1 gün temizleyin.
- Slaytları asetonda 30 dakika ve 1 M NaOH'de art arda 30 dakika sonikleştirin.
- Slaytları deiyonize suyla durulayın ve nitrojen (N2) gazı ile kurulayın.
- Çift taraflı bandın ortasına temiz bir kağıt (5 mm x 35 mm) koyun. İki deliği ve nano desenleri kağıtla kapatmak için bandı slaydın üzerine yapıştırın.
- Temiz bir bıçak kullanarak kağıdı kesin (Şekil 1A).
- Çift taraflı bandın üzerine bir cam lamel koyun ve mikroakışkan bir oda oluşturmak için bir pipet ucu kullanarak lamel ovalayın (Şekil 1A).
- Birleştirilmiş akış hücresini iki mikroskop lamı arasına yerleştirin ve klipsleyin.
- Akış hücresini 120 °C vakumlu fırında 45 dakika pişirin.
- Çip bazlı analizler için sıvı konektörünü (Nanoport) (Malzeme Tablosuna bakın) bir sıcak tutkal tabancası kullanarak her bir açık deliğe takın ve iki sıra Luer kilit borusunu bağlayın.
- 3 mL deiyonize su içeren bir Luer kilit şırıngası bağlayın ve hazneyi yıkayın.
- Odayı damla damla bağlantı yoluyla 3 mL lipid tamponu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 100 mM NaCl) ile yıkayın.
NOT: Damla damla bağlantı, hazneye hava kabarcıkları enjekte edilmesini önlemek için tüm şırıngaları akış hücresine bağlar. - Lipid tamponunda 1 mL 0.04x biyotinile lipid lipid enjekte edin, atış başına 5 dakikalık inkübasyon ile iki atışta odaya enjekte edin.
NOT: 1x biyotinile lipid stoğunun hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34. - Hazneyi 3 mL lipid tamponu ile yıkayın ve lipid çift tabakasının slayt yüzeyinde olgunlaşması için 20 dakika inkübe edin.
- 1 mL BSA tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mMMgCl2 ve 0.2 mg/mL BSA) ekleyin ve slayt yüzeyini pasifleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
NOT: Bu adım, proteinlerin slayt yüzeyine spesifik olmayan bağlanmasını azaltabilir. - İki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile 1 mL BSA tamponuna 0.025 mg / mL streptavidin enjekte edin.
- Kalan streptavidini 3 mL BSA tamponu ile yıkayın.
- 1 mL BSA tamponunda ~ 300 pM (30 μL) biyotinile lambda faj DNA'sını iki atış ve atış başına 10 dakika inkübasyon ile odaya enjekte edin.
NOT: Biyotinile lambda DNA'sının hazırlanması daha önce yayınlanmış bir rapordaaçıklanmıştır 34.
2. Akış hücresinin mikroakışkan sisteme bağlanması ve mikroskoba yüklenmesi
- Abo1 görüntüleme tamponu hazırlayın (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2,% 1.6 glikoz ve 0.1x gloksi, Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Gloxy, floresan boyaların fotoağartmasını azaltan bir oksijen temizleme sistemidir. Glikoz oksidaz ve katalaz ile 100x gloksi stoğunun hazırlanması Referans35'te açıklanmıştır. - 10 mL görüntüleme tamponu içeren bir şırıngayı bir şırınga pompasına bağlayın ve mikroakışkan sistemdeki tüm boru hatlarındaki kabarcıkları çıkarın.
- Akış hücresine kabarcık enjeksiyonunu önlemek için hazırlanan akış hücresini damladan damlaya bağlantı yoluyla mikroakışkan sistemle birleştirin (Şekil 1B).
- Akış hücresini ve akış hücresi tutucularını birleştirin ve düzeneği özel yapım bir TIRF mikroskobuna monte edin (Şekil 1C).
