Summary
Her præsenterer vi en protokol til at isolere og rense primær mikroglia i dyremodeller af demyeliniserende sygdomme ved hjælp af søjleformet magnetisk aktiveret cellesortering.
Abstract
Microglia, de bosiddende medfødte immunceller i hjernen, er de primære respondere på betændelse eller skade i centralnervesystemet (CNS). Microglia kan opdeles i hviletilstand og aktiveret tilstand og kan hurtigt ændre tilstand som reaktion på hjernens mikromiljø. Microglia vil blive aktiveret under forskellige patologiske tilstande og udvise forskellige fænotyper. Derudover er der mange forskellige undergrupper af aktiveret mikroglia og stor heterogenitet mellem forskellige undergrupper. Heterogeniteten afhænger hovedsageligt af mikroglias molekylære specificitet. Undersøgelser har afsløret, at microglia vil blive aktiveret og spille en vigtig rolle i den patologiske proces med inflammatorisk demyelination. For bedre at forstå mikroglias egenskaber ved inflammatoriske demyeliniserende sygdomme som multipel sklerose og neuromyelitis optica spektrumforstyrrelse foreslår vi en perilesionel primær mikroglial sorteringsprotokol. Denne protokol anvender søjleformet magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) til at opnå stærkt oprenset primær mikroglia og bevare de molekylære egenskaber ved microglia for at undersøge de potentielle virkninger af microglia i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme.
Introduction
Microglia stammer fra æggeblomme-sac forfædre, som når den embryonale hjerne meget tidligt og deltager i udviklingen af CNS 1,2. For eksempel er de involveret i synaptisk beskæring3 og regulering af aksonal vækst4. De udskiller faktorer, der fremmer neuronal overlevelse og hjælper neuronal lokalisering5. Samtidig er de involveret i at fjerne unormale celler og apoptotiske celler for at sikre normal hjerneudvikling6. Derudover overvåger mikroglia som de immunkompetente celler i hjernen kontinuerligt hjernens parenkym for at rydde døde celler, dysfunktionelle synapser og cellulært affald7. Det er blevet påvist, at mikroglial aktivering spiller en vigtig rolle i en række sygdomme, herunder inflammatoriske demyeliniserende sygdomme, neurodegenerative sygdomme og hjernetumorer. Aktiveret mikroglia i multipel sklerose (MS) bidrager til differentieringen af oligodendrocytprækursorceller (OPC'er) og regenerering af myelin ved at opsluge myelinaffald8.
I Alzheimers sygdom (AD) aktiverer akkumulering af amyloid beta (Aβ) microglia, som påvirker de fagocytiske og inflammatoriske funktioner i microglia9. Aktiveret mikroglia i gliomvævet, kaldet gliom-associeret microglia (GAM), kan regulere udviklingen af gliom og i sidste ende påvirke prognosen hos patienter10. Aktiveringen ændrer dybt det mikrogliale transkriptom, hvilket resulterer i morfologiske ændringer, ekspression af immunreceptorer, øget fagocytisk aktivitet og forbedret cytokinsekretion11. Der er forskellige undergrupper af aktiveret mikroglia i neurodegenerative sygdomme såsom sygdomsrescieret microglia (DAM), aktiveret respons microglia (ARM) og mikroglial neurodegenerativ fænotype (MGnD)8.
Tilsvarende eksisterer flere dynamiske funktionelle undergrupper af microglia også sammen i hjernen i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme12. Forståelse af heterogeniteten mellem forskellige undergrupper af microglia er afgørende for at undersøge patogenesen af inflammatoriske demyeliniserende sygdomme og for at finde deres potentielle terapeutiske strategier. Heterogeniteten af microglia afhænger hovedsageligt af den molekylære specificitet8. Det er vigtigt at beskrive de molekylære ændringer af microglia nøjagtigt til undersøgelsen af heterogeniteten. Fremskridt inden for enkeltcellet RNA-sekventeringsteknologi (RNA-seq) har gjort det muligt at identificere de molekylære egenskaber ved aktiveret mikroglia under patologiske tilstande13. Derfor er evnen til at isolere cellepopulationer afgørende for yderligere undersøgelse af disse målceller under specifikke forhold.
