Summary
ここでは、柱状磁気活性化細胞選別を利用して、脱髄疾患の動物モデルにおける原発性ミクログリアを単離および精製するためのプロトコルを提示する。
Abstract
ミクログリアは、脳内の常在する自然免疫細胞であり、中枢神経系(CNS)の炎症または傷害に対する主要な応答因子である。ミクログリアは安静状態と活性化状態に分けることができ、脳の微小環境に応じて急速に状態を変化させることができる。ミクログリアは、異なる病理学的条件下で活性化され、異なる表現型を示す。さらに、活性化ミクログリアの多くの異なるサブグループおよび異なるサブグループ間の大きな不均一性が存在する。不均一性は、主にミクログリアの分子特異性に依存する。研究は、ミクログリアが活性化され、炎症性脱髄の病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことを明らかにした。多発性硬化症や神経脊髄炎視神経スペクトラム障害などの炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの特徴をよりよく理解するために、我々は病変周囲一次ミクログリア選別プロトコルを提案する。このプロトコルは、柱状磁気活性化細胞選別(MACS)を利用して高度に精製された原発性ミクログリアを取得し、ミクログリアの分子特性を保存して、炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの潜在的な影響を調査する。
Introduction
ミクログリアは卵黄 - 嚢前駆細胞に由来し、非常に早期に胚性脳に到達し、CNS 1,2の発達に関与する。例えば、彼らはシナプス剪定3と軸索成長4の調節に関与しています。それらはニューロンの生存を促進し、ニューロンの局在化を助ける因子を分泌する5。同時に、異常な細胞やアポトーシス細胞の除去に関与し、正常な脳の発達を確保しています6。さらに、脳の免疫コンピテント細胞として、ミクログリアは脳実質を継続的に監視し、死細胞、機能不全シナプス、および細胞破片を除去する7。ミクログリアの活性化は、炎症性脱髄疾患、神経変性疾患、脳腫瘍など、さまざまな疾患において重要な役割を果たしていることが実証されています。多発性硬化症(MS)における活性化ミクログリアは、希突起膠細胞前駆細胞(OPC)の分化およびミエリン破片8を包み込むことによってミエリンの再生に寄与する。
アルツハイマー病(AD)では、アミロイドベータ(Aβ)の蓄積がミクログリアを活性化し、ミクログリアの貪食および炎症機能に影響を及ぼす9。グリオーマ関連ミクログリア(GAM)と呼ばれるグリオーマ組織中の活性化ミクログリアは、グリオーマの進行を調節し、最終的に患者の予後に影響を与える可能性がある10。この活性化はミクログリアトランスクリプトームを深く変化させ、形態学的変化、免疫受容体の発現、貪食活性の増加、およびサイトカイン分泌の増強をもたらす11。疾患関連ミクログリア(DAM)、活性化応答ミクログリア(ARM)、およびミクログリア神経変性表現型(MGnD)などの神経変性疾患における活性化ミクログリアの異なるサブセットが存在する8。
同様に、ミクログリアの複数の動的機能サブセットも、炎症性脱髄疾患12において脳内に共存する。ミクログリアの異なるサブセット間の不均一性を理解することは、炎症性脱髄疾患の病因を調査し、それらの潜在的な治療戦略を見つけるために不可欠である。ミクログリアの不均一性は、主に分子特異性8に依存する。ミクログリアの分子変化を正確に記述することは、不均一性の研究に不可欠である。単一細胞RNAシーケンシング(RNA-seq)技術の進歩により、病理学的状態における活性化ミクログリアの分子特性の同定が可能になった13。したがって、細胞集団を単離する能力は、特定の条件下でこれらの標的細胞をさらに調査するために重要である。
