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Neuroscience

डेमाइलिनेशन के पशु मॉडल में चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा माउस प्राथमिक माइक्रोग्लिया का अलगाव

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63511
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Summary

यहां, हम कॉलमर चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग का उपयोग करते हुए, डिमाइलिनेटिंग बीमारियों के पशु मॉडल में प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

माइक्रोग्लिया, मस्तिष्क में निवासी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सूजन या चोट के लिए प्राथमिक उत्तरदाता हैं। माइक्रोग्लिया को आराम की स्थिति और सक्रिय स्थिति में विभाजित किया जा सकता है और मस्तिष्क के माइक्रोएन्वायरमेंट के जवाब में तेजी से स्थिति बदल सकता है। माइक्रोग्लिया को विभिन्न पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत सक्रिय किया जाएगा और विभिन्न फेनोटाइप प्रदर्शित किए जाएंगे। इसके अलावा, सक्रिय माइक्रोग्लिया के कई अलग-अलग उपसमूह और विभिन्न उपसमूहों के बीच महान विषमता हैं। विषमता मुख्य रूप से माइक्रोग्लिया की आणविक विशिष्टता पर निर्भर करती है। अध्ययनों से पता चला है कि माइक्रोग्लिया सक्रिय हो जाएगा और भड़काऊ डिमाइलिनेशन की रोग प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाएगा। मल्टीपल स्केलेरोसिस और न्यूरोमाइलाइटिस ऑप्टिका स्पेक्ट्रम डिसऑर्डर जैसे भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया की विशेषताओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हम एक पेरिलेशनल प्राथमिक माइक्रोग्लियल सॉर्टिंग प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। यह प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध प्राथमिक माइक्रोग्लिया प्राप्त करने और भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया के संभावित प्रभावों की जांच करने के लिए माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए कॉलमर चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) का उपयोग करता है।

Introduction

माइक्रोग्लिया जर्दी-थैली पूर्वजों से उत्पन्न होता है, जो भ्रूण मस्तिष्क तक बहुत जल्दी पहुंचजाता है और सीएनएस 1,2 के विकास में भाग लेता है। उदाहरण के लिए, वे सिनैप्टिक प्रूनिंग3 में शामिल हैं और अक्षीय विकास4 को विनियमित करते हैं। वे उन कारकों को स्रावित करते हैं जो न्यूरोनल अस्तित्व को बढ़ावा देते हैं और न्यूरोनल स्थानीयकरण 5 में मदद करतेहैं। इसी समय, वे सामान्य मस्तिष्क विकास6 सुनिश्चित करने के लिए असामान्य कोशिकाओं और एपोप्टोटिक कोशिकाओं को हटाने में शामिल हैं। इसके अलावा, मस्तिष्क की प्रतिरक्षा-सक्षम कोशिकाओं के रूप में, माइक्रोग्लिया लगातार मृत कोशिकाओं, बेकार सिनैप्स और सेलुलर मलबे7 को साफ करने के लिए मस्तिष्क पैरेन्काइमा की निगरानी करता है। यह प्रदर्शित किया गया है कि माइक्रोग्लियल सक्रियण विभिन्न प्रकार की बीमारियों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग रोग, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग और मस्तिष्क ट्यूमर शामिल हैं। मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) में सक्रिय माइक्रोग्लिया ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) के भेदभाव और माइलिन मलबे को घेरकर माइलिन के उत्थान में योगदान देताहै।

अल्जाइमर रोग (एडी) में, अमाइलॉइड बीटा (ए) का संचय माइक्रोग्लिया को सक्रिय करता है, जो माइक्रोग्लिया9 के फागोसाइटिक और भड़काऊ कार्यों को प्रभावित करता है। ग्लियोमा ऊतक में सक्रिय माइक्रोग्लिया, जिसे ग्लियोमा-संबद्ध माइक्रोग्लिया (जीएएम) कहा जाता है, ग्लियोमा की प्रगति को विनियमित कर सकता है और अंततः रोगियों के पूर्वानुमान को प्रभावित कर सकताहै 10. सक्रियण गहराई से माइक्रोग्लियल ट्रांसक्रिप्टोम को बदल देता है, जिसके परिणामस्वरूप रूपात्मक परिवर्तन, प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति, फागोसाइटिक गतिविधि में वृद्धि, और बढ़ी हुई साइटोकाइन स्राव11। न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों जैसे रोग से जुड़े माइक्रोग्लिया (डीएएम), सक्रिय प्रतिक्रिया माइक्रोग्लिया (एआरएम), और माइक्रोग्लियल न्यूरोडीजेनेरेटिव फेनोटाइप (एमजीएनडी) 8 में सक्रिय माइक्रोग्लिया के विभिन्न सबसेट हैं।

