Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.
Abstract
La microglía, las células inmunes innatas residentes en el cerebro, son las principales respuestas a la inflamación o lesión en el sistema nervioso central (SNC). La microglía se puede dividir en estado de reposo y estado activado y puede cambiar rápidamente de estado en respuesta al microambiente del cerebro. La microglía se activará bajo diferentes condiciones patológicas y exhibirá diferentes fenotipos. Además, hay muchos subgrupos diferentes de microglía activada y una gran heterogeneidad entre los diferentes subgrupos. La heterogeneidad depende principalmente de la especificidad molecular de la microglía. Los estudios han revelado que la microglía se activará y jugará un papel importante en el proceso patológico de la desmielinización inflamatoria. Para comprender mejor las características de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes como la esclerosis múltiple y el trastorno del espectro de la neuromielitis óptica, proponemos un protocolo de clasificación microglial primaria perilesional. Este protocolo utiliza la clasificación de células activadas magnéticamente columnares (MACS) para obtener microglía primaria altamente purificada y preservar las características moleculares de la microglía para investigar los efectos potenciales de la microglía en enfermedades inflamatorias desmielinizantes.
Introduction
La microglía se origina a partir de progenitores de saco vitelino, que llegan al cerebro embrionario muy temprano y participan en el desarrollo del SNC 1,2. Por ejemplo, están involucrados en la poda sináptica3 y regulan el crecimiento axonal4. Secretan factores que promueven la supervivencia neuronal y ayudan a la localización neuronal5. Al mismo tiempo, están involucrados en la eliminación de células anormales y células apoptóticas para garantizar el desarrollo normal del cerebro6. Además, como las células inmunocompetentes del cerebro, la microglía vigila continuamente el parénquima cerebral para eliminar las células muertas, las sinapsis disfuncionales y los desechos celulares7. Se ha demostrado que la activación microglial juega un papel importante en una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades inflamatorias desmielinizantes, las enfermedades neurodegenerativas y los tumores cerebrales. La microglía activada en la esclerosis múltiple (EM) contribuye a la diferenciación de las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y a la regeneración de la mielina al envolver los restos de mielina8.
En la enfermedad de Alzheimer (EA), la acumulación de beta amiloide (Aβ) activa la microglía, que afecta las funciones fagocíticas e inflamatorias de la microglía9. La microglía activada en el tejido del glioma, llamada microglía asociada al glioma (GAM), puede regular la progresión del glioma y, en última instancia, afectar el pronóstico de los pacientes10. La activación altera profundamente el transcriptoma microglial, lo que resulta en cambios morfológicos, expresión de receptores inmunes, aumento de la actividad fagocítica y aumento de la secreción de citoquinas11. Existen diferentes subconjuntos de microglía activada en enfermedades neurodegenerativas como la microglía asociada a la enfermedad (DAM), la microglía de respuesta activada (ARM) y el fenotipo neurodegenerativo microglial (MGnD)8.
Del mismo modo, múltiples subconjuntos funcionales dinámicos de microglia también coexisten en el cerebro en enfermedades desmielinizantes inflamatorias12. Comprender la heterogeneidad entre los diferentes subconjuntos de microglía es esencial para investigar la patogénesis de las enfermedades inflamatorias desmielinizantes y encontrar sus posibles estrategias terapéuticas. La heterogeneidad de la microglía depende principalmente de la especificidad molecular8. Es esencial describir con precisión las alteraciones moleculares de la microglía para el estudio de la heterogeneidad. Los avances en la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (RNA-seq) han permitido identificar las características moleculares de la microglía activada en condiciones patológicas13. Por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones celulares es fundamental para una mayor investigación de estas células diana en condiciones específicas.