ミクログリアの特徴と機能を理解するために行われる研究は、培養フラスコに付着し、他の混合グリア細胞と共にプラスチック表面上で増殖するマウスの子犬脳(1〜3日齢)から多数の初代ミクログリアを調製および培養できることが見出されているので、通常 、インビトロ 研究である。続いて、純粋なミクログリアは、混合グリア細胞14、15の異なる接着性に基づいて単離され得る。しかし、この方法は周産期脳からミクログリアを単離することしかできず、数週間かかる。細胞培養における潜在的な変数は、分子発現16などのミクログリア特性に影響を与え得る。さらに、これらの方法で単離されたミクログリアは、CNS疾患の状態をシミュレートすることによってのみ インビトロ 実験に参加することができ、 in vivo 疾患状態におけるミクログリアの特徴および機能を表すことができない。したがって、成体マウスの脳からミクログリアを単離する方法を開発する必要がある。
蛍光活性化細胞選別(FACS)と磁気分離は、広く使用されている2つの方法ですが、それぞれ異なる制限があります16,17,18,19。それぞれの長所と短所は、議論のセクションで対比されます。MACS技術の成熟は、細胞を迅速に精製する可能性を提供する。Huangらは、脳内の脱髄病変を標識する便利な方法を開発した20。これら2つの技術的アプローチを組み合わせることで、我々は迅速かつ効率的な柱状CD11b磁気分離プロトコルを提案し、成体マウス脳の脱髄病変の周りのミクログリアを単離し、ミクログリアの分子特性を保存するための段階的な説明を提供する。局所脱髄病変は、プロトコル21を開始する3日前に脳梁に2μLのリゾレシチン溶液(0.9%NaCl中の1%LPC)を定位注射することによって引き起こされた。このプロトコルは、インビトロ実験で次のステップを実行するための基礎を築きます。さらに、このプロトコルは時間を節約し、さまざまな実験で広く使用するために実現可能です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物の手順は、同済医科大学の動物ケア委員会研究所、華中科技大学、中国によって承認されています。
1. 素材
- プロトコルを開始する前に、次の解決策を準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にウシ胎児血清(FBS、2%)を加えてローディングバッファーを調製する。
- ニュートラルレッド(NR)色素(最終1%)をPBSに加える。
- 市販の成人脳解離キットを用いて以下の溶液を調製する( 材料表参照)。
- 酵素ミックス1を調製するために、1.9 mLのバッファーZおよび50 μLの酵素Pを15 mLの遠沈管にピペットで入れた。
- 酵素ミックス2を調製するには、20 μLのバッファーYと10 μLの酵素Aを1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで入れます。
- 破片除去液を準備する。
2.マウスの灌流と解剖
- 腹腔内(すなわち)麻酔の2〜3時間前にPBS中の500μLの1%NR色素をマウスに注射する。
注:脱髄マウスモデルにおけるNRの腹腔内注射は、病変の識別に役立つ(図1)。 - マウスをペントバルビタール(50mg/kg、i.p.)で麻酔し、疼痛反応を調べることによってマウスが正常に麻酔されていることを確認する。
- マウスの胸腔を開き、心臓を露出させる。
- 右心房の小さな角を慎重に切り取り、左心室から20〜30mLの冷たいPBSでマウスを心臓内に灌流する。
- 麻酔下でマウスを斬首する。
- マウスの頭蓋骨を開き、慎重に頭蓋骨から脳を解放します。
- 脳をマウス脳スライス型に移し、脳を0.1cmスライスに切断する。
- 脳のスライスを取り除き、ペトリ皿(60/15mm)の冷たいPBSに入れます。脳梁の周囲のNR色素で標識された病変部を顕微手術用鉗子を用いて実体顕微鏡下で微小解剖する。
注:その後の移送を容易にするために、解剖された組織ができるだけ完全であることを確認してください。解剖の全進行は2時間で完了する必要があります。 - 解剖した組織を、適量のコールドローディングバッファーを含む15mL遠沈管に移す。
注:2〜3匹のマウスの脳梁組織を1つのサンプルとして1本のチューブにまとめる。
3. 組織解離
- 解剖した組織を300×gで30秒間遠心分離し(この速度に達した後)、チューブの底部でサンプルを回収した。
- 酵素ミックス1および酵素ミックス2をインキュベーター内で37°Cに予熱する。