इसी तरह, माइक्रोग्लिया के कई गतिशील कार्यात्मक सबसेट भी सूजन डिमाइलिनेटिंग रोगों12 में मस्तिष्क में सह-अस्तित्व में हैं। माइक्रोग्लिया के विभिन्न सबसेट के बीच विषमता को समझना भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों के रोगजनन की जांच करने और उनकी संभावित चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए आवश्यक है। माइक्रोग्लिया की विषमता मुख्य रूप से आणविक विशिष्टता8 पर निर्भर करती है। विषमता के अध्ययन के लिए माइक्रोग्लिया के आणविक परिवर्तनों का सटीक वर्णन करना आवश्यक है। एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) प्रौद्योगिकी में प्रगति ने पैथोलॉजिकल स्थितियों13 में सक्रिय माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं की पहचान को सक्षम किया है। इसलिए, विशिष्ट परिस्थितियों में इन लक्ष्य कोशिकाओं की आगे की जांच के लिए सेल आबादी को अलग करने की क्षमता महत्वपूर्ण है।

माइक्रोग्लिया की विशेषताओं और कार्यों को समझने के लिए किए गए अध्ययन आमतौर पर इन विट्रो अध्ययनों में होते हैं, क्योंकि यह पाया गया है कि माउस पिल्ला दिमाग (1-3 दिन पुराना) से बड़ी संख्या में प्राथमिक माइक्रोग्लिया तैयार और सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो संस्कृति फ्लास्क से जुड़ते हैं और अन्य मिश्रित ग्लियाल कोशिकाओं के साथ प्लास्टिक की सतह पर बढ़ते हैं। इसके बाद, शुद्ध माइक्रोग्लिया को मिश्रित ग्लियल कोशिकाओं14,15 के विभिन्न चिपकने के आधार पर अलग किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि केवल प्रसवकालीन मस्तिष्क से माइक्रोग्लिया को अलग कर सकती है और इसमें कई सप्ताह लगते हैं। सेल संस्कृति में संभावित चर सूक्ष्मग्लियल विशेषताओं जैसे आणविक अभिव्यक्ति16 को प्रभावित कर सकते हैं। इसके अलावा, इन विधियों द्वारा अलग माइक्रोग्लिया केवल सीएनएस रोगों की स्थितियों का अनुकरण करके इन विट्रो प्रयोगों में भाग ले सकता है और विवो रोग राज्यों में माइक्रोग्लिया की विशेषताओं और कार्यों का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इसलिए, वयस्क माउस मस्तिष्क से माइक्रोग्लिया को अलग करने के तरीकों को विकसित करना आवश्यक है।

प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय पृथक्करण दो व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं, हालांकि उनकी अपनी अलग-अलग सीमाएं 16,17,18,19 हैं। उनके संबंधित फायदे और नुकसान चर्चा अनुभाग में विपरीत होंगे। एमएसीएस प्रौद्योगिकी की परिपक्वता कोशिकाओं को तेजी से शुद्ध करने की संभावना प्रदान करती है। हुआंग एट अल ने मस्तिष्क20 में डिमाइलिनेटिंग घावों को लेबल करने के लिए एक सुविधाजनक विधि विकसित की है। इन दो तकनीकी दृष्टिकोणों को मिलाकर, हम एक तेजी से और कुशल कॉलमर सीडी 11 बी चुंबकीय पृथक्करण प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, जो वयस्क माउस दिमाग में घावों को कम करने और माइक्रोग्लिया की आणविक विशेषताओं को संरक्षित करने के आसपास माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण विवरण प्रदान करता है। फोकल डिमाइलिनेटिंग घावों को प्रोटोकॉल 21 शुरू करने से 3 दिन पहले कॉर्पस कॉलोसम में लाइसोलेसिथिन समाधान (0.9% एनएसीएल में 1% एलपीसी) के2 μL के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के कारण हुआ था। यह प्रोटोकॉल इन विट्रो प्रयोगों में अगला कदम उठाने की नींव रखता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल समय बचाता है और विभिन्न प्रयोगों में व्यापक उपयोग के लिए संभव बना हुआ है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को टोंगजी मेडिकल कॉलेज, हुआझोंग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, चीन के इंस्टीट्यूट ऑफ एनिमल केयर कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. सामग्री

