Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.
Abstract
Microglia, as células imunes inatas residentes no cérebro, são os respondentes primários para inflamação ou lesão no sistema nervoso central (SNC). A microglia pode ser dividida em estado de repouso e estado ativado e pode mudar rapidamente o estado em resposta ao microambiente do cérebro. A microglia será ativada em diferentes condições patológicas e apresentará diferentes fenótipos. Além disso, existem muitos subgrupos diferentes de microglia ativada e grande heterogeneidade entre diferentes subgrupos. A heterogeneidade depende principalmente da especificidade molecular da microglia. Estudos revelaram que a microglia será ativada e desempenhará um papel importante no processo patológico da desmielinização inflamatória. Para entender melhor as características da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias, como esclerose múltipla e distúrbio do espectro neuromielite optica, propomos um protocolo de triagem microglial primária perilesional. Este protocolo utiliza a triagem celular ativada por colunaar (MACS) para obter microglia primária altamente purificada e preservar as características moleculares da microglia para investigar os efeitos potenciais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias.
Introduction
A microglia é originária de progenitores de gema-sac, que atingem o cérebro embrionário muito cedo e participam do desenvolvimento do CNS 1,2. Por exemplo, eles estão envolvidos na poda sináptica3 e na regulação do crescimento axonal4. Eles secretam fatores que promovem a sobrevivência neuronal e ajudam a localização neuronal5. Ao mesmo tempo, eles estão envolvidos na remoção de células anormais e células apoptóticas para garantir o desenvolvimento cerebral normal6. Além disso, como as células imuno-competentes do cérebro, microglia vigia continuamente o parnchyma cerebral para limpar células mortas, sinapses disfuncionais e detritos celulares7. Foi demonstrado que a ativação microglial desempenha um papel importante em uma variedade de doenças, incluindo doenças inflamatórias desmielinizantes, doenças neurodegenerativas e tumores cerebrais. Microglia ativada na esclerose múltipla (EM) contribuem para a diferenciação das células precursoras oligodendrocytos (OPCs) e a regeneração da mielina, engolindo detritos de mielina8.
Na doença de Alzheimer (DA), o acúmulo de beta amiloide (Aβ) ativa a microglia, que afeta as funções fagocíticas e inflamatórias da microglia9. A microglia ativada no tecido glioma, chamada microglia associada ao glioma (GAM), pode regular a progressão do glioma e, em última instância, afetar o prognóstico dos pacientes10. A ativação altera profundamente o transcriptome microglial, resultando em alterações morfológicas, expressão de receptores imunológicos, aumento da atividade fagocítica e secreção decitocinas aprimorada 11. Existem diferentes subconjuntos de microglia ativada em doenças neurodegenerativas, como microglia associada à doença (DAM), microglia de resposta ativada (ARM) e fenótipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.
Da mesma forma, múltiplos subconjuntos funcionais dinâmicos de microglia também coexistem no cérebro em doenças inflamatórias desmielinizantes12. Compreender a heterogeneidade entre diferentes subconjuntos de microglia é essencial para investigar a patogênese das doenças inflamatórias desmielinizantes e encontrar suas potenciais estratégias terapêuticas. A heterogeneidade da microglia depende principalmente da especificidade molecular8. É essencial descrever as alterações moleculares da microglia com precisão para o estudo da heterogeneidade. Os avanços na tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (RNA-seq) permitiram a identificação das características moleculares da microglia ativada em condições patológicas13. Portanto, a capacidade de isolar populações celulares é fundamental para uma investigação mais aprofundada dessas células-alvo em condições específicas.
Estudos realizados para entender as características e funções da microglia são geralmente estudos in vitro, uma vez que se descobriu que um grande número de microglia primária pode ser preparada e cultivada a partir de cérebros de filhotes de camundongos (1-3 dias de idade), que se ligam aos frascos de cultura e crescem na superfície plástica com outras células glias mistas. Posteriormente, a microglia pura pode ser isolada com base naadesividade diferente das células glias mistas14,15. No entanto, este método só pode isolar a microglia do cérebro perinatal e leva várias semanas. Variáveis potenciais na cultura celular podem influenciar características microgliais, como a expressão molecular16. Além disso, a microglia isolada por esses métodos só pode participar de experimentos in vitro simulando as condições das doenças do SNC e não pode representar as características e funções da microglia in vivo estados da doença. Portanto, é necessário desenvolver métodos para isolar microglia do cérebro de camundongo adulto.