DİKKAT: Akış hücresi mikroskop altına alındığında, objektif merceğin yüksekliğini dikkatlice ayarlayın. Akış hücresi objektif merceğe temas etmemelidir. Bu, lense zarar verebilir. - Akış hücresinin ortasına indeks eşleşen yağı damlatın ve yağ damlasının üzerine özel yapım bir güvercin prizması (Malzeme Tablosuna bakın) koyun.
3. DNA perdesi kullanılarak Abo1 tarafından histon montajı
- 150 μL görüntüleme tamponunda 5 nM Abo1 ve 12.5 nM Cy5 etiketli H3-H4 histon dimer (Cy5-H3-H4) (Malzeme Tablosuna bakınız) karıştırın. Tüm proteinler daha önce yayınlanmışrapor 17'ye göre hazırlanmıştır.
- Karışımı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
NOT: Cy5'in foto ağartılmasını önlemek için, inkübasyon karanlıkta yapılmalıdır. - Lambda DNA moleküllerini boyamak için 100 μL'lik bir numune döngüsünden görüntüleme tamponuna ~20 pM (2 μL) YOYO-1 boya enjekte edin.
- Görüntüleme yazılımını çalıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve DNA perdelerinin iyi biçimlendirilip biçimlendirilmediğini kontrol etmek için 488 nm lazeri açın.
NOT: DNA perdeleri iyi biçimlendirilmişse, YOYO-1 ile boyanan DNA molekülleri, akış varlığında bir bariyerde hizalanmış çizgiler olarak gösterilir. Gerilmiş hatlar geri teper ve akış kapatıldığında bariyerden uzaklaşır. - YOYO-1 boyasını DNA'dan çıkarmak için 2 mL yüksek tuz tamponu (200 mM NaCl ve 40 mM MgCl2) enjekte edin.
- YOYO-1 boyası çıkarıldıktan sonra, önceden inkübe edilmiş protein örneğini enjekte edin.
- Proteinler DNA perdesine ulaştığında, şırınga pompasını kapatın, kapatma vanasını kapatın ve Abo1 ile histon yüklemesi için 15 dakika inkübe edin.
- Bağlanmamış Abo1 ve histon proteinlerini 5 dakika boyunca yıkayın.
- Kapatma vanasını açın ve akış enjeksiyonuna devam edin.
- 637 nm lazeri açın ve tampon akışı açıkken floresan proteinleri görüntüleyin.
- Histon proteinlerinin DNA'ya yüklenip yüklenmediğini kontrol etmek için tampon akışını geçici olarak kapatın (Şekil 2C).
- Bir görüntü elde etme programı ile DNA perdesi görüntülerini toplayın (bkz.
NOT: Tampon akışı geçici olarak durduğunda, DNA toplam iç yansımanın geçici alanından geri çekilir ve DNA'ya bağlı floresan etiketli proteinler kaybolur.
4. Veri analizi
- Görüntü alma programı tarafından çekilen görüntüleri, görüntü dizileri olarak TIFF formatına dönüştürün.
NOT: Tüm veriler, Referans20'de açıklandığı gibi Resim J (NIH) kullanılarak analiz edilmiştir. - Görüntü dizilerinden tek bir DNA molekülü seçin ve bir kimografi çizin.
NOT: Kimografi, zamanın bir fonksiyonu olarak tek bir DNA molekülüne bağlı her histon proteininin floresan yoğunluğundaki değişimi gösterebilir. - Kimografiden floresan yoğunluk profilini oluşturun ve birden fazla Gauss işleviyle eşleştirin.
- Floresan yoğunluk profilinden tepe noktalarının merkez koordinatlarını toplayın. Bu adımda, minimum histon floresan yoğunluğu elde edilebilir.
- Profillerden toplanan tüm tepe yoğunluklarını minimum yoğunluğa bölün. Bu adımda DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısı tahmin edilir.
- Diğer DNA molekülleri için 4.2-4.5 adımlarını uygulayın.