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
    1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, 2%) जोड़कर लोडिंग बफर तैयार करें।
    2. पीबीएस में तटस्थ लाल (एनआर) डाई (अंतिम 1%) जोड़ें।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वयस्क मस्तिष्क पृथक्करण किट का उपयोग करके निम्नलिखित समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. एंजाइम मिश्रण 1 तैयार करने के लिए, बफर जेड के विंदुक 1.9 एमएल और एंजाइम पी के 50 μL को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में तैयार करें।
    2. एंजाइम मिश्रण 2 तैयार करने के लिए, बफर वाई के 20 μL और एंजाइम ए के 10 μL को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें।
    3. मलबे को हटाने का समाधान तैयार करें।

2. चूहों छिड़काव और विच्छेदन

  1. इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) संज्ञाहरण से पहले पीबीएस 2-3 घंटे में 1% एनआर डाई के 500 μL के साथ माउस को इंजेक्ट करें।
    नोट: माउस मॉडल को डिमाइलिनेट करने में एनआर के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन घावों (चित्रा 1) को समझने में मदद करता है।
  2. किलोग्राम, यानी) के साथ माउस को एनेस्थेटाइज़ करें, और यह सुनिश्चित करें कि दर्द प्रतिक्रियाओं की जांच करके माउस को सफलतापूर्वक एनेस्थेटाइज किया गया है।
  3. माउस के वक्ष गुहा खोलें और दिल को बेनकाब करें।
  4. दाएं आलिंद के एक छोटे से कोने को ध्यान से काटें और इंट्राकार्डियल रूप से बाएं वेंट्रिकल से 20-30 एमएल ठंडे पीबीएस के साथ माउस को संक्रमित करें।
  5. संज्ञाहरण के तहत माउस decapitate.
  6. माउस की खोपड़ी खोलें और ध्यान से खोपड़ी से मस्तिष्क मुक्त।
  7. माउस मस्तिष्क टुकड़ा मोल्ड करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण और 0.1 सेमी स्लाइस में मस्तिष्क में कटौती।
  8. मस्तिष्क स्लाइस निकालें और उन्हें पेट्री डिश (60/15 मिमी) में ठंडे पीबीएस में रखें। माइक्रोसर्जिकल संदंश का उपयोग करके स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत कॉर्पस कॉलोसम के चारों ओर एनआर डाई द्वारा लेबल किए गए घावों को माइक्रोविच्छेदित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि विच्छेदित ऊतक बाद के हस्तांतरण को सुविधाजनक बनाने के लिए जितना संभव हो उतना पूरा है; कुल विच्छेदन प्रगति 2 घंटे में पूरा किया जाना चाहिए।
  9. ठंड लोड हो रहा बफर की उचित मात्रा युक्त 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए विच्छेदित ऊतक स्थानांतरण।
    नोट: एक नमूने के रूप में एक ट्यूब में एक साथ 2-3 चूहों से कॉर्पस कॉलोसम ऊतक पूल।

3. ऊतक पृथक्करण

  1. ट्यूब के तल पर नमूना इकट्ठा करने के लिए 300 ×जी 30 एस (इस गति तक पहुंचने के बाद) पर विच्छेदित ऊतक अपकेंद्रित्र।
  2. प्रीहीट एंजाइम मिश्रण 1 और एंजाइम मिश्रण 2 से 37 डिग्री सेल्सियस एक इनक्यूबेटर में।
  3. एक नमूना करने के लिए प्रीहीटेड एंजाइम मिश्रण 1 के 1,950 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में पचाएं।
  4. प्रीहीटेड एंजाइम मिश्रण 2 के 30 μL जोड़ें और धीरे से मिलाएं।
  5. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में डाइजेस्ट करें और धीरे-धीरे हर 5 मिनट मिलाएं।
  6. पाचन के बाद ट्यूब में 4 एमएल ठंडे पीबीएस जोड़ें और धीरे-धीरे हिलाएं।
  7. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों पर 70 μm फिल्टर रखें और ठंडे पीबीएस के 500 μL के साथ फिल्टर prewet. फिल्टर के माध्यम से पचा ऊतक के नमूनों को पारित करके अलग-अलग ऊतक को फ़िल्टर करें, और 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फ़िल्टर किए गए निलंबन को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: ऊतक की मात्रा बहुत छोटी है, तो इस कदम को छोड़ दें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 × जी पर फ़िल्टर किए गए ऊतक के नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और धीरे-धीरे और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें।
    नोट: एंजाइमेटिक पाचन को छोड़कर सभी चरणों को बर्फ पर किया जाना चाहिए।

