Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения и очистки первичной микроглии на животных моделях демиелинизирующих заболеваний с использованием столбчатой магнитно-активированной сортировки клеток.
Abstract
Микроглия, резидентные врожденные иммунные клетки в мозге, являются основными ответчиками на воспаление или травму в центральной нервной системе (ЦНС). Микроглия может быть разделена на состояние покоя и активированное состояние и может быстро менять состояние в ответ на микроокружение мозга. Микроглия будет активироваться при разных патологических состояниях и проявлять разные фенотипы. Кроме того, существует множество различных подгрупп активированной микроглии и большая неоднородность между различными подгруппами. Гетерогенность в основном зависит от молекулярной специфичности микроглии. Исследования выявили, что микроглия будет активироваться и играть важную роль в патологическом процессе воспалительной демиелинизации. Чтобы лучше понять характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз и расстройство зрительного спектра нейромиелита, мы предлагаем протокол перилезной первичной сортировки микроглии. Этот протокол использует столбчатую магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) для получения высокоочищенной первичной микроглии и сохранения молекулярных характеристик микроглии для исследования потенциальных эффектов микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях.
Introduction
Микроглии происходят из желточно-мешочных прародителей, которые достигают эмбрионального мозга очень рано и участвуют в развитии ЦНС 1,2. Например, они участвуют в синаптической обрезке3 и регуляции роста аксонов4. Они выделяют факторы, которые способствуют выживанию нейронов и помогают локализации нейронов5. В то же время они участвуют в удалении аномальных клеток и апоптотических клеток для обеспечения нормального развития мозга6. Кроме того, как иммунокомпетентные клетки мозга, микроглия постоянно наблюдает за паренхимой мозга, чтобы очистить мертвые клетки, дисфункциональные синапсы и клеточный мусор7. Было продемонстрировано, что активация микроглии играет важную роль при различных заболеваниях, включая воспалительные демиелинизирующие заболевания, нейродегенеративные заболевания и опухоли головного мозга. Активированные микроглии при рассеянном склерозе (РС) способствуют дифференцировке клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) и регенерации миелина путем поглощения миелиновых остатков8.
При болезни Альцгеймера (БА) накопление бета-амилоида (Aβ) активирует микроглию, которая влияет на фагоцитарные и воспалительные функции микроглии9. Активированная микроглия в ткани глиомы, называемая глиома-ассоциированной микроглией (GAM), может регулировать прогрессирование глиомы и в конечном итоге влиять на прогноз пациентов10. Активация глубоко изменяет транскриптом микроглии, что приводит к морфологическим изменениям, экспрессии иммунных рецепторов, повышению фагоцитарной активности и усилению секреции цитокинов11. Существуют различные подмножества активированной микроглии при нейродегенеративных заболеваниях, таких как ассоциированная с заболеванием микроглия (DAM), микроглия с активированным ответом (ARM) и микроглиальный нейродегенеративный фенотип (MGnD)8.
Аналогичным образом, множественные динамические функциональные подмножества микроглии также сосуществуют в головном мозге при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях12. Понимание неоднородности между различными подмножествами микроглии имеет важное значение для исследования патогенеза воспалительных демиелинизирующих заболеваний и поиска их потенциальных терапевтических стратегий. Гетерогенность микроглии в основном зависит от молекулярной специфичности8. Важно точно описать молекулярные изменения микроглии для изучения неоднородности. Достижения в технологии одноклеточного РНК-секвенирования (RNA-seq) позволили идентифицировать молекулярные характеристики активированной микроглии в патологических состояниях13. Поэтому способность изолировать клеточные популяции имеет решающее значение для дальнейшего исследования этих клеток-мишеней в определенных условиях.