- 1 kbp bölme boyutuna sahip H3-H4 dimerlerinin bağlanma dağılımı için bir histogram oluşturun. Analiz edilen molekül sayısı en az 300'dür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma, DNA perdesi testi için akış hücresi hazırlama prosedürünü açıklar (Şekil 1A). DNA perdesi testi, Abo1 ile DNA üzerinde histon H3-H4 dimer düzeneğinin incelenmesini kolaylaştırdı. İlk olarak, DNA molekülleri interkalasyon boyası olan YOYO-1 ile boyanarak DNA perdesi oluşumu kontrol edildi. Yeşil çizgiler paralel dizilerde gösterildi, bu da YOYO-1'in hidrodinamik akış altında bir difüzyon bariyerinde iyi hizalanmış ve gerilmiş DNA moleküllerine interkalasyon yaptığını gösteriyor (Şekil 2A). YOYO-1'in DNA ve histon proteinlerinin etkileşimini engelleme olasılığını dışlamak için, histon proteinleri eklenmeden önce YOYO-1 yüksek bir tuz tamponu ile DNA'dan çıkarıldı. Abo1'in yokluğunda DNA perdesine Cy5-H3-H4 dimerleri enjekte edildiğinde, Cy5-H3-H4 DNA'ya bağlanmadı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya kendiliğinden bağlanmadığını gösterir (Şekil 2B). Cy5-H3-H4'e Abo1 enjekte edildiğinde, DNA molekülleri üzerinde kırmızı floresan punkta görüldü, bu da Abo1'in DNA'ya H3-H4 dimerleri yüklediğini düşündürdü. Cy5-H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlanırken slayt yüzeyine bağlanmamasını sağlamak için tampon akışı geçici olarak kapatıldı. Akış kapatıldığında, DNA'ya bağlı floresan etiketli proteinler ortadan kayboldu, çünkü DNA molekülleri buharlaşan alandan geri çekildi. Buna karşılık, yüzeye adsorbe edilen proteinler aynı kaldı. Floresan sinyaller akış yokluğunda kayboldu ve akış devam ettirildiğinde yeniden ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlandığını düşündürdü. H3-H4 dimerlerinin DNA'ya bağlanması, akış kapatıldığında floresan sinyallerinin kaybolduğu kimografi ile de doğrulandı (Şekil 2D). Abo1 bir AAA+ ATPaz olduğundan, ATP hidrolizinin Abo1'in histon yükleme aktivitesi üzerindeki etkisi incelenmiştir16. DNA perdesinde nükleotid yokluğunda (Apo) veya ADP varlığında (Şekil 2E) az sayıda floresan punkta ortaya çıktı, bu da H3-H4 dimerlerinin Apo durumunda veya ADP varlığında nadiren DNA'ya bağlandığını gösteriyor. Şekil 2F, Şekil 2B,C ve Şekil 2E'nin kantitatif analizlerini gösterir ve ATP varlığında DNA'ya bağlı H3-H4 dimerlerinin sayısının arttığını gösterir. Sonuçlar, ATP hidrolizinin, Abo1 tarafından DNA'ya H3-H4 yüklemesi için gerekli olduğunu göstermektedir (Şekil 2E, F).