4. मलबे को हटाने

  1. ठंडे पीबीएस के 1,550 μL के साथ धीरे-धीरे सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. मलबे को हटाने के लिए ठंडे समाधान के 450 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. 1,000 μL विंदुक का उपयोग करके ठंडे पीबीएस के 2 x 1 एमएल के साथ उपरोक्त मिश्रण को बहुत धीरे-धीरे और धीरे-धीरे ओवरले करें।
    नोट: 45 डिग्री से अपकेंद्रित्र ट्यूब झुकाव और धीरे धीरे विंदुक के साथ ट्यूब की दीवार के साथ पीबीएस जोड़ें।
  4. ट्यूब को धीरे-धीरे और धीरे-धीरे एक अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 3,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद तीन परतों की तलाश करें। एक 1,000 μL विंदुक (चित्रा 2) का उपयोग करके पूरी तरह से दो शीर्ष परतों को aspirate।
  6. ठंड लोड िंग बफर के साथ 5 एमएल तक ट्यूब भरें और धीरे-धीरे ट्यूब को तीन बार उलटा करें।
  7. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 1,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पूरी तरह से aspirate और सेल गोली को बाधित करने से बचने के लिए।

5. माइक्रोग्लियल कोशिकाओं का चुंबकीय पृथक्करण

  1. लोडिंग बफर के 90 μL के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें और सीडी 11 बी (माइक्रोग्लिया) मोतियों के 10 μL जोड़ें।
  2. अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. लोडिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं को धोने के लिए 1,000 μL विंदुक के साथ तरल को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 300 × ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र और अनबाउंड मोतियों को हटाने के लिए पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट।
  4. लोडिंग बफर के 500 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. चुंबकीय क्षेत्र में सकारात्मक चयन के लिए एमएस कॉलम को इसके विभाजक के साथ रखें।
  6. कोशिकाओं की रक्षा करने और निर्माता के प्रोटोकॉल के आधार पर चुंबकीय छँटाई की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए लोडिंग बफर के 500 μL के साथ कॉलम कुल्ला।
  7. एमएस कॉलम पर सेल निलंबन लागू करें और बिना लेबल वाली कोशिकाओं वाले फ्लोथ्रू को त्याग दें।
  8. कॉलम की दीवार का पालन करने वाली कोशिकाओं को धोने और फ्लोथ्रू को त्यागने के लिए कॉलम में तीन बार लोडिंग बफर के 500 μL जोड़ें।
    नोट: स्तंभ जलाशय पूरी तरह से खाली होने पर केवल धोने के लिए नया लोडिंग बफर जोड़ें।
  9. कॉलम को धोने के बाद विभाजक से कॉलम निकालें और इसे 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब पर रखें।
  10. कॉलम में लोडिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें और चुंबकीय रूप से लेबल वाली कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए प्लंजर को कॉलम के नीचे धक्का दें। चुंबकीय रूप से लेबल वाली कोशिकाओं को पूरी तरह से इकट्ठा करने के लिए इस चरण को तीन बार दोहराएं।