Исследования, проводимые для понимания характеристик и функций микроглии, обычно являются исследованиями in vitro, поскольку было обнаружено, что большое количество первичной микроглии может быть получено и культивировано из мозга щенка мыши (1-3 дня), которые прикрепляются к колбам культуры и растут на пластиковой поверхности с другими смешанными глиальными клетками. Впоследствии чистую микроглию можно выделить на основе различной адгезивности смешанных глиальных клеток14,15. Однако этот метод позволяет изолировать микроглию только от перинатального мозга и занимает несколько недель. Потенциальные переменные в клеточной культуре могут влиять на характеристики микроглии, такие как молекулярная экспрессия16. Более того, микроглия, выделенная этими методами, может участвовать в экспериментах in vitro только путем моделирования состояний заболеваний ЦНС и не может представлять характеристики и функции микроглии в болезненных состояниях in vivo. Поэтому необходимо разработать методы выделения микроглии из мозга взрослой мыши.
Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) и магнитная сепарация являются двумя широко используемыми методами, хотя они имеют свои собственные различные ограничения 16,17,18,19. Их соответствующие преимущества и недостатки будут противопоставлены в разделе обсуждения. Созревание технологии MACS дает возможность быстрой очистки клеток. Huang et al. разработали удобный метод маркировки демиелинизирующих поражений в мозге20. Объединив эти два технических подхода, мы предлагаем быстрый и эффективный столбчатый протокол магнитного разделения CD11b, обеспечивающий пошаговое описание для выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений в мозге взрослых мышей и сохранения молекулярных характеристик микроглии. Очаговые демиелинизирующие поражения были вызваны стереотаксическим введением 2 мкл раствора лизолецитина (1% LPC в 0,9% NaCl) в мозолистое тело за 3 дня до начала протокола21. Этот протокол закладывает основу для выполнения следующего шага в экспериментах in vitro. Более того, этот протокол экономит время и остается осуществимым для широкого использования в различных экспериментах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай.
1. Материалы
- Подготовьте следующие решения перед началом протокола.
- Подготовьте нагрузочный буфер, добавив фетальную бычью сыворотку (FBS, 2%) в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
- Добавьте нейтральный красный (NR) краситель (последний 1%) в PBS.
- Подготовьте следующие решения, используя коммерчески доступный комплект для диссоциации мозга взрослых (см. Таблицу материалов).
- Для приготовления ферментной смеси 1 пипетки 1,9 мл буфера Z и 50 мкл фермента Р в 15 мл центрифужной трубки.
- Для приготовления ферментной смеси 2 пипетки 20 мкл буфера Y и 10 мкл фермента А в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Подготовьте раствор для удаления мусора.
2. Перфузия и рассечение мышей
- Внутрибрюшинно (т..) вводят мышам 500 мкл 1% NR красителя в PBS за 2-3 ч до анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинная инъекция NR в моделях демиелинизирующих мышей помогает различать поражения (рисунок 1). - Обезболить мышь пентобарбиталом (50 мг/кг, т..) и убедиться, что мышь успешно обезболена, изучив болевые реакции.
- Откройте грудную полость мыши и обнажите сердце.
- Аккуратно отрежьте небольшой уголок правого предсердия и внутрисердечно перфьминируйте мышь 20-30 мл холодного PBS из левого желудочка.
- Обезглавить мышь под наркозом.
- Откройте череп мыши и осторожно освободите мозг от черепа.
- Перенесите мозг мышиному мозгу и разрежьте мозг на кусочки по 0,1 см.
- Снимите кусочки мозга и поместите их в холодный PBS в чашку Петри (60/15 мм). Микрорассекция поражений, помеченных красителем NR вокруг мозолистого тела под стереомикроскопом с помощью микрохирургических щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рассеченная ткань является как можно более полной, чтобы облегчить последующий перенос; общий прогресс вскрытия должен быть завершен в течение 2 ч. - Переложите рассеченную ткань на 15 мл центрифужных трубок, содержащих соответствующее количество буфера холодной нагрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объедините ткань мозолистого тела 2-3 мышей вместе в одной пробирке в виде одного образца.
3. Диссоциация тканей
- Центрифугируйте рассеченную ткань на 300 ×g в течение 30 с (после достижения этой скорости), чтобы собрать образец на дне пробирки.