Los estudios realizados para comprender las características y funciones de la microglía suelen ser estudios in vitro, ya que se ha encontrado que se puede preparar y cultivar un gran número de microglía primaria a partir de cerebros de cachorros de ratón (1-3 días de edad), que se adhieren a los matraces de cultivo y crecen en la superficie plástica con otras células gliales mixtas. Posteriormente, la microglía pura se puede aislar en función de la diferente adhesividad de las células gliales mixtas14,15. Sin embargo, este método solo puede aislar la microglía del cerebro perinatal y toma varias semanas. Las variables potenciales en el cultivo celular pueden influir en las características microgliales como la expresión molecular16. Además, la microglía aislada por estos métodos solo puede participar en experimentos in vitro simulando las condiciones de las enfermedades del SNC y no puede representar las características y funciones de la microglía en estados de enfermedad in vivo. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos para aislar la microglía del cerebro del ratón adulto.
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la separación magnética son dos métodos ampliamente utilizados, aunque tienen sus propias limitaciones diferentes 16,17,18,19. Sus respectivas ventajas y desventajas se contrastarán en la sección de discusión. La maduración de la tecnología MACS ofrece la posibilidad de purificar rápidamente las células. Huang et al. han desarrollado un método conveniente para etiquetar lesiones desmielinizantes en cerebros20. Combinando estos dos enfoques técnicos, proponemos un protocolo de separación magnética columnar CD11b rápido y eficiente, proporcionando una descripción paso a paso para aislar la microglía alrededor de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones adultos y preservar las características moleculares de la microglía. Las lesiones desmielinizantes focales fueron causadas por la inyección estereotáctica de 2 μL de solución de lisolecitina (1% LPC en NaCl al 0,9%) en el cuerpo calloso 3 días antes de iniciar el protocolo21. Este protocolo sienta las bases para realizar el siguiente paso en experimentos in vitro. Además, este protocolo ahorra tiempo y sigue siendo factible para su uso generalizado en varios experimentos.
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Protocol
Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China.
1. Materiales
- Prepare las siguientes soluciones antes de comenzar el protocolo.
- Prepare el tampón de carga agregando suero fetal bovino (FBS, 2%) a solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Agregue el tinte rojo neutro (NR) (1% final) a PBS.
- Prepare las siguientes soluciones utilizando el kit de disociación cerebral para adultos disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).
- Para preparar la mezcla de enzimas 1, pipetee 1,9 ml de Buffer Z y 50 μL de enzima P en un tubo centrífugo de 15 ml.
- Para preparar la mezcla de enzimas 2, pipetee 20 μL de Buffer Y y 10 μL de Enzima A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Prepare la solución de eliminación de escombros.
2. Perfusión y disección de ratones
- Inyecte por vía intraperitoneal (i.p.) al ratón 500 μL de colorante NR al 1% en PBS 2-3 h antes de la anestesia.
NOTA: La inyección intraperitoneal de NR en modelos de ratón desmielinizantes ayuda a discernir las lesiones (Figura 1). - Anestesiar al ratón con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) y asegurarse de que el ratón se anestesia con éxito examinando las respuestas al dolor.
- Abra la cavidad torácica del ratón y exponga el corazón.
- Corte una pequeña esquina de la aurícula derecha con cuidado y perfunda intracárdicamente al ratón con 20-30 ml de PBS frío del ventrículo izquierdo.
- Decapitar al ratón bajo anestesia.
- Abra el cráneo del ratón y libere cuidadosamente el cerebro del cráneo.
- Transfiera el cerebro al molde de corte de cerebro de ratón y corte el cerebro en rodajas de 0,1 cm.
- Retire las rodajas cerebrales y colóquelas en PBS frío en una placa de Petri (60/15 mm). Microdisectar las lesiones marcadas por el tinte NR alrededor del cuerpo calloso bajo un estereomicroscopio utilizando pinzas microquirúrgicas.
NOTA: Asegúrese de que el tejido disecado sea lo más completo posible para facilitar la transferencia posterior; el progreso total de la disección debe completarse en 2 h. - Transfiera el tejido disecado a tubos centrífugos de 15 ml que contengan la cantidad adecuada de tampón de carga en frío.