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Representative Results

सीडी 11 बी मोतियों का उपयोग करके अलग किए गए माइक्रोग्लिया में उच्च शुद्धता होती है
डिमाइलिनेशन माउस मॉडल में घावों के आसपास माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को उपर्युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किया गया था और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परीक्षण किया गया था। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री में माइक्रोग्लिया निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं को सीडी 11 बी-फ्लोरोसिसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) और सीडी 45-एलोफाइकोसाइनिन (एपीसी) के साथ फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किया जाता है। कई साहित्य हैं जो दर्शाते हैं कि सीडी 11 बी और सीडी 45 एंटीबॉडी पृथक माइक्रोग्लिया19,22 की शुद्धता की जांच करने के लिए पर्याप्त हैं। प्रतिदीप्ति मुआवजा प्रवाह साइटोमीटर पर बिना दाग और एकल दाग नियंत्रण नमूनों का उपयोग करके पूरा किया गया था। कोशिकाओं को आगे स्कैटर-ऊंचाई (एफएससी-एच) और साइड स्कैटर-ऊंचाई (एसएससी-एच) द्वारा गेट किया गया था; एकल कोशिकाओं को आगे स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए) और एफएससी-एच द्वारा गेटेड किया गया था। चुंबकीय पृथक्करण से पहले और बाद में माइक्रोग्लिया (सीडी 11 बी + सीडी 45इंटरमीडिएट के रूप में पहचाने जाने वाले) के अनुपात का परीक्षण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। बैक-लूप तकनीक का उपयोग माइक्रोग्लिया के लिए गेट का निर्धारण करके प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण की गेटिंग रणनीति को समायोजित करने के लिए किया गया था। प्रत्येक माउस मस्तिष्क (चित्रा 3 ए) के चुंबकीय पृथक्करण से पहले लगभग 3 × 104 कोशिकाओं और 6 × 103 माइक्रोग्लिया की तुलना में, एमएसीएस आम तौर पर लगभग 2.5 × 103 कोशिकाओं और 2 × 103 माइक्रोग्लिया प्रति माउस मस्तिष्क (चित्रा 3 बी) उत्पन्न करता है, जो सभी एकल कोशिकाओं का लगभग 85% था। हालांकि, माइलॉयड कोशिकाओं के लगभग 3% (सीडी 11 बी + सीडी 45उच्च के रूप में पहचाने गए) एमएसीएस-अलग कोशिकाओं में मौजूद थे और इस प्रोटोकॉल में सीडी 11 बी आबादी से निकालना मुश्किल था। पृथक माइक्रोग्लिया की शुद्धता को दो चुंबकीय स्तंभों (पूरक चित्रा एस 1) का उपयोग करके 95% तक बढ़ाया जा सकता है। एमएसीएस सॉर्टिंग मस्तिष्क मिश्रण नमूने में माइक्रोग्लिया के लगभग 33% पर कब्जा कर सकती है।

सीडी 11 बी मोतियों का उपयोग करके अलग माइक्रोग्लिया में उच्च सेल व्यवहार्यता है
फ्लोरोक्रोम 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी (7-एएडी) का उपयोग अक्सर प्रवाह साइटोमेट्री में सेल व्यवहार्यता दिखाने के लिए किया जाता है। 7-एएडी + कोशिकाएं मृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करतीहैं 19. एमएसीएस-अलग माइक्रोग्लिया की व्यवहार्यता 7-एएडी (चित्रा 4) के साथ सेल धुंधला होने से लगभग 95% थी।

एमएसीएस द्वारा क्रमबद्ध घावों को डिमाइलिनेट करने के आसपास माइक्रोग्लिया का रूपात्मक विश्लेषण
रूपात्मक विश्लेषण से पता चला है कि माइक्रोग्लिया एमएसीएस द्वारा सक्रिय नहीं थे। माइक्रोग्लिया एमएसीएस के बाद एक विशिष्ट अनुदैर्ध्य द्विध्रुवी कोशिका शरीर प्रदर्शित करता है, जो एफएसीएस19 के बाद माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान के समान है। एलपीसी-प्रेरित डिमाइलिनेशन21 के मॉडल में डिमाइलिनेटिंग घावों के आसपास माइक्रोग्लिया को सक्रिय किया जाएगा। आयनित कैल्शियम बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आईबीए -1) द्वारा दाग वाले माइक्रोग्लिया ने इस प्रोटोकॉल में सक्रिय माइक्रोग्लिया की विशिष्ट एमेबिक आकृति विज्ञान दिखाया। पी 2 आरवाई 12 माइक्रोग्लियल आराम राज्य का एक विशिष्ट अणु है। अलग-अलग घावों की सीमा के विस्तार के कारण एमएसीएस से पहले शाखित और पी 2 आरवाई 12 + माइक्रोग्लिया का एक छोटा सा अंश है। हालांकि, एमएसीएस के बाद पी 2 आरवाई 12 + माइक्रोग्लिया का अस्तित्व यह भी इंगित करता है कि एमएसीएस माइक्रोग्लिया (पूरक चित्रा एस 2) को सक्रिय नहीं करेगा।

