Summary
여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
뇌에 상주하는 선천적 면역 세포 인 Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 염증 또는 손상에 대한 주요 반응자입니다. 미세아교세포는 휴지 상태와 활성화 상태로 나눌 수 있으며 뇌의 미세 환경에 반응하여 상태를 빠르게 변화시킬 수 있습니다. Microglia는 다른 병리학 적 조건 하에서 활성화되고 다른 표현형을 나타낼 것입니다. 또한, 활성화된 미세아교세포의 많은 상이한 하위군이 존재하며, 상이한 하위군 사이에 큰 이질성이 있다. 이질성은 주로 미세아교세포의 분자 특이성에 의존한다. 연구에 따르면 microglia가 활성화되고 염증성 탈수초화의 병리학 적 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 나타났습니다. 다발성 경화증 및 신경 척수염 옵티카 스펙트럼 장애와 같은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 특성을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 perilesional 원발성 미세아교세포 분류 프로토콜을 제안한다. 이 프로토콜은 원주형 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 고도로 정제 된 일차 미세 아교세포를 얻고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하여 염증성 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 잠재적 영향을 조사합니다.
Introduction
Microglia는 노른자 - 낭 선조에서 유래하며, 배아 뇌에 매우 일찍 도달하여 CNS 1,2의 발달에 참여합니다. 예를 들어, 그들은 시냅스 가지치기3 및 축삭 성장 조절4에 관여한다. 그들은 신경 생존을 촉진하고 신경 국소화를 돕는 인자를 분비합니다5. 동시에, 그들은 정상적인 뇌 발달을 보장하기 위해 비정상적인 세포와 사멸 세포를 제거하는 데 관여합니다6. 또한, 뇌의 면역능력이 있는 세포로서, 미세아교세포는 뇌 실질종을 지속적으로 감시하여 죽은 세포, 기능장애성 시냅스, 세포 파편7을 제거한다. 미세아교세포 활성화가 염증성 탈수초성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 뇌종양을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. 다발성 경화증 (MS)에서 활성화된 미세아교세포는 올리고덴드로사이트 전구체 세포 (OPCs)의 분화 및 미엘린 파편을 삼킴으로써 미엘린의 재생에 기여한다8.
알츠하이머 병 (AD)에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 축적은 미세 아교세포를 활성화시켜 미세 아교세포9의 식세포 및 염증 기능에 영향을 미칩니다. 신경교종 관련 미세아교세포(GAM)라고 불리는 신경교종 조직에서 활성화된 미세아교세포는 신경교종의 진행을 조절할 수 있으며 궁극적으로 환자(10)의 예후에 영향을 미칠 수 있다. 활성화는 미세아교세포 전사체를 심오하게 변화시켜 형태학적 변화, 면역 수용체의 발현, 식세포 활성 증가, 사이토카인 분비 강화(11)를 초래한다. 신경 퇴행성 질환에서 활성화된 미세아교세포의 상이한 서브세트, 예컨대 질환 관련 미세아교세포 (DAM), 활성화된 반응 미세아교세포 (ARM), 및 미세아교세포 신경퇴행성 표현형(MGnD)8이 있다.
유사하게, 미세아교세포의 다수의 동적 기능적 서브세트는 또한 염증성 탈수초성 질환(12)에서 뇌에 공존한다. 미세아교세포의 상이한 서브세트 사이의 이질성을 이해하는 것은 염증성 탈수초성 질환의 발병기전을 조사하고 그들의 잠재적인 치료 전략을 찾는 데 필수적이다. 미세아교세포의 이질성은 주로 분자 특이성8에 의존한다. 이질성의 연구를 위해 미세 아교세포의 분자 변화를 정확하게 설명하는 것이 필수적입니다. 단일 세포 RNA-시퀀싱 (RNA-seq) 기술의 발전은 병리학 적 조건13에서 활성화 된 미세 아교세포의 분자 특성의 확인을 가능하게했습니다. 따라서, 세포 집단을 단리하는 능력은 특정 조건 하에서 이들 표적 세포의 추가 조사를 위해 중요하다.