Undersøgelser udført for at forstå mikroglias egenskaber og funktioner er normalt in vitro-undersøgelser, da det har vist sig, at et stort antal primære mikroglia kan fremstilles og dyrkes fra museungehjerner (1-3 dage gamle), som fastgøres til kulturkolberne og vokser på plastoverfladen med andre blandede gliaceller. Derefter kan ren mikroglia isoleres baseret på den forskellige klæbeevne af blandede gliaceller14,15. Denne metode kan dog kun isolere mikroglia fra den perinatale hjerne og tager flere uger. Potentielle variabler i cellekultur kan påvirke mikrogliale egenskaber såsom molekylær ekspression16. Desuden kan mikroglia isoleret ved disse metoder kun deltage i in vitro-forsøg ved at simulere betingelserne for CNS-sygdomme og kan ikke repræsentere mikroglias egenskaber og funktioner in vivo-sygdomstilstande. Derfor er det nødvendigt at udvikle metoder til isolering af mikroglia fra den voksne musehjerne.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk adskillelse er to meget anvendte metoder, selvom de har deres egne forskellige begrænsninger 16,17,18,19. Deres respektive fordele og ulemper vil blive kontrasteret i diskussionsafsnittet. Modningen af MACS-teknologien giver mulighed for hurtigt at rense celler. Huang et al. har udviklet en bekvem metode til at mærke demyeliniserende læsioner i hjerner20. Ved at kombinere disse to tekniske tilgange foreslår vi en hurtig og effektiv søjleformet CD11b magnetisk separationsprotokol, der giver en trinvis beskrivelse for at isolere mikroglia omkring demyeliniserende læsioner i voksne musehjerner og bevare mikroglias molekylære egenskaber. De fokale demyeliniserende læsioner var forårsaget af stereotaktisk injektion af 2 μL lysolecithinopløsning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dage før start af protokollen21. Denne protokol lægger grundlaget for at udføre det næste trin i in vitro-eksperimenter. Desuden sparer denne protokol tid og forbliver mulig til udbredt anvendelse i forskellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er blevet godkendt af Institute of Animal Care Committee of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Materialer
- Forbered følgende løsninger, inden du begynder protokollen.
- Forbered belastningsbufferen ved at tilsætte føtalt kvægserum (FBS, 2%) til fosfatbufret saltvand (PBS).
- Tilsæt neutralt rødt (NR) farvestof (sidste 1%) til PBS.
- Forbered følgende løsninger ved hjælp af det kommercielt tilgængelige Adult Brain Dissociation Kit (se tabellen over materialer).
- Til fremstilling af enzymblanding 1 pipette 1,9 ml buffer Z og 50 μL enzym P i et 15 ml centrifugerør.
- Til fremstilling af enzymblanding 2 pipettes 20 μL buffer Y og 10 μL enzym A i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Forbered opløsningen til fjernelse af snavs.
2. Mus perfusion og dissektion
- Intraperitonealt (i.p.) injiceres musen med 500 μL 1% NR-farvestof i PBS 2-3 timer før anæstesi.
BEMÆRK: Intraperitoneal injektion af NR i demyeliniserende musemodeller hjælper med at skelne læsionerne (figur 1). - Anæstesi musen med pentobarbital (50 mg / kg, i.p.), og sørg for, at musen med succes bliver anæstesi ved at undersøge smerteresponserne.
- Åbn musens brysthulrum og udsæt hjertet.
- Afskær et lille hjørne af højre atrium forsigtigt og intrakardielt perfus musen med 20-30 ml kold PBS fra venstre ventrikel.
- Halshug musen under anæstesi.
- Åbn musens kranium og frigør forsigtigt hjernen fra kraniet.
- Overfør hjernen til musens hjerneskiveform og skær hjernen i skiver på 0,1 cm.
- Fjern hjerneskiverne og læg dem i kold PBS i en petriskål (60/15 mm). Mikrodisekt læsionerne mærket af NR farvestof omkring corpus callosum under et stereomikroskop ved hjælp af mikrokirurgiske tang.