NOTA: Agrupe el tejido del cuerpo calloso de 2-3 ratones en un tubo como una muestra.
3. Disociación tisular
- Centrifugar el tejido diseccionado a 300 ×g durante 30 s (después de alcanzar esta velocidad) para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
- Precalentar la mezcla de enzimas 1 y mezclar las enzimas de 2 a 37 °C en una incubadora.
- Añadir 1.950 μL de mezcla de enzimas precalentadas 1 a una muestra y digerir en una incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Añadir 30 μL de mezcla de enzimas precalentadas 2 y mezclar suavemente.
- Digerir en una incubadora a 37 °C durante 15 min y mezclar suavemente cada 5 min.
- Agregue 4 ml de PBS frío al tubo después de la digestión y agite suavemente.
- Coloque filtros de 70 μm en tubos centrífugos de 50 ml y pretuite los filtros con 500 μL de PBS frío. Filtre el tejido disociado pasando las muestras de tejido digerido a través de los filtros y transfiera la suspensión filtrada en el tubo centrífugo de 50 ml a un tubo de centrífuga de 15 ml.
NOTA: Omita este paso si la cantidad de tejido es demasiado pequeña. - Centrifugar las muestras de tejido filtrado a 300 ×g durante 10 min a 4 °C y aspirar el sobrenadante lenta y completamente.
NOTA: Todos los pasos deben realizarse sobre hielo excepto la digestión enzimática.
4. Eliminación de escombros
- Resuspend el pellet celular suavemente con 1.550 μL de PBS frío.
- Agregue 450 μL de solución fría para eliminar los desechos y mezcle bien.
- Superponga la mezcla anterior muy lenta y suavemente con 2 x 1 ml de PBS frío utilizando una pipeta de 1.000 μL.
NOTA: Incline el tubo de la centrífuga en 45 ° y agregue lentamente PBS a lo largo de la pared del tubo con la pipeta. - Transfiera el tubo lenta y suavemente a una centrífuga y gire a 4 °C y 3.000 × g durante 10 min.
- Busque tres capas después de la centrifugación. Aspirar las dos capas superiores completamente utilizando una pipeta de 1.000 μL (Figura 2).
- Llene el tubo hasta 5 ml con tampón de carga en frío e invierta suavemente el tubo tres veces.
- Centrifugadora a 4 °C y 1.000 × g durante 10 min. Aspire el sobrenadante por completo y evite interrumpir el gránulo celular.
5. Separación magnética de células microgliales
- Resuspend el pellet celular con 90 μL de tampón de carga y agregue 10 μL de perlas CD11b (Microglia).
- Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
- Añadir 1 ml de tampón de carga y pipetear el líquido suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL para lavar las células después de la incubación. Centrifugar las células a 4 °C y 300 × g durante 10 min y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas no unidas.
- Resuspendir las celdas en 500 μL de tampón de carga.
- Coloque la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético.
- Enjuague la columna con 500 μL de tampón de carga para proteger las células y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética basada en el protocolo del fabricante.
- Aplique la suspensión de celdas en la columna MS y deseche el flujo que contiene celdas sin etiquetar.
- Agregue 500 μL de búfer de carga a la columna tres veces para eliminar las celdas que se adhieren a la pared de la columna y descartar el flujo.
NOTA: Solo agregue un nuevo búfer de carga para lavar cuando el depósito de columna esté completamente vacío. - Retire la columna del separador después de lavar la columna y colóquela en un tubo centrífugo de 15 ml.
- Agregue 1 ml de búfer de carga en la columna y empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente. Repita este paso tres veces para recolectar completamente las células marcadas magnéticamente.