Figure 1
चित्र 1: तटस्थ लाल डाई द्वारा लेबल किए गए फोकल डिमाइलिनेटिंग घावों की छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गठित तीन परतों की छवियां। मलबे को हटाने की प्रक्रिया में शीर्ष दो परतों (परत 1 + परत 2) को हटाने की आवश्यकता है (प्रोटोकॉल चरण 4.5 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए) एमएसीएस से पहले प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-एच और एसएससी-एच, एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-ए और एफएससी-एच, और माइलॉयड कोशिकाओं (ऊपर) और माइक्रोग्लिया (नीचे) का चयन करने के लिए सीडी 11 बी-एफआईटीसी और सीडी 45-एपीसी। (बी) एमएसीएस के बाद प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नमूने में उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एमएसीएस के बाद माइक्रोग्लिया का अनुपात काफी बढ़ गया है: कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-एच और एसएससी-एच, एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए एफएससी-ए और एफएससी-एच, और माइलॉयड कोशिकाओं (ऊपर) और माइक्रोग्लिया (नीचे) का चयन करने के लिए सीडी 11 बी-एफआईटीसी और सीडी 45-एपीसी। संक्षेप: एसएससी-एच = साइड स्कैटर-ऊंचाई; एफएससी-एच = आगे तितर बितर-ऊंचाई; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-क्षेत्र; सीडी 45-एपीसी = एलोफाइकोसाइनिन-लेबल सीडी 45; सीडी 11 बी-एफआईटीसी = फ्लोरोसिसिन आइसोथियोसाइनेट-लेबल सीडी 11 बी; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एमएसीएस के बाद जीवित कोशिकाओं का चयन करने के लिए एमएसीएस के बाद जीवित / मृत एकल कोशिकाओं के लिए एफएसीएस गेटिंग रणनीति 7-एएडी और एसएससी-एच। संक्षेप: एसएससी-एच = साइड स्कैटर-ऊंचाई; 7-एएडी = 7-एमिनोएक्टिनोमाइसिन डी; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: वयस्क डिमाइलिनेशन चूहों से अलग माइक्रोग्लिया का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (ए) एमएसीएस से पहले प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नमूने में उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) दो चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके एमएसीएस के बाद प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण नमूने में उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (सी) दो चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके एमएसीएस के बाद प्रवाह साइटोमेट्री में सीडी 11 बी-एफआईटीसी और सीडी 45-एपीसी का एकल-पैरामीटर हिस्टोग्राम। संक्षेप: एसएससी-एच = साइड स्कैटर-ऊंचाई; एफएससी-एच = आगे तितर बितर-ऊंचाई; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-क्षेत्र; सीडी 45-एपीसी = एलोफाइकोसाइनिन-लेबल सीडी 45; सीडी 11 बी-एफआईटीसी = फ्लोरोसिसिन आइसोथियोसाइनेट-लेबल सीडी 11 बी; एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; सीडी 45इंट = मध्यवर्ती सीडी 45 अभिव्यक्ति। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: एमएसीएस से पहले और बाद में इबा -1 और पी 2 आरवाई 12 के साथ माइक्रोग्लिया के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। (ए) एमएसीएस से पहले माइक्रोग्लिया की छवियां। (बी) एमएसीएस के बाद पृथक माइक्रोग्लिया की छवियां। स्केल बार = 20 μm। संक्षेप: एमएसीएस = चुंबकीय-सक्रिय सेल छँटाई; इबा -1 = आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर अणु 1; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल डिमाइलिनेटिंग घावों के आसपास माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है, जो भड़काऊ डिमाइलिनेटिंग बीमारियों में माइक्रोग्लिया की कार्यात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने में मदद कर सकता है। सीडी 11 बी मोतियों का उपयोग करके कैप्चर किए गए माइक्रोग्लिया उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में फोकी और इष्टतम माइक्रोग्लियल शुद्धि करण का सटीक स्थानीयकरण शामिल है। प्रोटोकॉल चरण 2.1 में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि घावों को सटीक रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है20 माउस का त्याग करने से पहले एनआर समाधान 2 घंटे इंजेक्ट करना आवश्यक है। प्रोटोकॉल चरण 2.8 में, विच्छेदन के लिए एक बर्फ बॉक्स पर मस्तिष्क के ऊतक वर्गों को रखने और जितनी जल्दी हो सके इस कदम को पूरा करने के लिए देखभाल की गई थी, जिससे सेल व्यवहार्यता में सुधार हुआ। चरण 2.9 में, एंजाइम पाचन और मलबे को हटाने दोनों के लिए एक नमूने के रूप में उपयुक्त ऊतक का चयन करना आवश्यक है। चरण 3.7 को तब नहीं छोड़ा जा सकता जब मलबे को हटाने का प्रभाव संतोषजनक नहीं होता है। चरण 4.3 में, पीबीएस के अलावा विभिन्न परतों को बनाने के लिए कोमल होना चाहिए, यह सुनिश्चित करना कि जितना संभव हो उतना मलबे को हटा दिया जाए। एंजाइमेटिक पाचन को छोड़कर प्रोटोकॉल में सभी चरणों को सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने और माइक्रोग्लिया की ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को कम करने के लिए बर्फ पर किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण हल्का है और उच्च व्यवहार्यता को बरकरार रखता है, इसलिए मृत कोशिकाओं को हटाने के समाधान22,23 का उपयोग करना अनावश्यक है।