BEMÆRK: Sørg for, at det dissekerede væv er så fuldstændigt som muligt for at lette den efterfølgende overførsel; de samlede dissektionsfremskridt skal være afsluttet på 2 timer. - Det dissekerede væv overføres til 15 ml centrifugerør, der indeholder en passende mængde koldbelastningsbuffer.
BEMÆRK: Pool corpus callosumvævet fra 2-3 mus sammen i et rør som en prøve.
3. Vævssociation
- Centrifugering af det dissekerede væv ved 300 ×g i 30 s (efter at have nået denne hastighed) for at indsamle prøven i bunden af røret.
- Forvarm enzymblanding 1 og enzymblanding 2 til 37 °C i en inkubator.
- Der tilsættes 1.950 μL forvarmet enzymblanding 1 til én prøve, og der fordøjes i en inkubator ved 37 °C i 5 min.
- Tilsæt 30 μL forvarmet enzymblanding 2 og bland forsigtigt.
- Fordøjes i en inkubator ved 37 °C i 15 min. og blandes forsigtigt hvert 5. minut.
- Tilsæt 4 ml kold PBS til røret efter fordøjelsen og ryst forsigtigt.
- Anbring 70 μm filtre på 50 ml centrifugerør og forvæd filtrene med 500 μL kold PBS. Filtrer det dissocierede væv ved at føre de fordøjede vævsprøver gennem filtrene, og overfør den filtrerede suspension i 50 ml centrifugerøret til et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Spring dette trin over, hvis mængden af væv er for lille. - De filtrerede vævsprøver centrifugeres ved 300 ×g i 10 minutter ved 4 °C og aspireres langsomt og fuldstændigt til supernatanten.
BEMÆRK: Alle trin skal udføres på is undtagen den enzymatiske fordøjelse.
4. Fjernelse af snavs
- Resuspend cellepillen forsigtigt med 1.550 μL kold PBS.
- Tilsæt 450 μL kold opløsning til fjernelse af snavs og bland godt.
- Overlejr ovennævnte blanding meget langsomt og forsigtigt med 2 x 1 ml kold PBS ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
BEMÆRK: Vip centrifugerøret med 45 ° og tilsæt langsomt PBS langs rørvæggen med pipetten. - Overfør røret langsomt og forsigtigt til en centrifuge og drej ved 4 °C og 3.000 × g i 10 minutter.
- Kig efter tre lag efter centrifugering. Aspirer de to øverste lag fuldstændigt ved hjælp af en 1.000 μL pipette (figur 2).
- Fyld røret op til 5 ml med koldbelastningsbuffer og vend forsigtigt røret tre gange.
- Centrifuge ved 4 °C og 1.000 × g i 10 min. Aspirer supernatanten fuldstændigt og undgå at forstyrre cellepillen.
5. Magnetisk adskillelse af mikrogliale celler
- Resuspend cellepillen med 90 μL belastningsbuffer og tilsæt 10 μL CD11b (Microglia) perler.
- Bland godt og inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 1 ml ibelastningsbuffer og pipet væsken forsigtigt op og ned med en 1.000 μL pipette for at vaske cellerne efter inkubationen. Centrifugering af cellerne ved 4 °C og 300 × g i 10 min. og aspirer supernatanten helt for at fjerne de ubundne perler.
- Resuspend cellerne i 500 μL belastningsbuffer.
- Placer MS-kolonnen med dens separator for positiv udvælgelse i magnetfeltet.
- Skyl søjlen med 500 μL belastningsbuffer for at beskytte cellerne og sikre effektiviteten af magnetisk sortering baseret på producentens protokol.
- Påfør cellesuspensionen på MS-kolonnen, og kassér flowtroughen, der indeholder umærkede celler.
- Tilsæt 500 μL ibelastningsbuffer til kolonnen tre gange for at vaske celler, der klæber til søjlevæggen, væk og kassere gennemstrømningen.
BEMÆRK: Tilføj kun en ny ilægningsbuffer til vask, når søjlebeholderen er helt tom. - Fjern søjlen fra separatoren efter vask af søjlen, og læg den på et 15 ml centrifugerør.