microglia의 특성과 기능을 이해하기 위해 수행 된 연구는 일반적으로 시험관 내 연구이며, 많은 수의 1 차 미세 아교세포가 배양 플라스크에 부착되고 다른 혼합 신경교 세포와 함께 플라스틱 표면에서 자라는 마우스 강아지 두뇌 (1-3 일 이전)에서 제조되고 배양 될 수 있음이 밝혀 졌기 때문입니다. 이어서, 순수한 미세아교세포는 혼합된 신경교세포(14,15)의 상이한 접착성에 기초하여 단리될 수 있다. 그러나이 방법은 주산기 뇌에서 미세 아교세포를 분리 할 수 있으며 몇 주가 걸립니다. 세포 배양에서 잠재적인 변수는 분자 발현16과 같은 미세아교세포 특성에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이, 이러한 방법에 의해 단리된 미세아교세포는 CNS 질환의 상태를 시뮬레이션함으로써 시험관내 실험에만 참여할 수 있으며, 생체내 질환 상태에서 미세아교세포의 특성과 기능을 나타낼 수 없다. 따라서 성인 마우스 뇌에서 미세 아교세포를 분리하는 방법을 개발할 필요가 있습니다.
형광 활성화 세포 분류 (FACS)와 자기 분리는 널리 사용되는 두 가지 방법이지만 고유 한 제한 사항16,17,18,19이 있습니다. 각각의 장점과 단점은 토론 섹션에서 대조 될 것입니다. MACS 기술의 성숙은 세포를 신속하게 정화 할 수있는 가능성을 제공합니다. Huang et al.은 뇌의 탈수초성 병변을 라벨링하는 편리한 방법을 개발했습니다20. 이 두 가지 기술적 접근 방식을 결합하여 우리는 신속하고 효율적인 원주형 CD11b 자기 분리 프로토콜을 제안하여 성인 마우스 뇌에서 탈수초성 병변 주위의 미세 아교세포를 분리하고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하기위한 단계별 설명을 제공합니다. 국소 탈수초성 병변은 프로토콜 21을 시작하기 3일 전에 코퍼스 캘로섬에 2 μL의 리솔레시틴 용액 (0.9% NaCl 중1% LPC)의 입체주성 주사에 의해 야기되었다. 이 프로토콜은 시험관내 실험에서 다음 단계를 수행하기 위한 토대를 마련합니다. 또한이 프로토콜은 시간을 절약하고 다양한 실험에서 널리 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다.
1. 재료
- 프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결 방법을 준비하십시오.
- 인산완충식염수(PBS)에 우태아혈청(FBS, 2%)을 첨가하여 로딩버퍼를 준비한다.
- PBS에 중성 적색 (NR) 염료 (최종 1 %)를 첨가한다.
- 시판되는 성인 뇌 해리 키트를 사용하여 다음 용액을 준비 하십시오 (재료 표 참조).
- 효소 믹스 1을 제조하기 위해, 1.9 mL의 완충액 Z 및 50 μL의 효소 P를 피펫으로 15 mL 원심분리 튜브에 넣었다.
- 효소 믹스 2를 제조하기 위해, 20 μL의 완충액 Y 및 10 μL의 효소 A를 피펫으로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
- 이물질 제거 용액을 준비하십시오.
2. 생쥐 관류 및 해부
- 복강내로(i.p.) 마취 전에 PBS 2-3 h에 1% NR 염료 500 μL를 마우스에 주사한다.
참고: 탈수초성 마우스 모델에 NR을 복강내 주사하면 병변을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 1). - 펜토바르비탈 (50 mg / kg, i.p.)으로 마우스를 마취시키고 통증 반응을 검사하여 마우스가 성공적으로 마취되었는지 확인하십시오.