Daha sonra, nükleozomların Widom 601 dizisi için bir özgüllüğü olmamasına rağmen, in vivo 36,37,38,39,40. DNA perdesi, bir ucunda veya dahili olarak Widom 601 tekrarlarını içeren lambda DNA'sı ile oluşturulmuştur (Şekil 3A,B). Her bir DNA yapısı üzerindeki H3-H4 dimerlerinin bağlanma manzarası elde edildi (Şekil 3C,D). Cy5-H3-H4'ün bağlanma yeri, her bir floresan punktum17,41 için 2D Gauss uydurmasının merkez konumundan tahmin edildi. Abo1'in H3-H4 yükleme aktivitesi DNA dizisine bağlıysa, bağlanma dağılımı Widom 601 dizisine doğru çarpık olacaktır. Şekil 3C,D, sırasıyla sonunda (on tekrar) ve dahili olarak (beş tekrar) Widom 601 tekrarı içeren lambda DNA'sı üzerinde Abo1 ile H3-H4 dimerlerinin bağlanma dağılımı histogramlarını gösterir. Çoklu Widom 601 tekrarlarına tercihli bağlanma yoktu ve bağlanma dağılımı rastgeleydi, bu da Abo1'in Widom 601 dizisi için herhangi bir tercihi olmadığını, bunun yerine H3-H4'ü diziden bağımsız bir şekilde DNA'ya yüklediğini düşündürüyor (Şekil 3C, D).
Şekil 1: Akış hücresinin hazırlanması. (A) Akış hücresi düzeneği ve DNA perde sisteminin şemaları. Mikroakışkan oda, kaynaşmış bir silika lam ile çift taraflı bantla birbirine yapıştırılmış bir cam lamel arasında oluşturulabilir. Odadaki hidrodinamik akış altında, büyük miktarda lambda DNA molekülü, lipid çift tabakasının akışkanlığı nedeniyle bir difüzyon bariyerinde (burada bir nano hendek) hizalanır ve bir perde gibi gerilir. Difüzyon bariyerinin büyütülmüş görünümünde, nano hendek 1.5 μm aralık, 350 nm genişlik ve 1.4 μm derinliğe sahip testere dişi desenlerine sahiptir. (B) Bir şırınga pompası, bir kapatma vanası ve numune döngüsüne sahip 6 bir numune enjeksiyon valfinden oluşan mikroakışkan sistemin fotoğrafı. (C) Sürgü tutucu bileşenlerinin (solda), tutucuların ve akış hücresinin montajının (ortada) ve özel yapım bir TIRF mikroskobuna monte edilmiş tamamen monte edilmiş akış hücresinin (sağda) resimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tek moleküllü DNA perdesi kullanılarak Abo1 ile histon yüklemesinin görselleştirilmesi. (A) YOYO-1 (yeşil) ile boyanmış DNA moleküllerinin bir difüzyon bariyerinde iyi hizalandığı DNA perdesinin görüntüsü. (B) Abo1 içermeyen Cy5-H3-H4 (kırmızı) görüntüleri. (C) Tampon akışının varlığında (üstte) ve yokluğunda (altta) Abo1 tarafından yüklenen Cy5-H3-H4 (kırmızı) görüntüleri. (D) (C)'den tek bir DNA molekülünden ekstrakte edilen kimograf. Akış geçici olarak kapatıldığında, Cy5 floresan sinyalleri kaybolur, bu da Cy5-H3-H4'ün DNA'ya bağlandığını ancak slayt yüzeyine bağlanmadığını gösterir. (E) Abo1 tarafından yüklenen Cy5-H3-H4'ün nükleotid (Apo) olmadan görüntüsü (üstte). ADP varlığında Abo1 tarafından yüklenen Cy5-H3-H4'ün görüntüsü (altta). (F) Nükleotidlere göre Abo1 tarafından yüklenen Cy5-H3-H4'ün miktar tayini. Hata çubukları, standart sapmayı üç kopya olarak gösterir. Her deney 100-200 molekülün analizini içeriyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: H3-H4'ün Abo1 ile diziden bağımsız yüklenmesi. (A) Lambda DNA'sının bir ucu streptavidin yoluyla biyotinillenmiş lipide bağlanır ve diğer ucu Widom 601 dizisinin on tekrarını içerir (üstte). Diğer lambda