A triagem celular ativada pela fluorescência (FACS) e a separação magnética são dois métodos amplamente utilizados, embora tenham suas próprias limitações diferentes 16,17,18,19. Suas respectivas vantagens e desvantagens serão contrastadas na seção de discussão. O amadurecimento da tecnologia MACS oferece a possibilidade de purificar rapidamente as células. Huang et al. desenvolveram um método conveniente para rotular lesões desmielinizando no cérebro20. Combinando essas duas abordagens técnicas, propomos um protocolo de separação magnética CD11b rápido e eficiente, fornecendo uma descrição passo a passo para isolar a microglia em torno de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos adultos e preservar as características moleculares da microglia. As lesões desmielinizadores focais foram causadas pela injeção estereotática de 2 μL de solução de lisolecithin (1% LPC em 0,9% NaCl) no calosum do corpus 3 dias antes de iniciar o protocolo21. Este protocolo estabelece as bases para realizar o próximo passo em experimentos in vitro. Além disso, este protocolo economiza tempo e permanece viável para uso generalizado em vários experimentos.
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Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais do Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China.
1. Materiais
- Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo.
- Prepare o tampão de carga adicionando soro bovino fetal (FBS, 2%) à solução salina tamponada de fosfato (PBS).
- Adicione corante vermelho neutro (NR) (1%) final ao PBS.
- Prepare as seguintes soluções utilizando o Kit de Dissociação cerebral Adulta disponível comercialmente (veja a Tabela de Materiais).
- Para preparar a mistura de enzimas 1, pipeta 1,9 mL de Buffer Z e 50 μL de Enzima P em um tubo centrífuga de 15 mL.
- Para preparar a mistura de enzimas 2, pipeta 20 μL de Buffer Y e 10 μL de Enzima A em um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL.
- Prepare a solução de remoção de detritos.
2. Perfusão e dissecção de camundongos
- Intraperitoneal (i.p.) injete o mouse com 500 μL de corante de 1% NR em PBS 2-3 h antes da anestesia.
NOTA: A injeção intraperitoneal de NR em modelos desmielinizadores de camundongos ajuda a discernir as lesões (Figura 1). - Anestesiar o mouse com pentobarbital (50 mg/kg, i.p.), e garantir que o mouse seja anestesiado com sucesso examinando as respostas à dor.
- Abra a cavidade torácica do rato e exponha o coração.
- Corte um pequeno canto do átrio direito cuidadosamente e intracardialmente perprendo o mouse com 20-30 mL de PBS frio do ventrículo esquerdo.
- Decapitar o rato sob anestesia.
- Abra o crânio do rato e liberte cuidadosamente o cérebro do crânio.
- Transfira o cérebro para o cérebro do rato cortar o molde e cortar o cérebro em fatias de 0,1 cm.
- Remova as fatias cerebrais e coloque-as em PBS frio em uma placa de Petri (60/15 mm). Microdissto as lesões rotuladas por corante NR ao redor do caloso corpus sob um estereoscópio usando fórceps microcirúrgicos.
NOTA: Certifique-se de que o tecido dissecado esteja o mais completo possível para facilitar a transferência subsequente; o progresso total da dissecção deve ser concluído em 2 h. - Transfira o tecido dissecado para tubos de centrífugas de 15 mL contendo a quantidade apropriada de tampão de carga a frio.
NOTA: Misture o tecido de caloso corpus de 2-3 ratos juntos em um tubo como uma amostra.
3. Dissociação tecidual
- Centrifugar o tecido dissecado a 300 ×g por 30 s (depois de atingir essa velocidade) para coletar a amostra na parte inferior do tubo.
- Mistura de enzima pré-aqueça 1 e misture enzimas de 2 a 37 °C em uma incubadora.
- Adicione 1.950 μL de enzima pré-aque mistura 1 a uma amostra e digerir em uma incubadora a 37 °C por 5 min.
- Adicione 30 μL de mistura de enzimas pré-aque 2 e misture delicadamente.
- Digerir em uma incubadora a 37 °C por 15 min e misturar suavemente a cada 5 minutos.
- Adicione 4 mL de PBS frio ao tubo após a digestão e agite suavemente.
- Coloque filtros de 70 μm em tubos de centrífugas de 50 mL e prewet os filtros com 500 μL de PBS frio. Filtre o tecido dissociado passando as amostras de tecido digerido através dos filtros e transfira a suspensão filtrada no tubo centrífuga de 50 mL para um tubo de centrífuga de 15 mL.
NOTA: Pule esta etapa se a quantidade de tecido for muito pequena. - Centrifugar as amostras de tecido filtrado a 300 ×g por 10 min a 4 °C e aspirar o sobrenante lentamente e completamente.
NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo, exceto pela digestão enzimática.