- 마우스의 흉강을 열고 심장을 노출시킵니다.
- 오른쪽 심방의 작은 모서리를 조심스럽게 자르고 좌심실에서 차가운 PBS 20-30 mL로 마우스를 심장 내 관류하십시오.
- 마취하에 마우스를 무력화하십시오.
- 마우스의 두개골을 열고 조심스럽게 두개골에서 뇌를 해방시킵니다.
- 뇌를 마우스 뇌 슬라이스 몰드로 옮기고 뇌를 0.1cm 조각으로 자릅니다.
- 뇌 조각을 제거하고 페트리 접시 (60/15mm)의 차가운 PBS에 넣으십시오. NR 염료에 의해 표지된 병변을 미세외과 포셉을 사용하여 입체현미경 하에서 코퍼스 캘로섬 주위에 미세 해부한다.
참고 : 해부 된 조직이 후속 전달을 용이하게하기 위해 가능한 한 완전한지 확인하십시오. 총 해부 진행은 2 시간 안에 완료되어야합니다. - 해부된 조직을 적절한 양의 차가운 로딩 완충액을 함유하는 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
참고: 2-3마리의 마우스의 코퍼스 캘로섬 조직을 하나의 튜브에 하나의 샘플로 함께 풀링합니다.
3. 조직 해리
- 해부된 조직을 300 ×g에서 30 s 동안 원심분리하여(이 속도에 도달한 후) 튜브의 바닥에서 샘플을 수집한다.
- 예열효소 믹스 1과 효소 믹스 2 내지 37°C를 인큐베이터에서 예열한다.
- 1,950 μL의 예열된 효소 믹스 1을 샘플 1개에 첨가하고, 37°C의 인큐베이터에서 5분 동안 소화시킨다.
- 30 μL의 예열 효소 믹스 2를 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
- 37°C의 인큐베이터에서 15분 동안 소화하고 5분마다 부드럽게 혼합한다.
- 소화 후 차가운 PBS 4 mL를 튜브에 넣고 부드럽게 흔든다.
- 70 μm 필터를 50 mL 원심분리 튜브에 놓고 필터를 500 μL의 차가운 PBS로 미리 적시십시오. 소화된 조직 샘플을 필터를 통해 통과시켜 해리된 조직을 여과하고, 여과된 현탁액을 50 mL 원심분리 튜브로 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.
참고: 조직의 양이 너무 작은 경우 이 단계를 건너뜁니다. - 여과된 조직 샘플을 4°C에서 10분 동안 300 ×g 에서 원심분리하고, 상층액을 천천히 그리고 완전히 흡인한다.
참고 : 모든 단계는 효소 소화를 제외한 얼음에서 수행되어야합니다.
4. 이물질 제거
- 세포 펠릿을 1,550 μL의 차가운 PBS로 부드럽게 재현탁시킨다.
- 이물질 제거를 위해 차가운 용액 450μL를 넣고 잘 섞는다.
- 상기 혼합물을 1,000 μL 피펫을 사용하여 2 x 1 mL의 차가운 PBS로 매우 천천히 그리고 부드럽게 오버레이한다.
참고 : 원심 분리 튜브를 45 ° 기울이고 피펫으로 튜브 벽을 따라 PBS를 천천히 추가하십시오. - 튜브를 천천히 부드럽게 원심분리기로 옮기고 4°C 및 3,000 × g 에서 10분 동안 회전시킨다.
- 원심 분리 후 세 개의 층을 찾으십시오. 1,000 μL 피펫을 사용하여 두 개의 최상층을 완전히 흡인한다(그림 2).
- 튜브를 최대 5mL의 차가운 로딩 버퍼로 채우고 튜브를 세 번 부드럽게 뒤집습니다.
- 4°C에서 1,000 × g 을 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 완전히 흡인하고 세포 펠릿을 파괴하지 마십시오.