- 1,950 μLの予熱酵素ミックス1を1つのサンプルに加え、37°Cのインキュベーターで5分間消化する。
- 予熱した酵素ミックス2を30μL加え、優しく混ぜる。
- 37°Cのインキュベーターで15分間消化し、5分ごとに穏やかに混合する。
- 消化後に4mLの冷たいPBSをチューブに加え、優しく振る。
- 70 μm のフィルターを 50 mL の遠沈管に置き、フィルターを 500 μL の冷たい PBS でプリウェットします。消化した組織サンプルをフィルターに通すことによって解離した組織をろ過し、50 mL遠沈管内のろ過懸濁液を15 mL遠沈管に移した。
メモ: 組織の量が少なすぎる場合は、この手順をスキップしてください。 - 濾過した組織サンプルを300×g で4°Cで10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引する。
注:酵素消化を除くすべてのステップは氷上で実行する必要があります。
4. がれきの除去
- 細胞ペレットを1,550 μLの冷たいPBSで穏やかに再懸濁する。
- 破片除去のために450μLの低温溶液を加え、よく混合する。
- 上記の混合物を、1,000 μLのピペットを使用して2 x 1 mLの冷たいPBSで非常にゆっくりと穏やかに重ねます。
注:遠沈管を45°傾け、ピペットで管壁に沿ってPBSをゆっくりと加えます。 - チューブをゆっくりと穏やかに遠心分離機に移し、4°Cおよび3,000× g で10分間スピンする。
- 遠心分離後に3つの層を探します。1,000 μLのピペットを使用して、2つの最上層を完全に吸引します(図2)。
- チューブを5 mLまでのコールドローディングバッファーで満たし、チューブを静かに3回反転させます。
- 4°Cで1,000× g で10分間遠心分離する。上清を完全に吸引し、細胞ペレットを乱さないでください。
5. ミクログリア細胞の磁気分離
- 細胞ペレットを90 μLのローディングバッファーで再懸濁し、10 μLのCD11b(ミクログリア)ビーズを加える。
- よく混ぜ合わせ、4°Cで15分間インキュベートする。
- 1 mLのローディングバッファーとピペットを加え、液体を1,000 μLのピペットで穏やかに上下させ、インキュベーション後の細胞を洗浄した。細胞を4°C、300×g で10分間遠心分離し、上清を完全に吸引して未結合ビーズを除去した。
- 細胞を500 μLのローディングバッファーに再懸濁する。
- MSカラムとそのセパレータを配置して、磁場中で正の選択を行います。
- カラムを 500 μL のローディングバッファーですすぎ、細胞を保護し、メーカーのプロトコルに基づく磁気選別効率を確保します。
- 細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、標識されていない細胞を含むフロースルーを破棄します。
- 500 μL のローディングバッファーをカラムに 3 回加えて、カラム壁に付着した細胞を洗い流し、フロースルーを廃棄します。
注: カラムリザーバが完全に空である場合にのみ、洗浄用の新しいローディングバッファを追加してください。 - カラムを洗浄した後、カラムを分離器から取り出し、15 mL 遠沈管の上に置きます。
- 1 mL のローディングバッファーをカラムに加え、プランジャーをカラムの底部に押し込んで磁気標識された細胞を洗い流します。この工程を3回繰り返して、磁気標識された細胞を完全に回収する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD11bビーズを用いて単離されたミクログリアは高純度である