प्रोटोकॉल में माउस मस्तिष्क के लिए एंजाइमेटिक पृथक्करण विधि एकल-सेल आरएनए-सीक्यू23 के लिए उपयुक्त साबित हुई है। हालांकि प्रोटोकॉल में एंजाइम हल्के हैं, मार्श एट अल ने पाया है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस प्रोटोकॉल माइक्रोग्लिया24 के ट्रांसक्रिप्टोम को काफी बदल सकते हैं। तुलना के लिए प्रयोग में एक स्वस्थ नियंत्रण स्थापित करने से डिमाइलिनेशन के विभेदक रूप से व्यक्त जीन की पहचान करने में मदद मिल सकती है, इस प्रकार प्रोटोकॉल में असामान्य ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को समाप्त किया जा सकता है। इस बीच, एंजाइमेटिक पाचन के बाद इस असामान्य ट्रांसक्रिप्शनल स्थिति को रोकने के लिए, प्रोटोकॉल को विभिन्न चरणों में एक्टिनोमाइसिन डी, ट्रिप्टोलाइड और एनीसोमाइसिन जैसे विभिन्न प्रतिलेखन और अनुवाद अवरोधकों को जोड़कर अनुकूलित किया जा सकता है। इन अवरोधकों का उपयोग नियंत्रण की स्थापना के बिना विवो में माइक्रोग्लिया की वास्तविक जीन अभिव्यक्ति को प्रकट कर सकता है। इसलिए, प्रोटोकॉल में इन अवरोधकों के अलावा प्रयोग में आवश्यक जानवरों या नमूनों की संख्या को कम कर सकते हैं और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अधिक किफायती है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माइक्रोग्लिया के कुछ जीन इन अवरोधकों द्वारा संग्राहक होंगे, जो भविष्य के काम24 के लिए इन अवरोधकों के उपयोग को सीमित कर सकते हैं। ऊतक पृथक्करण के लिए एंजाइम मिश्रण 1 और एंजाइम मिश्रण 2 के अलावा के बाद विशेष विघटनकारी उपकरण का उपयोग करना भी प्रोटोकॉल चरण 323 में ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं को सीमित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। माइक्रोग्लिया की शुद्धता प्रोटोकॉल में केवल लगभग 85% है, जो अन्य साहित्य 19,22 के समान सभी एकल कोशिकाओं के90% से अधिक शामिल करने में विफल रहती है। एमएस कॉलम के साथ एलएस कॉलम का प्रतिस्थापन, फिल्टर की अनुपस्थिति, और माइक्रोबीड्स की गुणवत्ता संभावित कारण हो सकते हैं। यदि पृथक माइक्रोग्लिया की शुद्धता आवश्यकताओं को पूरा करने में विफल रहती है, तो चुंबकीय इनक्यूबेशन समय को लम्बा खींचना या दूसरे चुंबकीय स्तंभ के माध्यम से क्रमबद्ध कोशिकाओं को पारित करना शुद्धता में सुधार करेगा (पूरक चित्रा एस 1)। यदि कोशिकाओं की संख्या कम है, तो लापरवाह आकांक्षा से बचने के कारण ऊतक को अधिक चूहों और सेल हानि से काटा जाना चाहिए। यदि सेल व्यवहार्यता कम है, तो आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ लोडिंग बफर में पीबीएस की जगह सेल व्यवहार्यता में काफी सुधार हो सकता है। यह सेल व्यवहार्यता के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए भी फायदेमंद है कि प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधान ताजा हैं, और प्रोटोकॉल जितनी जल्दी हो सके पूरा हो गया है। उपयोगकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त शुद्धता और माइक्रोग्लिया की संख्या को संतुलित करना महत्वपूर्ण है।