- Разогреть ферментную смесь 1 и ферментную смесь от 2 до 37 °C в инкубаторе.
- Добавьте 1 950 мкл предварительно нагретой ферментной смеси 1 к одному образцу и переварите в инкубаторе при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 30 мкл предварительно нагретой ферментной смеси 2 и аккуратно перемешайте.
- Переварить в инкубаторе при 37 °C в течение 15 мин и осторожно перемешивать каждые 5 мин.
- Добавьте 4 мл холодного PBS в пробирку после переваривания и аккуратно встряхните.
- Поместите фильтры размером 70 мкм на центрифужные трубки объемом 50 мл и дополните фильтры 500 мкл холодного PBS. Отфильтруйте диссоциированную ткань, пропуская образцы переваренной ткани через фильтры, и перенесите отфильтрованную суспензию в 50 мл центрифужной трубки в центрифужную трубку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг, если количество ткани слишком мало. - Центрифугируйте отфильтрованные образцы тканей при 300 ×g в течение 10 мин при 4 °C и медленно и полностью аспирируйте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться на льду, за исключением ферментативного пищеварения.
4. Удаление мусора
- Осторожно повторно суспендируйте гранулу ячейки с 1,550 мкл холодного PBS.
- Добавить 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и хорошо перемешать.
- Наложите вышеуказанную смесь очень медленно и осторожно с 2 х 1 мл холодного PBS, используя пипетку 1000 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните трубку центрифуги на 45° и медленно добавьте PBS вдоль стенки трубки с пипеткой. - Медленно и осторожно переложите трубку в центрифугу и открутите при 4 °C и 3000 × g в течение 10 мин.
- Ищите три слоя после центрифугирования. Полностью аспирируйте два верхних слоя с помощью пипетки объемом 1000 мкл (рисунок 2).
- Заполните трубку до 5 мл буфером холодной загрузки и аккуратно переверните трубку три раза.
- Центрифуга при 4 °C и 1000 × г в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант полностью и избегайте разрушения клеточной гранулы.
5. Магнитное разделение клеток микроглии
- Повторно суспендируйте ячейку гранулы с 90 мкл нагрузочного буфера и добавьте 10 мкл ШАРИКОВ CD11b (Microglia).
- Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
- Добавьте 1 мл загрузочного буфера и пипетку жидкости осторожно вверх и вниз с пипеткой 1000 мкл для промывки клеток после инкубации. Центрифугируют ячейки при 4 °C и 300 × г в течение 10 мин и полностью аспирируют супернатант, чтобы удалить несвязанные шарики.
- Повторное суспендирование клеток в 500 мкл нагрузочного буфера.
- Поместите столбец MS с его разделителем для положительного отбора в магнитном поле.
- Промыть колонну 500 мкл загрузочного буфера для защиты ячеек и обеспечения эффективности магнитной сортировки на основе протокола производителя.
- Нанесите суспензию ячейки на столбец MS и отбросьте прохождение, содержащее немаркированные ячейки.