脱髄マウスモデルにおける病変の周囲のミクログリア細胞を、上述のプロトコールを用いて単離し、フローサイトメトリーによって試験した。細胞をCD11b-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびCD45-アロフィコシアニン(APC)で蛍光標識し、製造業者の指示に従ってフローサイトメトリーでミクログリアを決定する。CD11bおよびCD45抗体が単離ミクログリア19、22の純度をチェックするのに十分であることを実証する複数の文献がある。蛍光補償を、未染色および単一染色対照サンプルを用いてフローサイトメーター上で完了した。細胞を前方散乱高さ(FSC−H)および側方散乱高さ(SSC−H)によってゲーティングした;単一細胞を前方散乱領域(FSC−A)およびFSC−Hによってゲーティングした。磁気分離の前後のミクログリア(CD11b + CD45中間体として同定される)の割合をフローサイトメトリーによって試験した。バックループ技術を用いて、ミクログリアのゲートを決定することによってフローサイトメトリー分析のゲーティング戦略を調整した。各マウス脳の磁気分離前の約3×104細胞および6×103ミクログリア(図3A)と比較して、MACSは一般にマウス脳あたり約2.5×103細胞および2×103ミクログリア(図3B)を産生し、これは全単一細胞の約85%であった。しかし、骨髄系細胞のほぼ3%(CD11b + CD45高と同定)がMACS分離細胞に存在し、このプロトコールではCD11b集団から除去することは困難であった。単離されたミクログリアの純度は、2つの磁気カラムを使用して95%まで増加させることができる(補足図S1)。MACS選別は、脳内混合サンプル中のミクログリアの約33%を捕捉することができた。
CD11bビーズを用いて単離されたミクログリアは、高い細胞生存率を有する
蛍光色素7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)は、フローサイトメトリーにおいて細胞生存率を示すためにしばしば使用される。7-AAD+ 細胞は死細胞19を表す。MACS分離ミクログリアの生存率は、7-AADによる細胞染色によって約95%であった(図4)。
MACSで選別した脱髄病変周辺のミクログリアの形態学的解析
形態学的解析は、ミクログリアがMACSによって活性化されないことを示した。ミクログリアは、MACS後の典型的な縦方向双極性細胞体を示し、これはFACS19後のミクログリア形態に類似している。脱髄病変の周囲のミクログリアは、LPC誘導脱髄のモデル21において活性化されるであろう。イオン化カルシウム結合アダプター分子1(Iba−1)によって染色されたミクログリアは、このプロトコールにおいて活性化ミクログリアの典型的なアメーバ形態を示した。P2ry12はミクログリア休止状態の代表的な分子である。解離した病変の程度の拡大のために、MACSの前に分枝およびP2ry12+ ミクログリアの小さな部分がある。しかし、MACS後にP2ry12+ ミクログリアが存在することは、MACSがミクログリアを活性化しないことも示している(補足図S2)。
図 1: 中性赤色色素で標識された焦点脱髄病変の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:遠心分離により形成された3層の画像。 上の2つの層(レイヤー1 + レイヤー2)は、破片除去プロセスで除去する必要があります(プロトコルステップ4.5を参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MACS前後の成体マウスの脱髄病変から単離したミクログリアのフローサイトメトリー分析(A)MACS前のフローサイトメトリー解析で用いたゲーティング戦略の模式図:FSC-HおよびSSC-H細胞を選択するためのFSC-H、単一細胞を選択するためのFSC-AおよびFSC-H、骨髄系細胞を選択するためのCD11b-FITCおよびCD45-APC(上)およびミクログリア(下)。(b)MACS後のフローサイトメトリー分析サンプルで用いられるゲーティング戦略の概略図。ミクログリアの割合はMACS後に有意に増加している:細胞を選択するためのFSC-HおよびSSC-H、単一細胞を選択するためのFSC-AおよびFSC-H、および骨髄系細胞を選択するためのCD11b-FITCおよびCD45-APC(上向き)およびミクログリア(下向き)。略語: SSC-H = 側面散乱高さ;FSC-H = 前方散乱高さ;FSC-A = 前方散乱面積;CD45-APC = アロフィコシアニン標識CD45;CD11b-FITC=フルオレセインイソチオシアネート標識CD11b;MACS = 磁気活性化細胞選別。