5. 미세아교세포의 자기분리
- 세포 펠렛을 90 μL의 로딩 완충액으로 재현탁시키고 10 μL의 CD11b (Microglia) 비드를 첨가한다.
- 잘 섞어서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 로딩 버퍼 1 mL를 첨가하고 1,000 μL 피펫으로 액체를 부드럽게 상하로 피펫하여 인큐베이션 후 세포를 세척한다. 세포를 4°C에서 10분 동안 300 × g 으로 원심분리하고, 상층액을 완전히 흡인하여 결합되지 않은 비드를 제거하였다.
- 세포를 500 μL의 로딩 완충액에 재현탁시킨다.
- MS 컬럼을 자기장에 포지티브 선택을 위한 세퍼레이터와 함께 배치한다.
- 500μL의 로딩 버퍼로 컬럼을 헹구어 세포를 보호하고 제조업체의 프로토콜에 기반한 자기 분류 효율을 보장합니다.
- 세포 현탁액을 MS 컬럼 상에 적용하고, 표지되지 않은 세포를 함유하는 유동을 폐기한다.
- 500 μL의 로딩 버퍼를 컬럼에 세 번 첨가하여 컬럼 벽에 부착된 세포를 세척하고 유류를 버린다.
참고: 컬럼 저장소가 완전히 비어있는 경우에만 세척을 위해 새 로딩 버퍼를 추가하십시오. - 컬럼을 세척한 후 분리기로부터 컬럼을 제거하고 15 mL 원심분리 튜브 상에 놓는다.
- 로딩 버퍼 1 mL를 컬럼에 넣고 플런저를 컬럼 바닥으로 밀어 자기적으로 표지된 세포를 플러시한다. 이 단계를 세 번 반복하여 자기적으로 표지된 세포를 완전히 수집합니다.
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Representative Results
CD11b 비드를 사용하여 분리된 미세아교세포는 고순도를 갖는다.
탈수초화 마우스 모델에서 병변 주위의 미세아교세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 단리하고 유세포 분석기에 의해 시험하였다. 세포는 CD11b-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 CD45-알로피코시아닌 (APC)으로 형광 표지되어 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기에서 미세아교세포를 결정한다. CD11b 및 CD45 항체가 단리된 미세아교세포19,22의 순도를 확인하기에 충분하다는 것을 입증하는 다수의 문헌이 있다. 형광 보상은 염색되지 않은 단일 염색된 대조군 샘플을 사용하여 유동 세포계 상에서 완료되었다. 세포를 순방향 산란-높이 (FSC-H) 및 측면 산란 높이 (SSC-H)에 의해 게이팅하였고; 단일 세포를 순방향 산란 면적 (FSC-A) 및 FSC-H에 의해 게이팅하였다. 자기 분리 전후의 미세아교세포(CD11b+CD45중간체로 확인됨)의 비율을 유세포 분석기에 의해 시험하였다. 백루프 기술은 미세아교세포에 대한 게이트를 결정함으로써 유세포 분석의 게이팅 전략을 조정하는데 사용되었다. 각 마우스 뇌× 자기 분리 전에 대략 3 × 10,4 세포 및 6 × 10,3 미세아교세포와 비교하여(도 3A), MACS는 일반적으로 마우스 뇌당 대략 2.5 × 10,3세포 및 2 10,3미세아교세포를 산출하며(도 3B), 이는 모든 단일 세포의 대략 85%였다. 그러나, 골수성 세포의 거의 3%(CD11b+CD45하이로 확인됨)는 MACS로 분리된 세포에 존재하였고, 이 프로토콜에서 CD11b 집단으로부터 제거하기가 어려웠다. 분리된 미세아교세포의 순도는 두 개의 자기 컬럼을 사용하여 95%까지 증가시킬 수 있다(보충 그림 S1). MACS 분류는 뇌 혼합물 샘플에서 미세아교세포의 약 33%를 포획할 수 있다.