4. Remoção de detritos
- Resuspenque a pelota de célula suavemente com 1.550 μL de PBS frio.
- Adicione 450 μL de solução fria para remoção de detritos e misture bem.
- Sobreponha a mistura acima muito lentamente e suavemente com 2 x 1 mL de PBS frio usando uma pipeta de 1.000 μL.
NOTA: Incline o tubo de centrífuga por 45 ° e adicione lentamente PBS ao longo da parede do tubo com a pipeta. - Transfira o tubo lentamente e suavemente para uma centrífuga e gire a 4 °C e 3.000 × g por 10 min.
- Procure por três camadas após a centrifugação. Aspire as duas camadas superiores completamente usando uma pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
- Encha o tubo até 5 mL com tampão de carregamento a frio e inverta suavemente o tubo três vezes.
- Centrifugar a 4 °C e 1.000 × g por 10 min. Aspire completamente o supernatante e evite interromper a pelota celular.
5. Separação magnética de células microgliais
- Resuspenja a pelota celular com 90 μL de tampão de carga e adicione 10 μL de contas CD11b (Microglia).
- Misture bem e incubar por 15 min a 4 °C.
- Adicione 1 mL de tampão de carga e pipeta o líquido suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 μL para lavar as células após a incubação. Centrifugar as células a 4 °C e 300 × g por 10 minutos e aspirar o supernatante completamente para remover as contas desvinculadas.
- Resuspende as células em 500 μL de tampão de carga.
- Coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético.
- Enxágüe a coluna com 500 μL de tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante.
- Aplique a suspensão da célula na coluna MS e descarte o fluxo através de células não rotuladas.
- Adicione 500 μL de tampão de carga à coluna três vezes para lavar as células que aderem à parede da coluna e descartar o fluxo através do fluxo.
NOTA: Adicione apenas um novo tampão de carregamento para lavagem quando o reservatório da coluna estiver completamente vazio. - Retire a coluna do separador após lavar a coluna e coloque-a em um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Adicione 1 mL de tampão de carga na coluna e empurre o êmbolo para a parte inferior da coluna para liberar as células rotuladas magneticamente. Repita esta etapa três vezes para coletar completamente as células magneticamente rotuladas.
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Representative Results
Microglia isolada usando contas CD11b têm alta pureza
As células microgliais ao redor das lesões em modelos de camundongos desmielinização foram isoladas usando o protocolo acima mencionado e testadas por citometria de fluxo. As células são rotuladas fluorescentemente com isothiocyanato cd11b-fluoresceína (FITC) e CD45-alophycocyanin (APC) para determinar microglia na citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante. Existem várias literaturas demonstrando que os anticorpos CD11b e CD45 são suficientes para verificar a pureza da microglia isolada19,22. A compensação da fluorescência foi concluída no citômetro de fluxo utilizando amostras de controle não manchadas e de uma única mancha. As células foram fechadas por altura de dispersão dianteira (FSC-H) e altura de dispersão lateral (SSC-H); células únicas foram fechadas por área de dispersão dianteira (FSC-A) e FSC-H. As proporções de microglia (identificada como CD11b+CD45Intermediária) antes e depois da separação magnética foram testadas por citometria de fluxo. A técnica de back-loop foi utilizada para ajustar a estratégia de gating da análise de citometria de fluxo, determinando o portão para a microglia. Comparado com aproximadamente 3 × 104 células e 6 × 103 microglia antes da separação magnética de cada cérebro de camundongo (Figura 3A), o MACS geralmente produz aproximadamente 2,5 × 103 células e 2 × 103 microglia por cérebro de camundongo (Figura 3B), que era aproximadamente 85% de todas as células únicas. No entanto, quase 3% das células mielóides (identificadas como CD11b+CD45de alta) estavam presentes nas células separadas pelo MACS e eram difíceis de remover da população cd11b neste protocolo. A pureza da microglia isolada pode ser aumentada para 95% usando duas colunas magnéticas (Figura Suplementar S1). A triagem macs poderia capturar aproximadamente 33% da microglia na amostra da mistura cerebral.
Microglia isolada usando contas CD11b têm alta viabilidade celular
Fluorocromo 7-aminoactinomicina D (7-AAD) é frequentemente usado para mostrar a viabilidade celular na citometria de fluxo. As células 7-AAD+ representam células mortas19. A viabilidade da microglia separada pelo MACS foi de aproximadamente 95% por coloração celular com 7-AAD (Figura 4).