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Representative Results
La microglía aislada con perlas CD11b tiene una alta pureza
Las células microgliales alrededor de las lesiones en modelos de ratón de desmielinización se aislaron utilizando el protocolo mencionado anteriormente y se probaron mediante citometría de flujo. Las células se marcan fluorescentemente con ISOtiocianato de CD11b-fluoresceína (FITC) y CD45-aloficocianina (APC) para determinar la microglía en la citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Existen múltiples literaturas que demuestran que los anticuerpos CD11b y CD45 son suficientes para comprobar la pureza de la microglía aislada19,22. La compensación de fluorescencia se completó en el citómetro de flujo utilizando muestras de control no teñidas y de una sola teñida. Las celdas estaban cerradas por altura de dispersión hacia adelante (FSC-H) y altura de dispersión lateral (SSC-H); las células individuales estaban cerradas por área de dispersión avanzada (FSC-A) y FSC-H. Las proporciones de microglia (identificada como CD11b+CD45Intermediate) antes y después de la separación magnética se probaron mediante citometría de flujo. Se utilizó la técnica de bucle posterior para ajustar la estrategia de cierre del análisis de citometría de flujo mediante la determinación de la puerta para la microglía. En comparación con aproximadamente 3 × 104 células y 6 × 103 microglia antes de la separación magnética de cada cerebro de ratón (Figura 3A), MACS generalmente produce aproximadamente 2.5 × 103 células y 2 × 103 microglia por cerebro de ratón (Figura 3B), que fue aproximadamente el 85% de todas las células individuales. Sin embargo, casi el 3% de las células mieloides (identificadas como CD11b + CD45altas) estaban presentes en las células separadas por MACS y eran difíciles de eliminar de la población de CD11b en este protocolo. La pureza de la microglía aislada se puede aumentar al 95% utilizando dos columnas magnéticas (Figura suplementaria S1). La clasificación MACS podría capturar aproximadamente el 33% de la microglía en la muestra de mezcla cerebral.
La microglía aislada con perlas CD11b tiene una alta viabilidad celular
El fluorocromo 7-aminoactinomicina D (7-AAD) se usa a menudo para mostrar la viabilidad celular en la citometría de flujo. Las células 7-AAD+ representan las células muertas19. La viabilidad de la microglía separada por MACS fue de aproximadamente el 95% por tinción celular con 7-AAD (Figura 4).
Análisis morfológico de microglía alrededor de lesiones desmielinizantes clasificadas por MACS
El análisis morfológico mostró que las microglías no fueron activadas por MACS. La microglía exhibe un cuerpo típico de células bipolares longitudinales después de MACS, que es similar a la morfología microglial después de FACS19. La microglía alrededor de las lesiones desmielinizantes se activará en el modelo de desmielinización inducida por LPC21. La microglía teñida por la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba-1) mostró la morfología amebiana típica de la microglía activada en este protocolo. P2ry12 es una molécula típica del estado de reposo microglial. Hay una pequeña fracción de microglía ramificada y P2ry12+ antes de MACS debido a la expansión de la extensión de las lesiones disociadas. Sin embargo, la existencia de microglía P2ry12+ después de MACS también indica que MACS no activará la microglía (Figura suplementaria S2).