DNA'sı, lambda DNA'sı içinde Widom 601 dizisinin beş tekrarını içerir (altta). (B) Widom 601 tekrarları içeren lambda DNA'sı ile DNA perdesi testinin şeması. (C,D) Cy5-H3-H4'ün Widom 601 tekrarlarını içeren lambda DNA'sı üzerindeki bağlanma dağılımı histogramları, sonunda (C) ve dahili olarak (D). H3-H4, Abo1 ile birleştirildiğinde DNA için dizi özgüllüğü yoktur. Hata çubukları,42'nin %70 güven aralığıyla önyüklenmesiyle elde edilir. Toplam olay sayısı (C) ve (D) için sırasıyla 312 ve 252'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olarak DNA perdesi, DNA metabolik reaksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır43. DNA perdesi, lipid akışkanlığını, mikroakışkanları ve TIRFM'yi birleştiren hibrit bir sistemdir. Diğer tek moleküllü tekniklerin aksine, DNA perdesi, protein-DNA etkileşimlerinin yüksek verimli gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, DNA perdesi tekniği, diziye özgü ilişki, DNA ile birlikte protein hareketi ve DNA 17,20,26 üzerindeki protein-protein çarpışması dahil olmak üzere moleküler etkileşimlerin arkasındaki mekanizmayı araştırmak için uygundur. Ek olarak, DNA perdesinin yüksek verimli yapısı, istatistiksel güvenilirliği sağlamak için yeterli verinin toplanmasını sağlar. DNA perdesi, kinetik parametreler, difüzyon katsayısı, hız ve işlenebilirlik dahil olmak üzere proteinlerin biyo-fizikokimyasal özelliklerinin araştırılmasını kolaylaştırır 17,26,27,30. Daha da önemlisi, DNA perdesi, nükleozomların30 içsel dizi tercihini gösteren nükleozom birikiminin bağlanma manzarasını belirlemek için kullanılabilir.
DNA perdesi tahlilinden yüksek kaliteli veriler elde etmek için birkaç noktanın dikkate alınması gerekir. İlk olarak, lipit çift tabakası slayt yüzeyinde uygun şekilde oluşturulmalıdır. Lipid çift tabakasının akışkanlığı, DNA moleküllerinin slayt üzerinde hareket etmesine ve hidrodinamik akış varlığında bir difüzyon bariyerinde hizalanmasına izin verir. Lipid çift tabakası ayrıca, proteinlerin yüzeye spesifik olmayan adsorpsiyonunu önlemek için mikroakışkan odanın yüzeyini pasifleştirir. Lipid çift tabakası tarafından pasivasyon tamamlanmadığından, floresan etiketli proteinler yüzeye spesifik olmayan bir şekilde adsorbe edilir ve bu da sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açar. Bununla birlikte, yüzeye yapışmış proteinler, geçici akışı açıp kapatarak DNA'ya bağlı olanlardan ayırt edilebilir, çünkü akış durduğunda DNA'ya bağlı proteinler kaybolur. İkincisi, floroforların foto-ağartılmasının bastırılması gerekir. Birçok tek moleküllü floresan görüntüleme yöntemi, foto ağartmayı azaltmak için bir oksijen süpürme sistemi kullanır. En popüler olanı gloksi olan birkaç oksijen süpürme sistemi geliştirilmiştir. Glikoz oksidaz ve katalazdan oluşan gloksi, çözeltideki moleküler oksijenleri enzimatik olarak azaltır ancak pH44,45,46'yı düşürür. Düşük pH, fizyolojik koşullarla uyumlu değildir ve lipid akışkanlığını azaltır. PH'daki düşüşü geciktirmek için, (1) görüntüleme tamponunun gazdan arındırılmış deiyonize su ile hazırlanması, (2) tamponun hemen kullanılması ve (3) tamponun kullanıma kadar buz üzerinde kapatılması ve saklanması gerekir.