Análise morfológica de microglia em torno de lesões desmielinizando classificadas pelo MACS
A análise morfológica mostrou que a microglia não foi ativada pelo MACS. Microglia exibe um típico corpo celular bipolar longitudinal após o MACS, que é semelhante à morfologia microglial após FACS19. A microglia em torno das lesões desmielinizadas será ativada no modelo de desmielinização induzida pelo LPC21. A microglia manchada pela molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada 1 (Iba-1) mostrou morfologia amebica típica de microglia ativada neste protocolo. P2ry12 é uma molécula típica de estado de repouso microglial. Há uma pequena fração de microglia ramificada e P2ry12+ antes do MACS devido à expansão da extensão das lesões dissociadas. No entanto, a existência de microglia P2ry12+ após MACS também indica que o MACS não ativará a microglia (Figura Suplementar S2).
Figura 1: Imagens das lesões desmielinizações focais rotuladas pelo corante vermelho neutro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens das três camadas formadas por centrifugação. As duas camadas superiores (camada 1 + camada 2) precisam ser removidas no processo de remoção de detritos (ver protocolo passo 4.5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise da citometria de fluxo de microglia isolada de lesões de desmielinização de camundongos adultos antes e depois do MACS. (A) Representação esquemática da estratégia de gating utilizada na análise de citometria de fluxo antes de MACS: FSC-H e SSC-H para selecionar células, FSC-A e FSC-H para a seleção de células únicas, e CD11b-FITC e CD45-APC para selecionar células mielóides (para cima) e microglia (para baixo). (B) Representação esquemática da estratégia de gating utilizada na amostra de análise de citometria de fluxo após MACS. A proporção de microglia aumentou significativamente após MACS: FSC-H e SSC-H para selecionar células, FSC-A e FSC-H para a seleção de células únicas, e CD11b-FITC e CD45-APC para selecionar células mielóides (para cima) e microglia (para baixo). Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersão lateral; FSC-H = altura de dispersão para a frente; FSC-A = área de dispersão para a frente; CD45-APC = CD45 rotulado de aofilia; CD11b-FITC = fluoresceína isothiocianato rotulado CD11b; MACS = classificação celular ativada por magnético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estratégia de gating FACS para células individuais vivas/mortas após MACS. 7-AAD e SSC-H para selecionar células vivas após MACS. Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersão lateral; 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; MACS = classificação celular ativada por magnético; FACS = classificação celular ativada por fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Análise de citometria de fluxo de microglia isolada de camundongos desmielinização adulta. (A) Representação esquemática da estratégia de gating utilizada na amostra de análise de citometria de fluxo antes do MACS. (B) Representação esquemática da estratégia de gating utilizada na amostra de análise de citometria de fluxo após MACS utilizando duas colunas magnéticas. (C) Histograma de parâmetro único de CD11b-FITC e CD45-APC em citometria de fluxo após MACS usando duas colunas magnéticas. Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersão lateral; FSC-H = altura de dispersão para a frente; FSC-A = área de dispersão para a frente; CD45-APC = CD45 rotulado de aofilia; CD11b-FITC = fluoresceína isothiocianato rotulado CD11b; MACS = classificação celular ativada por magnético; CD45Int = expressão CD45 intermediária. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar S2: Mancha de imunofluorescência de microglia com Iba-1 e P2ry12 antes e depois do MACS. (A) Imagens de microglia antes do MACS. (B) Imagens de microglia isolada após MACS. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: MACS = classificação celular ativada por magnético; Iba-1 = molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O protocolo propõe um método para isolar a microglia em torno das lesões desmielinizantes, que podem ajudar a estudar as características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes inflamatórias. Microglia capturadas usando contas CD11b exibem alta pureza e viabilidade. As etapas críticas do protocolo incluem a localização precisa de focos e a purificação microglial ideal. No protocolo passo 2.1, é necessário injetar a solução NR 2 h antes de sacrificar o mouse para garantir que as lesões possam ser exibidas com precisão20. Na etapa 2.8 do protocolo, foi tomado cuidado para colocar seções de tecido cerebral em uma caixa de gelo para dissecção e completar esta etapa o mais rápido possível, melhorando assim a viabilidade celular. Na etapa 2.9, é necessário selecionar tecido apropriado como uma amostra tanto para digestão enzimádea quanto para remoção de detritos. A etapa 3.7 não pode ser ignorada quando o efeito da remoção de detritos não é satisfatório. Na etapa 4.3, a adição de PBS deve ser suave para formar diferentes camadas, garantindo que o máximo de detritos seja removido possível. Todas as etapas do protocolo, exceto a digestão enzimática, devem ser realizadas no gelo para garantir a viabilidade celular e reduzir a resposta transcricional da microglia. Cada passo no protocolo é leve e retém alta viabilidade, por isso é desnecessário usar a solução de remoção de células mortas22,23.