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MACS後の生細胞/死細胞に対するFACSゲーティング戦略、MACS後の生細胞 を選択するための7-AADおよびSSC-H。略語: SSC-H = 側面散乱高さ;7-AAD=7-アミノアクチノマイシンD;MACS = 磁気活性化細胞選別;FACS = 蛍光活性化細胞選別。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:成体脱髄マウスから単離されたミクログリアのフローサイトメトリー分析。 (a)MACS前のフローサイトメトリー分析サンプルで用いられるゲーティング戦略の模式図。(b)2つの磁気カラムを用いたMACS後のフローサイトメトリー分析サンプルで用いられるゲーティング戦略の概略図。(c)2つの磁気カラムを用いたMACS後のフローサイトメトリーにおけるCD11b-FITCおよびCD45-APCのシングルパラメータヒストグラム。略語: SSC-H = 側面散乱高さ;FSC-H = 前方散乱高さ;FSC-A = 前方散乱面積;CD45-APC = アロフィコシアニン標識CD45;CD11b-FITC=フルオレセインイソチオシアネート標識CD11b;MACS = 磁気活性化細胞選別;CD45Int = 中間 CD45 発現。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:MACS前後のIba-1およびP2ry12によるミクログリアの免疫蛍光染色。 (A) MACS以前のミクログリアの画像。(B)MACS後の分離ミクログリアの画像。スケールバー = 20 μm。略語: MACS = 磁気活性化細胞選別;Iba-1 = イオン化カルシウム結合アダプター分子 1;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、脱髄病変の周囲のミクログリアを単離する方法を提案しており、これは炎症性脱髄疾患におけるミクログリアの機能的特徴の研究に役立つ可能性がある。CD11bビーズを用いて捕捉されたミクログリアは、高純度および生存率を示す。プロトコルの重要なステップには、病巣の正確な局在化と最適なミクログリア精製が含まれます。プロトコルステップ2.1では、病変を正確に表示できるようにマウスを犠牲にする前にNR溶液を2時間注射する必要がある20。プロトコールステップ2.8では、解剖のために脳組織切片を氷箱の上に置き、できるだけ早くこのステップを完了し、それによって細胞生存率を改善するように注意が払われた。ステップ2.9では、酵素消化とデブリ除去の両方のために、適切な組織を1つのサンプルとして選択する必要があります。ステップ3.7は、破片除去の効果が十分でない場合、スキップすることはできません。ステップ4.3では、PBSの添加は、異なる層を形成するために穏やかでなければならず、できるだけ多くの破片が除去されるようにしなければならない。酵素消化を除くプロトコルのすべてのステップは、細胞の生存率を確保し、ミクログリアの転写応答を減少させるために氷上で実施されるべきである。プロトコールの各ステップは軽度であり、高い生存率を保持するので、死細胞除去溶液22、23を使用する必要はない。
プロトコールにおけるマウス脳の酵素解離法は、単一細胞RNA-seq23に適していることが証明されている。プロトコール中の酵素は軽度であるが、マーシュらは、37°Cでの様々な酵素加水分解プロトコールがミクログリア24のトランスクリプトームを有意に変化させる可能性があることを見出した。比較のために実験で健康な対照を設定することは、脱髄の発現差遺伝子を同定するのに役立ち、したがって、プロトコールにおける異常な転写応答を排除することができる。一方、酵素消化後のこの異常な転写状態を防止するために、プロトコールは、アクチノマイシンD、トリプトライドおよびアニソマイシンなどの種々の転写および翻訳阻害剤を異なるステップで添加することによって最適化することができる。これらの阻害剤の使用は、対照の設定なしに 、インビボでの ミクログリアの実際の遺伝子発現を明らかにすることができる。したがって、これらの阻害剤をプロトコールに添加すると、実験に必要な動物または標本の数を減らすことができ、下流分析にとってより経済的である。しかしながら、ミクログリアのいくつかの遺伝子は、これらの阻害剤によって調節され、将来の研究のためのこれらの阻害剤の利用が制限され得ることに留意されたい24。組織解離のために酵素ミックス1および酵素ミックス2を添加した後に特殊な解離器器具を使用することもまた、プロトコルステップ323における転写応答を制限することができる。