CD11b 비드를 사용하여 분리된 미세아교세포는 높은 세포 생존율을 갖는다.
플루오로크롬 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)는 유세포 분석기에서 세포 생존율을 나타내기 위해 종종 사용된다. 7-AAD+ 세포는 죽은 세포(19)를 나타낸다. MACS로 분리된 미세아교세포의 생존율은 7-AAD로 세포 염색에 의해 대략 95%였다(도 4).
MACS에 의해 분류된 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포의 형태학적 분석
형태학적 분석은 미세아교세포가 MACS에 의해 활성화되지 않았다는 것을 보여주었다. 미세아교세포는 MACS 후 전형적인 종방향 양극성 세포체를 나타내며, 이는 FACS19 이후의 미세아교세포 형태학과 유사하다. 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포는 LPC 유도된 탈수초화(21)의 모델에서 활성화될 것이다. 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (Iba-1)에 의해 염색된 미세아교세포는 이 프로토콜에서 활성화된 미세아교세포의 전형적인 아메바 형태를 나타내었다. P2ry12는 미세아교세포 휴지 상태의 전형적인 분자이다. 해리 된 병변의 범위의 확장으로 인해 MACS 전에 분지 및 P2ry12 + 미세 아교세포의 작은 부분이 있습니다. 그러나, MACS 후에 P2ry12+ 미세아교세포의 존재는 또한 MACS가 미세아교세포를 활성화시키지 않을 것임을 나타낸다(보충 그림 S2).
그림 1: 중성 적색 염료로 표지된 초점 탈수초성 병변의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 원심분리에 의해 형성된 세 층의 이미지. 상위 2 층 (계층 1 + 계층 2)은 이물질 제거 과정에서 제거해야합니다 (프로토콜 단계 4.5 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: MACS 전후의 성인 마우스의 탈수초화 병변으로부터 분리된 미세아교세포의 유세포 분석. (A) MACS 전 유세포 분석에 사용된 게이팅 전략의 개략적 표현: 세포를 선택하기 위한 FSC-H 및 SSC-H, 단일 세포를 선택하기 위한 FSC-A 및 FSC-H, 골수성 세포(위) 및 미세아교세포(아래)를 선택하기 위한 CD11b-FITC 및 CD45-APC. (B) MACS 후 유세포 분석 샘플에 사용된 게이팅 전략의 개략적 표현. 미세아교세포의 비율은 MACS 이후 크게 증가하였다: 세포를 선택하는 FSC-H 및 SSC-H, 단일 세포를 선택하는 FSC-A 및 FSC-H, 골수성 세포를 선택하는 CD11b-FITC 및 CD45-APC(위) 및 미세아교세포(아래). 약어: SSC-H = 측면 산란-높이; FSC-H = 순방향 산란-높이; FSC-A = 전방 산란 영역; CD45-APC = 알로피코시아닌-표지된 CD45; CD11b-FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 CD11b; MACS = 자기 활성화 셀 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : MACS. 7-AAD 및 MACS 후 살아있는 세포를 선택하기위한 SSC-H 이후의 생존 / 죽은 단일 세포에 대한 FACS 게이팅 전략. 약어: SSC-H = 측면 산란-높이; 7-AAD = 7-아미노악티노마이신 D; MACS = 자기-활성화된 세포 정렬; FACS = 형광-활성화 세포 분류. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S1: 성인 탈수초화 마우스로부터 분리된 미세아교세포의 유세포 분석 결과. (A) MACS 이전의 유세포 분석 샘플에 사용된 게이팅 전략의 개략적 표현. (b) 두 개의 자기 컬럼을 사용한 MACS 후 유세포 분석 샘플에 사용된 게이팅 전략의 개략적인 표현. (c) 두 개의 자기 컬럼을 이용한 MACS 후 유세포 분석기에서 CD11b-FITC 및 CD45-APC의 단일 파라미터 히스토그램. 약어: SSC-H = 측면 산란-높이; FSC-H = 순방향 산란-높이; FSC-A = 전방 산란 영역; CD45-APC = 알로피코시아닌-표지된 CD45; CD11b-FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트-표지된 CD11b; MACS = 자기-활성화된 세포 정렬; CD45Int = 중간 CD45 발현. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도표 S2: MACS 전후에 Iba-1 및 P2ry12를 사용한 미세아교세포의 면역형광 염색. (A) MACS 이전의 미세아교세포 이미지. (B) MACS 후 분리된 미세아교세포의 이미지. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : MACS = 자기 활성화 셀 정렬; Iba-1 = 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포를 분리하는 방법을 제안한다. CD11b 비드를 사용하여 포획된 미세아교세포는 높은 순도 및 생존력을 나타낸다. 프로토콜의 중요한 단계에는 초점의 정확한 국소화와 최적의 미세아교세포 정제가 포함됩니다. 프로토콜 단계 2.1에서, 병변이 정확하게 표시될 수 있도록 마우스를 희생시키기 전에 NR 용액 2h를 주입할 필요가 있다(20). 프로토콜 단계 2.8에서, 해부를 위해 아이스 박스에 뇌 조직 절편을 배치하고 가능한 한 빨리이 단계를 완료하여, 세포 생존력을 향상시키도록 주의를 기울였다. 단계 2.9에서, 효소 소화 및 이물질 제거를 위한 하나의 샘플로서 적절한 조직을 선택할 필요가 있다. 이물질 제거 효과가 만족스럽지 않은 경우 3.7 단계를 건너 뛸 수 없습니다. 단계 4.3에서, PBS의 첨가는 상이한 층을 형성하기 위해 온화해야 하며, 가능한 한 많은 이물질이 제거되도록 보장한다. 효소 소화를 제외한 프로토콜의 모든 단계는 세포 생존력을 보장하고 미세 아교세포의 전사 반응을 줄이기 위해 얼음 위에서 수행되어야합니다. 프로토콜의 각 단계는 경미하고 높은 생존력을 유지하므로 죽은 세포 제거 용액22,23을 사용할 필요가 없습니다.
프로토콜에서 마우스 뇌에 대한 효소적 해리 방법은 단세포 RNA-seq23에 적합한 것으로 입증되었다. 프로토콜의 효소는 경미하지만, Marsh 등은 37°C에서의 다양한 효소적 가수분해 프로토콜이 미세아교세포24의 전사체를 유의하게 변화시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 비교를 위한 실험에서 건강한 대조군을 설정하는 것은 탈수초화의 차등적으로 발현된 유전자를 동정하는 것을 도울 수 있고, 따라서 프로토콜에서 비정상적인 전사 반응을 제거한다. 한편, 효소 소화 후의 이러한 비정상적인 전사 상태를 방지하기 위해, 프로토콜은 다양한 단계에서 악티노마이신 D, 트립톨리드 및 아니소마이신과 같은 다양한 전사 및 번역 억제제를 추가함으로써 최적화될 수 있다. 이들 억제제의 사용은 대조군의 설정 없이 생체내에서 미세아교세포의 실제 유전자 발현을 드러낼 수 있다. 따라서, 프로토콜에 이들 억제제를 첨가하는 것은 실험에 필요한 동물 또는 표본의 수를 감소시킬 수 있고, 하류 분석에 대해 보다 경제적이다. 그러나, 미세아교세포의 일부 유전자는 이들 억제제에 의해 조절될 것이며, 이는 향후 작업(24)을 위해 이들 억제제의 이용을 제한할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 조직 해리를 위해 효소 믹스 1 및 효소 믹스 2를 첨가한 후에 특수 해리기 기기를 사용하면 프로토콜 단계 23에서 전사 반응을 제한할 수도있다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 미세아교세포의 순도는 프로토콜에서 단지 약 85%에 불과하며, 이는 다른 문헌 19,22와 유사한 모든 단일 세포의90% 이상을 포함하지 못한다. LS 컬럼을 MS 컬럼으로 교체하는 것, 필터의 부재, 및 마이크로비드의 품질이 잠재적인 원인일 수 있다. 분리된 미세아교세포의 순도가 요건을 충족시키지 못하는 경우, 자기 배양 시간을 연장하거나 정렬된 세포를 두 번째 자성 컬럼을 통해 통과시키면 순도가 향상된다(보충 그림 S1). 세포의 수가 적으면, 조직은 더 많은 마우스로부터 수확되어야 하고, 부주의한 흡인으로 인한 세포 손실은 피해야 한다. 세포 생존율이 낮으면, 로딩 완충액 중의 PBS를 RPMI 1640 배지로 대체하면 세포 생존율을 상당히 향상시킬 수 있었다. 또한 프로토콜에 사용 된 모든 솔루션이 신선하고 프로토콜이 가능한 한 빨리 완료되도록하는 것이 세포 생존에 유익합니다. 사용자가이 프로토콜을 사용하여 얻은 미세 아교세포의 순도와 수의 균형을 맞추는 것이 중요합니다.