प्रोटोकॉल सीडी 11 बी मोतियों के साथ माइक्रोग्लिया के बंधन और माइक्रोग्लिया को शुद्ध करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र में संवर्धन का उपयोग करता है। इसलिए, शुद्ध माइक्रोग्लिया में माइलॉयड कोशिकाओं का संदूषण होता है, जो इस प्रोटोकॉल में अपरिहार्य है। एफएसीएस के विपरीत- कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए स्वर्ण मानक- एमएसीएस द्वारा अलग माइक्रोग्लिया की शुद्धता कुछ विस्तृत अनुप्रयोगों जैसे गहरे अनुक्रमण के लिए पर्याप्त रूप से उच्च नहीं है, जो इसके व्यापक उपयोग को सीमित करती है। इसके अलावा, माइक्रोग्लिया को सॉर्ट करने के लिए एफएसीएस माइलॉयड कोशिकाओं के संदूषण को खत्म कर सकता है। हालांकि, एमएसीएस एक जेंटलर विधि है, ग्लियल कोशिकाओं विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट्स की अधिक मूल रूपात्मक विशेषताओं को बरकरार रखती है, माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए कम समय लेती है, और एफएसीएस की तुलना में उच्च सेल उपज होती है, यह सुझाव देते हुए कि यह बलिदान किए जाने वाले चूहों की संख्या को कम कर सकता है और समय के प्रति संवेदनशीलप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है 19,25 . इस बीच, एमएसीएस अधिक लागत प्रभावी और व्यापक रूप से उपलब्ध है और प्रयोगकर्ताओं के लिए कम तकनीकी आवश्यकताएं हैं। एमएसीएस को माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए सबसे विश्वसनीय और सुसंगत विधि साबित हुई है। रूपात्मक विश्लेषण से पता चला है कि माइक्रोग्लिया को एमएसीएस द्वारा सक्रिय नहीं किया जाएगा, और आरएनए-सीक्यू ने दिखाया है कि इस विधि द्वारा अलग माइक्रोग्लिया एक आराम राज्य19,26 बनाए रखता है।

कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल रोगों को कम करने में माइक्रोग्लिया के सर्वेक्षण के लिए महत्वपूर्ण है, और इस प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए माइक्रोग्लिया का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे मात्रात्मक आरटी-पीसीआर और आरएनए-सीक्यू के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल निष्क्रिय घावों का पता लगाने के लिए तटस्थ लाल डाई का उपयोग करता है, जो घाव स्थानों की सटीकता सुनिश्चित करता है और नमूने के दौरान सामान्य ऊतक के साथ किसी भी भ्रम को कम करता है। घावों का सटीक स्थानीयकरण बीमारियों के प्रभावों पर ध्यान केंद्रित करने में मदद कर सकता है और बीमारियों को कम करने में माइक्रोग्लिया के अद्वितीय आणविक फेनोटाइप और कार्यात्मक विशेषताओं का अध्ययन कर सकता है। यह रोगों को कम करने में माइक्रोग्लिया के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आधार प्रदान करेगा। चुंबकीय सीडी 11 बी मोतियों का उपयोग करके माइक्रोग्लिया को अलग करने की यह विधि प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं के साथ, उच्च सेल व्यवहार्यता और थोड़े समय में उपज के साथ माइक्रोग्लिया को शुद्ध कर सकती है, जो विभिन्न स्थितियों में माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने के लिए व्यापक उपयोग की अनुमति देती है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि कोई प्रतिस्पर्धी हित मौजूद नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को टोंगजी अस्पताल (एचयूएसटी) फाउंडेशन फॉर एक्सीलेंट यंग साइंटिस्ट (ग्रांट नंबर 2020वाईक्यू06) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Micro Centrifuge Tubes BIOFIL CFT001015
15 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011150
50 mL Centrifuge Tubes BIOFIL CFT011500
70 µm Filter Miltenyi Biotec 130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-107-677
C57BL/6J Mice SJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouse Miltenyi Biotec 130-093-634
Fetal Bovine Serum BOSTER PYG0001
FlowJo BD Biosciences V10
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Neutral Red Sigma-Aldrich 1013690025
NovoCyte Flow Cytometer Agilent A system consisting of various parts
NovoExpress Agilent 1.4.1
PBS BOSTER PYG0021
Pentobarbital Sigma-Aldrich P-010
Stereomicroscope MshOt MZ62

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 182
डेमाइलिनेशन के पशु मॉडल में चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा माउस प्राथमिक माइक्रोग्लिया का अलगाव
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Zhang, H., Yang, S., Chen, M., Tian, D. S., Qin, C. Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination. J. Vis. Exp. (182), e63511, doi:10.3791/63511 (2022).

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