O método de dissociação enzimática para cérebro de camundongo no protocolo provou ser adequado para RNA-seq23 unicelular. Embora as enzimas no protocolo sejam leves, Marsh et al. descobriram que vários protocolos de hidrólise enzimática a 37 °C podem alterar significativamente o transcriptome da microglia24. Estabelecer um controle saudável no experimento para comparação pode ajudar a identificar os genes expressos diferencialmente da desmielinização, eliminando assim a resposta transcricional anormal no protocolo. Enquanto isso, para prevenir este estado transcricional anormal após a digestão enzimática, o protocolo pode ser otimizado adicionando vários inibidores de transcrição e tradução, como actinomicina D, triptolida e anisomicina em diferentes etapas. O uso desses inibidores pode revelar a expressão genética real da microglia in vivo sem a configuração de um controle. Portanto, a adição desses inibidores ao protocolo pode reduzir o número de animais ou espécimes necessários no experimento e é mais econômico para análise a jusante. No entanto, deve-se notar que alguns genes de microglia serão modulados por esses inibidores, o que pode limitar a utilização desses inibidores para o trabalho futuro24. O uso do instrumento dissociador especializado após a adição da mistura enzimática 1 e da enzima mix 2 para dissociação tecidual também pode limitar as respostas transcricionais na etapa 323 do protocolo.
Este protocolo tem algumas limitações. A pureza da microglia é de apenas aproximadamente 85% no protocolo, que não compreende mais de 90% de todas as células únicas semelhantes a outras literaturas19,22. A substituição da coluna LS pela coluna MS, a ausência dos filtros e a qualidade das microesferas podem ser as causas potenciais. Se a pureza da microglia isolada não atender aos requisitos, prolongar o tempo de incubação magnética ou passar as células classificadas através de uma segunda coluna magnética melhorará a pureza (Figura Suplementar S1). Se o número de células for baixo, o tecido deve ser colhido de mais camundongos e perda celular devido à aspiração descuidada evitada. Se a viabilidade da célula estiver baixa, substituir o PBS no buffer de carregamento por meio RPMI 1640 poderia melhorar significativamente a viabilidade da célula. Também é benéfico para a viabilidade celular garantir que todas as soluções utilizadas no protocolo sejam frescas, e o protocolo seja concluído o mais rápido possível. É importante que os usuários equilibrem a pureza e o número de microglias obtidas usando este protocolo.
O protocolo utiliza a ligação de microglia com contas CD11b e o enriquecimento em um campo magnético para purificar a microglia. Portanto, microglia purificada contém a contaminação de células mielóides, o que é inevitável neste protocolo. Em contraste com o FACS - o padrão-ouro para a classificação de células - a pureza da microglia isolada pelo MACS não é suficientemente alta para algumas aplicações elaboradas, como sequenciamento profundo, o que limita seu uso generalizado. Além disso, o FACS para triagem de microglia pode eliminar a contaminação de células mielóides. No entanto, o MACS é um método mais suave, retém características morfológicas mais originais de células gliais especialmente astrócitos, leva menos tempo para isolar a microglia, e tem um rendimento celular maior do que o FACS, sugerindo que ele pode reduzir o número de camundongos a serem sacrificados e pode ser mais adequado para experimentos sensíveis ao tempo19,25 . Enquanto isso, o MACS é mais econômico e amplamente disponível e tem requisitos técnicos mais baixos para experimentadores. O MACS tem sido provado o método mais confiável e consistente para isolar a microglia. A análise morfológica mostrou que a microglia não seria ativada pelo MACS, e o RNA-seq demonstrou que a microglia isolada por este método mantém um estado de repouso19,26.
No geral, o protocolo é importante para o levantamento de microglia em doenças desmielinizantes, e a microglia isolada por este protocolo pode ser utilizada para diversas aplicações a jusante, como RT-PCR quantitativo e RNA-seq. O protocolo utiliza corante vermelho neutro para localizar lesões desmielinizando, o que garante a precisão dos locais da lesão e reduz qualquer confusão com tecido normal durante a amostragem. A localização precisa das lesões pode ajudar a focar nos efeitos das doenças e estudar o fenótipo molecular único e características funcionais da microglia em doenças desmielinizantes. Isso fornecerá uma base para o estudo do mecanismo da microglia em doenças desmielinizantes. Este método de isolar a microglia usando contas de CD11b magnéticos pode purificar microglia com alta viabilidade celular e rendimento em pouco tempo, com requisitos mínimos para condições experimentais, o que permite o uso generalizado para estudar microglia em diferentes condições.
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Disclosures
Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pela Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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