이 프로토콜은 미세아교세포와 CD11b 비드의 결합 및 자기장에서의 농축을 활용하여 미세아교세포를 정제한다. 따라서, 정제된 미세아교세포는 골수성 세포의 오염을 포함하는데, 이는 이 프로토콜에서 불가피하다. 세포 분류를위한 황금 표준 인 FACS와는 달리 MACS에 의해 분리 된 미세 아교세포의 순도는 딥 시퀀싱과 같은 일부 정교한 응용 분야에서 충분히 높지 않아 광범위한 사용을 제한합니다. 또한, 미세아교세포를 분류하기 위한 FACS는 골수성 세포의 오염을 제거할 수 있다. 그러나 MACS는 더 온화한 방법이며, 신경교 세포 특히 성상 세포의 원래 형태 학적 특성을 유지하고, 미세 아교세포를 분리하는 데 더 적은 시간이 걸리며, FACS보다 높은 세포 수율을 가지며, 희생 될 마우스의 수를 줄일 수 있으며 시간에 민감한 실험에 더 적합 할 수 있음을 시사합니다19,25 . 한편, MACS는보다 비용 효율적이고 널리 이용 가능하며 실험자에게 기술적 요구 사항이 낮습니다. MACS는 미세아교세포를 분리하는 가장 신뢰할 수 있고 일관된 방법으로 입증되었습니다. 형태학적 분석은 미세아교세포가 MACS에 의해 활성화되지 않을 것이라는 것을 보여주었고, RNA-seq 는 이 방법에 의해 단리된 미세아교세포가 휴지 상태19,26을 유지한다는 것을 입증하였다.
전반적으로, 이 프로토콜은 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 조사에 중요하며, 이 프로토콜에 의해 단리된 미세아교세포는 정량적 RT-PCR 및 RNA-seq와 같은 다양한 다운스트림 응용에 활용될 수 있다. 이 프로토콜은 중성 적색 염료를 사용하여 탈수초성 병변을 찾아 병변 위치의 정확성을 보장하고 샘플링 중에 정상 조직과의 혼란을 줄입니다. 병변의 정확한 국소화는 질병의 영향에 초점을 맞추고 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 독특한 분자 표현형과 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 메커니즘을 연구하기 위한 기초를 제공할 것이다. 자기 CD11b 비드를 사용하여 미세아교세포를 분리하는 이 방법은 실험 조건에 대한 최소한의 요구 사항으로 단시간에 높은 세포 생존력과 수율로 미세아교세포를 정제할 수 있으며, 이는 다양한 조건에서 미세아교세포를 연구하는 데 널리 사용될 수 있게 해줍니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁하는 이익이 존재하지 않는다고 선언했다.
Acknowledgments
이 연구는 Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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