Oyulmuş nano hendeklerin krom nano desenler yerine difüzyon bariyerleri olarak hizmet ettiği DNA perde sistemini geliştirmek için benzersiz bir platform geliştirildi25. Bu nano hendekler, güçlü çözücülerle zorlu temizlik koşulları altında daha sağlam olduklarından, tekrarlanabilir, daha net görüntülemeye izin verirler. Bununla birlikte, DNA perdesi tekniğinin bazı sınırlamaları vardır. Sürekli lazer aydınlatması altında, proteinleri etiketleyen floroforlar foto-ağartılır ve bu da uzun süreli ölçümleri zorlaştırır. DNA perdesi düşük pH'ta (~6'dan düşük) çalışmaz çünkü lipid çift tabakası akışkan değildir. Ek olarak, floresan arka plan ve proteinlerin slayt yüzeyine spesifik olmayan bağlanması, protein konsantrasyonu yüksek olduğunda tek moleküllü görüntülemeyi bozar. DNA perdesinin bir diğer dezavantajı, DNA perdesinin uzamsal çözünürlüğünün ~1 kbp/piksel olmasıdır, bu nedenle proteinlerin 1 kbp'den daha düşük hareketlerinin gözlemlenememesidir. Ek olarak, DNA perdesi, DNA üzerindeki proteinlere sürekli olarak hidrodinamik kuvvet uygular. Ancak akış kuvveti zayıftır (1 pN'den az) ve bu nedenle histonların veya nükleozomların perdedeki DNA boyunca hareket etmesi zordur. Ayrıca nükleozomların, kromatin yeniden şekillendiriciler olmadan DNA boyunca nadiren kaydığı bildirilmiştir47. Histonlar veya nükleozomlar DNA boyunca kayarsa, çoğu perdede DNA'nın uç bölgesinde kalacaktır. Ancak, önyargılı dağılımı görmedik. Öte yandan, histonlar veya nükleozomlar DNA ucundan akarsa, DNA'nın sonunda tükenirler. Bunu da gözlemlemedik.
Bu çalışma, DNA perdesi testinin kromatin dinamiklerini araştırmak için ideal olan tek moleküllü bir görüntüleme platformu olduğunu göstermektedir. DNA perdesi, bromodomain içeren AAA + ATPazlar gibi histon şaperonlarının kromatini bir araya getirme sürecini incelemek için uygulanabilir. Bromodomain içeren AAA + ATPazların biyolojik işlevi tartışmalıdır. İnsan ATAD2 veya S. cerevisiae Yta7 eksikliği, kromatin yoğunlaşması yoluyla gen ekspresyonunu aşağı regüle eder18. Buna karşılık, S. pombe Abo1 nükleozom yoğunluğunuarttırır 16. Tek moleküllü çalışmalar, Abo1'in DNA'ya histon H3-H4 yüklemesini katalize ettiğini göstermektedir. Abo1'in histon yükleme aktivitesinin ATP hidrolizine bağlı olduğu gösterilmiştir (Şekil 2C,E,F). Ayrıca, H3-H4 dimerlerinin bağlanma dağılımı, H3-H4 dimerlerinin diziden bağımsız bir şekilde Abo1 tarafından DNA'ya yüklendiğini göstermektedir (Şekil 3). Sonuç olarak, DNA perdesi, histon montajında bir histon şaperonu olarak Abo1'in biyolojik rolünü çözmek için kullanılabilir. DNA perdesi tekniği kullanılarak, Abo1 ve CAF-1 ve FACT gibi diğer histon şaperonları tarafından nükleozom oluşumu gelecekte incelenecektir.
Bu protokole dayanarak, DNA perdesi testi, nükleozomları yer değiştiren ve yeniden düzenleyen kompleksleri yeniden şekillendirerek kromatinin yeniden düzenlenmesini gözlemlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Güney Kore'deki KAIST'ten Profesör Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D. ve Juwon Jang, Ph.D.'nin Abo1 ve Cy5-H3-H4'e verdiği nazik desteği takdir ediyor. Bu çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı Hibesi (NRF-2020R1A2B5B01001792), Ulsan Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'nün okul içi araştırma fonu (1.210115.01) ve Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R022-D1) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