- Tilføj 1 ml indlæsningsbuffer i kolonnen, og skub stemplet til bunden af søjlen for at skylle de magnetisk mærkede celler ud. Gentag dette trin tre gange for helt at indsamle de magnetisk mærkede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia isoleret ved hjælp af CD11b perler har høj renhed
Mikrogliale celler omkring læsionerne i demyelinationsmusemodeller blev isoleret ved hjælp af ovennævnte protokol og testet ved flowcytometri. Celler er fluorescerende mærket med CD11b-fluorescein isothiocyanat (FITC) og CD45-allophycocyanin (APC) for at bestemme mikroglia i flowcytometri i henhold til producentens anvisninger. Der er flere litteraturer, der viser, at CD11b- og CD45-antistoffer er nok til at kontrollere renheden af isoleret mikroglia19,22. Fluorescenskompensationen blev afsluttet på flowcytometeret ved hjælp af ufarvede og enkeltfarvede kontrolprøver. Celler blev gated af fremad scatter-højde (FSC-H) og side scatter-højde (SSC-H); enkeltceller blev gated af forward scatter-area (FSC-A) og FSC-H. Proportionerne af microglia (identificeret som CD11b + CD45Intermediate) før og efter den magnetiske adskillelse blev testet ved flowcytometri. Back-loop-teknikken blev brugt til at justere gating-strategien for flowcytometrianalyse ved at bestemme porten til microglia. Sammenlignet med ca. 3 × 104 celler og 6 × 103 mikroglia før magnetisk adskillelse af hver musehjerne (figur 3A) giver MACS generelt ca. 2,5 × 103 celler og 2 × 103 mikroglia pr. musehjerne (figur 3B), hvilket var ca. 85% af alle enkeltceller. Imidlertid var næsten 3% af myeloide celler (identificeret som CD11b + CD45høj) til stede i de MACS-adskilte celler og var vanskelige at fjerne fra CD11b-populationen i denne protokol. Renheden af den isolerede mikroglia kan øges til 95% ved hjælp af to magnetiske søjler (supplerende figur S1). MACS-sortering kunne fange ca. 33% af mikroglia i hjerneblandingsprøven.
Microglia isoleret ved hjælp af CD11b-perler har høj cellelevedygtighed
Fluorokrom 7-aminoactinomycin D (7-AAD) bruges ofte til at vise cellens levedygtighed i flowcytometrien. 7-AAD+ celler repræsenterer døde celler19. Levedygtigheden af MACS-separeret microglia var ca. 95% ved cellefarvning med 7-AAD (figur 4).
Morfologisk analyse af microglia omkring demyeliniserende læsioner sorteret efter MACS
Morfologisk analyse viste, at mikroglia ikke blev aktiveret af MACS. Microglia udviser en typisk langsgående bipolar cellekrop efter MACS, som ligner mikroglial morfologi efter FACS19. Microglia omkring demyeliniserende læsioner vil blive aktiveret i modellen af LPC-induceret demyelination21. Microglia farvet af ioniseret calciumbindende adaptormolekyle 1 (Iba-1) viste typisk amebisk morfologi af aktiveret mikroglia i denne protokol. P2ry12 er et typisk molekyle af mikroglial hviletilstand. Der er en lille brøkdel af forgrenet og P2ry12+ microglia før MACS på grund af udvidelsen af omfanget af de dissocierede læsioner. Eksistensen af P2ry12+ microglia efter MACS indikerer imidlertid også, at MACS ikke vil aktivere microglia (supplerende figur S2).