Figura 1: Imágenes de las lesiones desmielinizantes focales marcadas por el tinte rojo neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de las tres capas formadas por centrifugación. Las dos capas superiores (capa 1 + capa 2) deben eliminarse en el proceso de eliminación de escombros (consulte el paso 4.5 del protocolo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de citometría de flujo de microglía aislada de lesiones de desmielinización de ratones adultos antes y después de MACS. (A) Representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en el análisis de citometría de flujo antes de MACS: FSC-H y SSC-H para seleccionar células, FSC-A y FSC-H para seleccionar células individuales, y CD11b-FITC y CD45-APC para seleccionar células mieloides (arriba) y microglia (abajo). (B) Representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en la muestra de análisis de citometría de flujo después de MACS. La proporción de microglía ha aumentado significativamente después de MACS: FSC-H y SSC-H para seleccionar células, FSC-A y FSC-H para seleccionar células individuales, y CD11b-FITC y CD45-APC para seleccionar células mieloides (arriba) y microglia (abajo). Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersión lateral; FSC-H = altura de dispersión hacia adelante; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; CD45-APC = CD45 marcado con aloficocianina; CD11b-FITC = CD11b marcado con isotiocianato de fluoresceína; MACS = clasificación de células activadas magnéticamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estrategia de gating FACS para células individuales vivas/muertas después de MACS. 7-AAD y SSC-H para seleccionar células vivas después de MACS. Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersión lateral; 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; MACS = clasificación celular activada magnéticamente; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Análisis de citometría de flujo de microglia aislada de ratones adultos de desmielinización. (A) Representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en la muestra de análisis de citometría de flujo antes de MACS. (B) Representación esquemática de la estrategia de gating utilizada en la muestra de análisis de citometría de flujo después de MACS utilizando dos columnas magnéticas. (C) Histograma monoparamétrico de CD11b-FITC y CD45-APC en citometría de flujo después de MACS utilizando dos columnas magnéticas. Abreviaturas: SSC-H = altura de dispersión lateral; FSC-H = altura de dispersión hacia adelante; FSC-A = área de dispersión hacia adelante; CD45-APC = CD45 marcado con aloficocianina; CD11b-FITC = CD11b marcado con isotiocianato de fluoresceína; MACS = clasificación celular activada magnéticamente; CD45Int = expresión intermedia de CD45. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Tinción por inmunofluorescencia de microglía con Iba-1 y P2ry12 antes y después de MACS. (A) Imágenes de microglia antes de MACS. (B) Imágenes de microglía aislada después de MACS. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: MACS = clasificación celular activada magnéticamente; Iba-1 = molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo propone un método para aislar la microglía alrededor de las lesiones desmielinizantes, que puede ayudar a estudiar las características funcionales de la microglía en las enfermedades inflamatorias desmielinizantes. La microglía capturada con perlas CD11b exhibe una alta pureza y viabilidad. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la localización precisa de los focos y la purificación microglial óptima. En el paso de protocolo 2.1, es necesario inyectar la solución NR 2 h antes de sacrificar el ratón para garantizar que las lesiones se puedan mostrar con precisión20. En el paso de protocolo 2.8, se tuvo cuidado de colocar secciones de tejido cerebral en una caja de hielo para la disección y completar este paso lo antes posible, mejorando así la viabilidad celular. En el paso 2.9, es necesario seleccionar el tejido apropiado como una muestra tanto para la digestión enzimática como para la eliminación de desechos. El paso 3.7 no se puede omitir cuando el efecto de la eliminación de escombros no es satisfactorio. En el paso 4.3, la adición de PBS debe ser suave para formar diferentes capas, asegurando que se elimine la mayor cantidad de escombros posible. Todos los pasos del protocolo, excepto la digestión enzimática, deben realizarse sobre hielo para garantizar la viabilidad celular y reducir la respuesta transcripcional de la microglía. Cada paso en el protocolo es leve y conserva una alta viabilidad, por lo que es innecesario utilizar la solución de eliminación de células muertas22,23.
El método de disociación enzimática para el cerebro de ratón en el protocolo ha demostrado ser adecuado para el ARN-seq23 unicelular. Aunque las enzimas en el protocolo son leves, Marsh et al. han encontrado que varios protocolos de hidrólisis enzimática a 37 ° C pueden alterar significativamente el transcriptoma de la microglía24. Establecer un control saludable en el experimento para la comparación puede ayudar a identificar los genes de desmielinización expresados diferencialmente, eliminando así la respuesta transcripcional anormal en el protocolo. Mientras tanto, para prevenir este estado transcripcional anormal después de la digestión enzimática, el protocolo se puede optimizar agregando varios inhibidores de la transcripción y la traducción como actinomicina D, triptolida y anisomicina en diferentes pasos. El uso de estos inhibidores puede revelar la expresión génica real de la microglía in vivo sin el establecimiento de un control. Por lo tanto, la adición de estos inhibidores al protocolo puede reducir el número de animales o muestras requeridas en el experimento y es más económica para el análisis posterior. Sin embargo, cabe señalar que algunos genes de la microglía serán modulados por estos inhibidores, lo que puede limitar la utilización de estos inhibidores para futuros trabajos24. El uso del instrumento disociador especializado después de la adición de la mezcla de enzimas 1 y la mezcla de enzimas 2 para la disociación de tejidos también puede limitar las respuestas transcripcionales en el paso de protocolo 323.