- Добавьте 500 мкл загрузочного буфера в колонну три раза, чтобы смыть ячейки, которые прилипают к стенке колонны, и отбросить прохождение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте новый загрузочный буфер для промывки только тогда, когда резервуар колонны полностью пуст. - Извлеките колонну из сепаратора после промывки колонны и поместите ее на центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Добавьте 1 мл загрузочного буфера в колонну и отодвиньте плунжер в нижнюю часть колонны, чтобы смыть магнитно меченые ячейки. Повторите этот шаг три раза, чтобы полностью собрать магнитно меченые клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микроглия, выделенная с использованием шариков CD11b, имеет высокую чистоту
Микроглиальные клетки вокруг поражений в моделях демиелинизации мышей были выделены с использованием вышеупомянутого протокола и протестированы с помощью проточной цитометрии. Клетки флуоресцентно маркируются CD11b-флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) и CD45-аллофикоцианином (APC) для определения микроглии в проточной цитометрии в соответствии с инструкциями производителя. Существует множество литератур, демонстрирующих, что антител CD11b и CD45 достаточно, чтобы проверить чистоту изолированной микроглии19,22. Флуоресцентная компенсация была завершена на проточном цитометре с использованием неокрашенных и одноокрашенных контрольных образцов. Ячейки были закрыты высотой прямого рассеяния (FSC-H) и высотой бокового рассеяния (SSC-H); одиночные ячейки были закрыты прямой зоной рассеяния (FSC-A) и FSC-H. Пропорции микроглии (идентифицированной как CD11b + CD45Intermediate) до и после магнитного разделения были проверены с помощью проточной цитометрии. Метод обратного контура был использован для корректировки стратегии измерения проточной цитометрии путем определения затвора для микроглии. По сравнению с примерно 3 × 104 клетками и 6 × 103 микроглиями до магнитного разделения мозга каждой мыши (рисунок 3A), MACS обычно дает приблизительно 2,5 × 103 клеток и 2 × 103 микроглии на мозг мыши (рисунок 3B), что составляло примерно 85% всех одиночных клеток. Тем не менее, почти 3% миелоидных клеток (идентифицированных как CD11b + CD45с высоким содержанием) присутствовали в клетках, разделенных MACS, и их было трудно удалить из популяции CD11b в этом протоколе. Чистота выделенной микроглии может быть увеличена до 95% с помощью двух магнитных колонок (дополнительный рисунок S1). Сортировка MACS может захватить примерно 33% микроглии в образце смеси мозга.
Микроглия, выделенная с помощью шариков CD11b, обладает высокой жизнеспособностью клеток
Фторхром 7-аминоактиномицин D (7-AAD) часто используется для демонстрации жизнеспособности клеток в проточной цитометрии. Клетки 7-AAD+ представляют собой мертвые клетки19. Жизнеспособность MACS-разделенной микроглии составляла примерно 95% при окрашивании клеток 7-AAD (рисунок 4).
Морфологический анализ микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, отсортированных по MACS
Морфологический анализ показал, что микроглия не активировалась MACS. Микроглии демонстрируют типичное продольное биполярное клеточное тело после MACS, которое похоже на морфологию микроглии после FACS19. Микроглия вокруг демиелинизирующих поражений будет активирована в модели LPC-индуцированной демиелинизации21. Микроглия, окрашенная ионизированной молекулой адаптера 1 связывания кальция (Iba-1), показала типичную амебную морфологию активированной микроглии в этом протоколе. P2ry12 является типичной молекулой микроглиального состояния покоя. Существует небольшая доля разветвленной и P2ry12+ микроглии перед MACS из-за расширения степени диссоциированных поражений. Однако существование микроглии P2ry12+ после MACS также указывает на то, что MACS не активирует микроглию (дополнительный рисунок S2).