Figur 1: Billeder af de fokale demyeliniserende læsioner mærket med det neutrale røde farvestof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af de tre lag dannet ved centrifugering. De to øverste lag (lag 1 + lag 2) skal fjernes i processen til fjernelse af snavs (se protokoltrin 4.5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flowcytometrianalyse af mikroglia isoleret fra demyelinationslæsioner hos voksne mus før og efter MACS. (A) Skematisk repræsentation af gatingstrategi anvendt i flowcytometrianalyse før MACS: FSC-H og SSC-H til udvælgelse af celler, FSC-A og FSC-H til udvælgelse af enkeltceller og CD11b-FITC og CD45-APC til udvælgelse af myeloide celler (op) og mikroglia (ned). B) Skematisk gengivelse af den gating-strategi, der anvendes i flowcytometrianalyseprøven efter MACS. Andelen af microglia er steget signifikant efter MACS: FSC-H og SSC-H til udvælgelse af celler, FSC-A og FSC-H til udvælgelse af enkeltceller og CD11b-FITC og CD45-APC til udvælgelse af myeloide celler (op) og microglia (ned). Forkortelser: SSC-H = side scatter-højde; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; FSC-A = fremad spredt område; CD45-APC = allophycocyanin-mærket CD45; CD11b-FITC = fluoresceinisothiocyanatmærket CD11b; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: FACS gating strategi for levende/døde enkeltceller efter MACS. Forkortelser: SSC-H = side scatter-højde; 7-AAD = 7-aminoactinomycin D; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Flowcytometrianalyse af mikroglia isoleret fra voksne demyelinationsmus. A) Skematisk gengivelse af den gatingstrategi, der anvendes i flowcytometrianalyseprøven før MACS. B) Skematisk gengivelse af den gatingstrategi, der anvendes i flowcytometrianalyseprøven efter MACS ved hjælp af to magnetiske søjler. (C) Enkeltparameterhistogram for CD11b-FITC og CD45-APC i flowcytometri efter MACS ved hjælp af to magnetiske søjler. Forkortelser: SSC-H = side scatter-højde; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; FSC-A = fremad spredt område; CD45-APC = allophycocyanin-mærket CD45; CD11b-FITC = fluoresceinisothiocyanatmærket CD11b; MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; CD45Int = mellemliggende CD45-udtryk. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Immunofluorescensfarvning af microglia med Iba-1 og P2ry12 før og efter MACS. (A) Billeder af microglia før MACS. (B) Billeder af isoleret microglia efter MACS. Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: MACS = magnetisk aktiveret cellesortering; Iba-1 = ioniseret calciumbindende adaptormolekyle 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen foreslår en metode til at isolere microglia omkring demyeliniserende læsioner, som kan hjælpe med at studere de funktionelle egenskaber ved microglia i inflammatoriske demyeliniserende sygdomme. Microglia fanget ved hjælp af CD11b perler udviser høj renhed og levedygtighed. Kritiske trin i protokollen inkluderer præcis lokalisering af foci og optimal mikroglial oprensning. I protokoltrin 2.1 er det nødvendigt at injicere NR-opløsningen 2 timer, før musen ofres for at sikre, at læsionerne kan vises nøjagtigt20. I protokoltrin 2.8 blev der sørget for at placere hjernevævssektioner på en isboks til dissektion og fuldføre dette trin så hurtigt som muligt og derved forbedre cellelevedygtigheden. I trin 2.9 er det nødvendigt at vælge passende væv som en prøve til både enzymfordøjelse og fjernelse af snavs. Trin 3.7 kan ikke springes over, når effekten af fjernelse af snavs ikke er tilfredsstillende. I trin 4.3 skal tilsætningen af PBS være skånsom for at danne forskellige lag, hvilket sikrer, at så meget snavs fjernes som muligt. Alle trin i protokollen, undtagen enzymatisk fordøjelse, skal udføres på is for at sikre cellelevedygtighed og reducere mikrogliaens transkriptionelle respons. Hvert trin i protokollen er mildt og bevarer høj levedygtighed, så det er unødvendigt at bruge opløsningen til fjernelse af døde celler22,23.
Den enzymatiske dissociationsmetode for musehjerne i protokollen har vist sig egnet til enkeltcellet RNA-seq23. Selvom enzymerne i protokollen er milde, har Marsh et al. fundet ud af, at forskellige enzymatiske hydrolyseprotokoller ved 37 °C kan ændre transkriptomet af microglia24 betydeligt. Indstilling af en sund kontrol i eksperimentet til sammenligning kan bidrage til at identificere de differentielt udtrykte gener af demyelination og dermed eliminere det unormale transkriptionsrespons i protokollen. I mellemtiden, for at for at opnå denne unormale transkriptionelle tilstand efter enzymatisk fordøjelse, kan protokollen optimeres ved at tilføje forskellige transkriptions- og oversættelseshæmmere såsom actinomycin D, triptolid og anisomycin i forskellige trin. Anvendelsen af disse hæmmere kan afsløre den reelle genekspression af microglia in vivo uden indstilling af en kontrol. Derfor kan tilsætningen af disse hæmmere til protokollen reducere antallet af dyr eller prøver, der kræves i forsøget, og er mere økonomisk til downstream-analyse. Det skal dog bemærkes, at nogle gener af microglia vil blive moduleret af disse hæmmere, hvilket kan begrænse udnyttelsen af disse hæmmere til fremtidigt arbejde24. Brug af det specialiserede dissociatorinstrument efter tilsætning af enzymblanding 1 og enzymblanding 2 til vævsdissociation kan også begrænse transkriptionsresponser i protokoltrin 323.