Este protocolo tiene algunas limitaciones. La pureza de la microglía es solo de aproximadamente el 85% en el protocolo, que no comprende más del 90% de todas las células individuales similares a otras literaturas19,22. El reemplazo de la columna LS por la columna MS, la ausencia de los filtros y la calidad de las microperlas pueden ser las causas potenciales. Si la pureza de la microglía aislada no cumple con los requisitos, prolongar el tiempo de incubación magnética o pasar las células clasificadas a través de una segunda columna magnética mejorará la pureza (Figura suplementaria S1). Si el número de células es bajo, se debe recolectar tejido de más ratones y evitar la pérdida de células debido a la aspiración descuidada. Si la viabilidad de la celda es baja, reemplazar PBS en el búfer de carga con el medio RPMI 1640 podría mejorar significativamente la viabilidad de la celda. También es beneficioso para la viabilidad celular garantizar que todas las soluciones utilizadas en el protocolo estén frescas y que el protocolo se complete lo antes posible. Es importante que los usuarios equilibren la pureza y el número de microglia obtenidas utilizando este protocolo.
El protocolo utiliza la unión de la microglía con perlas CD11b y el enriquecimiento en un campo magnético para purificar la microglía. Por lo tanto, la microglía purificada contiene la contaminación de las células mieloides, lo cual es inevitable en este protocolo. A diferencia de FACS, el estándar de oro para clasificar células, la pureza de la microglía aislada por MACS no es lo suficientemente alta para algunas aplicaciones elaboradas, como la secuenciación profunda, lo que limita su uso generalizado. Además, FACS para clasificar la microglía puede eliminar la contaminación de las células mieloides. Sin embargo, MACS es un método más suave, conserva características morfológicas más originales de las células gliales, especialmente los astrocitos, toma menos tiempo para aislar la microglía y tiene un mayor rendimiento celular que FACS, lo que sugiere que puede reducir el número de ratones a sacrificar y puede ser más adecuado para experimentos sensibles al tiempo19,25 . Mientras tanto, MACS es más rentable y ampliamente disponible y tiene requisitos técnicos más bajos para los experimentadores. MACS ha demostrado ser el método más confiable y consistente para aislar la microglía. El análisis morfológico mostró que la microglía no sería activada por MACS, y el ARN-seq ha demostrado que la microglía aislada por este método mantiene un estado de reposo19,26.
En general, el protocolo es importante para el estudio de la microglía en enfermedades desmielinizantes, y la microglía aislada por este protocolo se puede utilizar para diversas aplicaciones posteriores, como la RT-PCR cuantitativa y el ARN-seq. El protocolo utiliza tinte rojo neutro para localizar lesiones desmielinizantes, lo que garantiza la precisión de las ubicaciones de las lesiones y reduce cualquier confusión con el tejido normal durante el muestreo. La localización precisa de las lesiones puede ayudar a centrarse en los efectos de las enfermedades y estudiar el fenotipo molecular único y las características funcionales de la microglía en las enfermedades desmielinizantes. Esto proporcionará una base para estudiar el mecanismo de la microglía en las enfermedades desmielinizantes. Este método de aislamiento de microglia utilizando perlas magnéticas CD11b puede purificar la microglía con alta viabilidad celular y rendimiento en poco tiempo, con requisitos mínimos para condiciones experimentales, lo que permite un uso generalizado para estudiar la microglía en diferentes condiciones.
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Disclosures
Los autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por la Fundación para Jóvenes Científicos Excelentes del Hospital Tongji (HUST) (Subvención No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
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