Рисунок 1: Изображения очаговых демиелинизирующих поражений, помеченных нейтральным красным красителем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения трех слоев, образованных центрифугированием. Два верхних слоя (слой 1 + слой 2) должны быть удалены в процессе удаления мусора (см. шаг протокола 4.5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ проточной цитометрии микроглии, выделенной из демиелинизирующих поражений взрослых мышей до и после MACS. (A) Схематическое представление стратегии гатинга, используемой в анализе проточной цитометрии до MACS: FSC-H и SSC-H для отбора клеток, FSC-A и FSC-H для выбора отдельных клеток, а также CD11b-FITC и CD45-APC для выбора миелоидных клеток (вверх) и микроглии (вниз). (B) Схематическое представление стратегии гатирования, используемой в пробе анализа проточной цитометрии после MACS. Доля микроглии значительно возросла после MACS: FSC-H и SSC-H для выбора клеток, FSC-A и FSC-H для выбора отдельных клеток и CD11b-FITC и CD45-APC для выбора миелоидных клеток (вверх) и микроглии (вниз). Сокращения: SSC-H = высота бокового рассеяния; FSC-H = прямая высота рассеяния; FSC-A = прямая площадь рассеяния; CD45-APC = аллофикоцианин-меченый CD45; CD11b-FITC = флуоресцеин, меченый изотиоцианатом CD11b; MACS = сортировка ячеек с магнитной активацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стратегия измерения FACS для живых/мертвых одиночных клеток после MACS. 7-AAD и SSC-H для отбора живых клеток после MACS. Сокращения: SSC-H = высота бокового рассеяния; 7-ААД = 7-аминоактиномицин D; MACS = магнитно-активированная сортировка ячеек; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Анализ проточной цитометрии микроглии, выделенной у взрослых мышей с демиелинизацией. (A) Схематическое представление стратегии гатирования, используемой в пробе анализа проточной цитометрии перед MACS. (B) Схематическое изображение стратегии гастинга, используемой при анализе проточной цитометрии образца после MACS с использованием двух магнитных колонок. (C) Однопараметрическая гистограмма CD11b-FITC и CD45-APC при проточной цитометрии после MACS с использованием двух магнитных колонок. Сокращения: SSC-H = высота бокового рассеяния; FSC-H = прямая высота рассеяния; FSC-A = прямая площадь рассеяния; CD45-APC = аллофикоцианин-меченый CD45; CD11b-FITC = флуоресцеин, меченый изотиоцианатом CD11b; MACS = магнитно-активированная сортировка ячеек; CD45Int = промежуточное выражение CD45. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Иммунофлуоресцентное окрашивание микроглии Iba-1 и P2ry12 до и после MACS. (A) Изображения микроглии перед MACS. (B) Изображения изолированной микроглии после MACS. Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: MACS = магнитно-активированная сортировка ячеек; Iba-1 = ионизированная молекула-адаптор, связывающая кальций 1; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол предлагает метод выделения микроглии вокруг демиелинизирующих поражений, который может помочь изучить функциональные характеристики микроглии при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях. Микроглия, отловленная с помощью шариков CD11b, отличается высокой чистотой и жизнеспособностью. Критические шаги в протоколе включают точную локализацию очагов и оптимальную очистку микроглии. На этапе протокола 2.1 необходимо ввести раствор NR за 2 ч до принесения в жертву мыши, чтобы убедиться, что повреждения могут быть точно отображены20. На этапе протокола 2.8 была предпринята осторожность, чтобы поместить участки мозговой ткани на ледяной ящик для рассечения и завершить этот этап как можно скорее, тем самым улучшая жизнеспособность клеток. На этапе 2.9 необходимо выбрать подходящую ткань в качестве одного образца как для переваривания ферментов, так и для удаления мусора. Этап 3.7 нельзя пропустить, если эффект удаления мусора не является удовлетворительным. На этапе 4.3 добавление PBS должно быть мягким для формирования различных слоев, гарантируя, что удаляется как можно больше мусора. Все этапы протокола, кроме ферментативного пищеварения, должны выполняться на льду для обеспечения жизнеспособности клеток и снижения транскрипционного ответа микроглии. Каждый шаг в протоколе мягкий и сохраняет высокую жизнеспособность, поэтому нет необходимости использовать раствор для удаления мертвых клеток22,23.
Метод ферментативной диссоциации мозга мыши в протоколе оказался подходящим для одноклеточной РНК-seq23. Хотя ферменты в протоколе мягкие, Marsh et al. обнаружили, что различные протоколы ферментативного гидролиза при 37 °C могут значительно изменять транскриптом микроглии24. Установка здорового контроля в эксперименте для сравнения может помочь идентифицировать дифференциально экспрессированные гены демиелинизации, тем самым устраняя аномальный транскрипционный ответ в протоколе. Между тем, чтобы предотвратить это аномальное транскрипционное состояние после ферментативного пищеварения, протокол может быть оптимизирован путем добавления различных ингибиторов транскрипции и трансляции, таких как актиномицин D, триптолид и анизомицин на разных этапах. Использование этих ингибиторов может выявить реальную экспрессию генов микроглии in vivo без установки контроля. Таким образом, добавление этих ингибиторов в протокол может уменьшить количество животных или образцов, необходимых в эксперименте, и является более экономичным для последующего анализа. Однако следует отметить, что некоторые гены микроглии будут модулироваться этими ингибиторами, что может ограничить использование этих ингибиторов для будущей работы24. Использование специализированного инструмента диссоциатора после добавления ферментной смеси 1 и ферментной смеси 2 для диссоциации тканей может также ограничить транскрипционные реакции на этапе 323 протокола.