このプロトコルにはいくつかの制限があります。ミクログリアの純度は、プロトコールにおいて約85%に過ぎず、これは他の文献に類似したすべての単一細胞の90%以上を構成することができない19、22。LSカラムをMSカラムに置き換えること、フィルターがないこと、およびマイクロビーズの品質が潜在的な原因である可能性があります。単離されたミクログリアの純度が要件を満たしていない場合、磁気インキュベーション時間を延長するか、選別した細胞を第2の磁気カラムに通すことで純度が向上します(補足図S1)。細胞数が少ない場合、組織はより多くのマウスから採取されるべきであり、不注意な吸引による細胞損失は回避されるべきである。細胞生存率が低い場合、ローディングバッファー中のPBSをRPMI 1640培地で置き換えると、細胞生存率を有意に改善する可能性がある。また、プロトコルで使用されるすべてのソリューションが新鮮であり、プロトコルができるだけ早く完了することを保証することは、細胞生存率にとって有益です。このプロトコルを使用して得られるミクログリアの純度と数のバランスをとることは、ユーザーにとって重要です。
このプロトコルは、ミクログリアとCD11bビーズとの結合および磁場中での濃縮を利用してミクログリアを精製する。したがって、精製ミクログリアは骨髄系細胞の汚染を含み、これはこのプロトコールにおいて避けられない。FACS(細胞を選別するためのゴールドスタンダード)とは対照的に、MACSによって分離されたミクログリアの純度は、ディープシーケンシングなどの一部の精巧なアプリケーションでは十分に高くないため、その広範な使用が制限されます。加えて、ミクログリアを選別するためのFACSは、骨髄系細胞の汚染を排除することができる。しかし、MACSはより穏やかな方法であり、グリア細胞、特にアストロサイトのより独創的な形態学的特徴を保持し、ミクログリアを単離するのにより少ない時間がかかり、FACSよりも高い細胞収量を有し、屠殺されるマウスの数を減らすことができ、時間感受性の実験により適している可能性があることを示唆している19,25.一方、MACSはより費用対効果が高く、広く利用可能であり、実験者にとっての技術的要件は低い。MACSはミクログリアを単離するための最も信頼性が高く一貫した方法であることが証明されています。形態学的解析により、ミクログリアはMACSによって活性化されないことが示され、RNA-seqは、この方法で単離されたミクログリアが静止状態を維持することを実証した19,26。
全体として、このプロトコルは脱髄疾患におけるミクログリアの調査に重要であり、このプロトコルによって単離されたミクログリアは、定量的RT-PCRおよびRNA-seqなどの様々な下流用途に利用することができる。このプロトコルは、中性赤色色素を利用して脱髄病変を特定し、病変位置の精度を保証し、サンプリング中の正常組織との混同を低減します。病変の正確な局在化は、疾患の影響に焦点を当て、脱髄疾患におけるミクログリアのユニークな分子表現型および機能的特徴を研究するのに役立つ可能性がある。これは、脱髄疾患におけるミクログリアのメカニズムを研究するための基礎を提供するであろう。磁気CD11bビーズを用いてミクログリアを単離するこの方法は、実験条件の必要条件を最小限に抑えながら、高い細胞生存率と収量でミクログリアを短時間で精製することができ、異なる条件下でミクログリアを研究するための広範な使用を可能にする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、同済病院(HUST)優秀若手科学者財団(助成金番号2020YQ06)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