Denne protokol har nogle begrænsninger. Renheden af microglia er kun ca. 85% i protokollen, som ikke udgør mere end 90% af alle enkeltceller svarende til anden litteratur19,22. Udskiftningen af LS-kolonnen med MS-kolonnen, fraværet af filtre og kvaliteten af mikroperler kan være de potentielle årsager. Hvis renheden af den isolerede mikroglia ikke opfylder kravene, vil forlængelse af den magnetiske inkubationstid eller passage af de sorterede celler gennem en anden magnetisk søjle forbedre renheden (supplerende figur S1). Hvis antallet af celler er lavt, skal væv høstes fra flere mus og celletab på grund af skødesløs aspiration undgås. Hvis cellens levedygtighed er lav, kan udskiftning af PBS i belastningsbufferen med RPMI 1640-medium forbedre cellens levedygtighed betydeligt. Det er også gavnligt for cellens levedygtighed at sikre, at alle de løsninger, der anvendes i protokollen, er friske, og protokollen afsluttes så hurtigt som muligt. Det er vigtigt for brugerne at afbalancere renheden og antallet af mikroglia opnået ved hjælp af denne protokol.
Protokollen udnytter bindingen af microglia med CD11b-perler og berigelsen i et magnetfelt til at rense mikroglia. Derfor indeholder renset mikroglia forurening af myeloide celler, hvilket er uundgåeligt i denne protokol. I modsætning til FACS - guldstandarden for sortering af celler - er renheden af mikroglia isoleret af MACS ikke tilstrækkelig høj til nogle udførlige anvendelser såsom dyb sekventering, hvilket begrænser dens udbredte anvendelse. Derudover kan FACS til sortering af microglia eliminere forurening af myeloide celler. MACS er imidlertid en blidere metode, bevarer mere originale morfologiske egenskaber ved gliaceller, især astrocytter, tager mindre tid til isolering af mikroglia og har et højere celleudbytte end FACS, hvilket tyder på, at det kan reducere antallet af mus, der skal ofres, og kan være mere egnet til tidsfølsomme eksperimenter19,25 . I mellemtiden er MACS mere omkostningseffektiv og bredt tilgængelig og har lavere tekniske krav til eksperimenter. MACS har vist sig at være den mest pålidelige og konsistente metode til at isolere microglia. Morfologisk analyse viste, at mikroglia ikke ville blive aktiveret af MACS, og RNA-seq har vist, at mikroglia isoleret ved denne metode opretholder en hviletilstand19,26.
Samlet set er protokollen vigtig for undersøgelsen af mikroglia i demyeliniserende sygdomme, og mikroglia isoleret af denne protokol kan anvendes til forskellige downstream-applikationer såsom kvantitativ RT-PCR og RNA-seq. Protokollen bruger neutralt rødt farvestof til at lokalisere demyeliniserende læsioner, hvilket sikrer nøjagtigheden af læsionssteder og reducerer enhver forvirring med normalt væv under prøveudtagning. Nøjagtig lokalisering af læsioner kan hjælpe med at fokusere på virkningerne af sygdomme og studere den unikke molekylære fænotype og funktionelle egenskaber ved microglia i demyeliniserende sygdomme. Dette vil danne grundlag for at studere mekanismen for mikroglia i demyeliniserende sygdomme. Denne metode til isolering af mikroglia ved hjælp af magnetiske CD11b-perler kan rense microglia med høj cellelevedygtighed og udbytte på kort tid med minimale krav til eksperimentelle forhold, hvilket muliggør udbredt anvendelse til at studere microglia under forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