Этот протокол имеет некоторые ограничения. Чистота микроглии составляет всего приблизительно 85% в протоколе, который не может составлять более 90% всех одиночных клеток, аналогичных другим литературнымисточникам 19,22. Замена колонки LS на колонку MS, отсутствие фильтров и качество микрогранул могут быть потенциальными причинами. Если чистота изолированной микроглии не соответствует требованиям, продление времени магнитной инкубации или прохождение отсортированных клеток через второй магнитный столб улучшит чистоту (дополнительный рисунок S1). Если количество клеток низкое, ткань должна быть собрана у большего количества мышей и потеря клеток из-за небрежной аспирации избегается. Если жизнеспособность ячейки низкая, замена PBS в буфере нагрузки средой RPMI 1640 может значительно улучшить жизнеспособность клетки. Также полезно для жизнеспособности клеток гарантировать, что все решения, используемые в протоколе, являются свежими, и протокол завершается как можно скорее. Пользователям важно сбалансировать чистоту и количество микроглии, полученных с помощью этого протокола.
Протокол использует связывание микроглии с ШАРИКАМИ CD11b и обогащение в магнитном поле для очистки микроглии. Поэтому очищенные микроглии содержат загрязнение миелоидными клетками, что неизбежно в этом протоколе. В отличие от FACS - золотого стандарта для сортировки клеток - чистота микроглии, выделенной MACS, недостаточно высока для некоторых сложных приложений, таких как глубокое секвенирование, что ограничивает его широкое использование. Кроме того, FACS для сортировки микроглии может устранить загрязнение миелоидных клеток. Тем не менее, MACS является более мягким методом, сохраняет более оригинальные морфологические характеристики глиальных клеток, особенно астроцитов, занимает меньше времени для выделения микроглии и имеет более высокий выход клеток, чем FACS, предполагая, что он может уменьшить количество мышей, подлежащих жертвоприношению, и может быть более подходящим для чувствительных ко времени экспериментов19,25 . Между тем, MACS является более экономичным и широко доступным и имеет более низкие технические требования к экспериментаторам. MACS зарекомендовал себя как наиболее надежный и последовательный метод выделения микроглии. Морфологический анализ показал, что микроглия не будет активирована MACS, а RNA-seq показала, что микроглия, выделенная этим методом, сохраняет состояние покоя19,26.
В целом, протокол важен для обследования микроглии при демиелинизирующих заболеваниях, и микроглия, выделенная этим протоколом, может быть использована для различных последующих применений, таких как количественная ОТ-ПЦР и РНК-сек. Протокол использует нейтральный красный краситель для обнаружения демиелинизирующих поражений, что обеспечивает точность мест поражения и уменьшает любую путаницу с нормальной тканью во время отбора проб. Точная локализация поражений может помочь сосредоточиться на последствиях заболеваний и изучить уникальный молекулярный фенотип и функциональные характеристики микроглии при демиелинизирующих заболеваниях. Это послужит основой для изучения механизма микроглии при демиелинизирующих заболеваниях. Этот метод выделения микроглии с помощью магнитных ШАРИКОВ CD11b позволяет очищать микроглию с высокой жизнеспособностью клеток и выходом за короткое время, с минимальными требованиями к экспериментальным условиям, что позволяет широко использовать микроглию для изучения микроглии в различных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.
Acknowledgments
Исследование было поддержано Фондом выдающихся молодых ученых больницы Тунцзи (HUST) (грант No 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
