Summary
Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.
Abstract
Le microglia, le cellule immunitarie innate residenti nel cervello, sono i principali rispondenti all'infiammazione o alle lesioni nel sistema nervoso centrale (SNC). La microglia può essere suddivisa in stato di riposo e stato attivato e può cambiare rapidamente stato in risposta al microambiente del cervello. Le microglia saranno attivate in diverse condizioni patologiche e presenteranno fenotipi diversi. Inoltre, ci sono molti sottogruppi diversi di microglia attivate e una grande eterogeneità tra diversi sottogruppi. L'eterogeneità dipende principalmente dalla specificità molecolare della microglia. Gli studi hanno rivelato che la microglia sarà attivata e svolgerà un ruolo importante nel processo patologico di demielinizzazione infiammatoria. Per comprendere meglio le caratteristiche della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti come la sclerosi multipla e il disturbo dello spettro della neuromielite ottica, proponiamo un protocollo di smistamento microgliale primario perilesionale. Questo protocollo utilizza il cartomanziamento cellulare attivato magneticamente colonnare (MACS) per ottenere microglia primarie altamente purificate e preservare le caratteristiche molecolari della microglia per studiare i potenziali effetti della microglia nelle malattie demielinizzanti infiammatorie.
Introduction
Le microglia provengono da progenitori del sacco vitellino, che raggiungono il cervello embrionale molto presto e partecipano allo sviluppo del SNC 1,2. Ad esempio, sono coinvolti nella potatura sinaptica3 e nella regolazione della crescita assonale4. Secernono fattori che promuovono la sopravvivenza neuronale e aiutano la localizzazione neuronale5. Allo stesso tempo, sono coinvolti nella rimozione di cellule anormali e cellule apoptotiche per garantire il normale sviluppo del cervello6. Inoltre, come cellule immuno-competenti del cervello, le microglia sorvegliano continuamente il parenchima cerebrale per eliminare le cellule morte, le sinapsi disfunzionali e i detriti cellulari7. È stato dimostrato che l'attivazione microgliale svolge un ruolo importante in una varietà di malattie, tra cui malattie infiammatorie demielinizzanti, malattie neurodegenerative e tumori cerebrali. Le microglia attivate nella sclerosi multipla (SM) contribuiscono alla differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) e alla rigenerazione della mielina inghiottendo i detritimielinici 8.
Nella malattia di Alzheimer (AD), l'accumulo di amiloide-beta (Aβ) attiva la microglia, che colpisce le funzioni fagocitiche e infiammatorie della microglia9. La microglia attivata nel tessuto del glioma, chiamata microglia associata al glioma (GAM), può regolare la progressione del glioma e, infine, influenzare la prognosi dei pazienti10. L'attivazione altera profondamente il trascrittoma microgliale, con conseguenti cambiamenti morfologici, espressione dei recettori immunitari, aumento dell'attività fagocitica e aumento della secrezione di citochine11. Esistono diversi sottoinsiemi di microglia attivate nelle malattie neurodegenerative come la microglia associata alla malattia (DAM), la microglia a risposta attivata (ARM) e il fenotipo neurodegenerativo microgliale (MGnD)8.
Allo stesso modo, più sottoinsiemi funzionali dinamici di microglia coesistono anche nel cervello nelle malattie infiammatorie demielinizzanti12. Comprendere l'eterogeneità tra diversi sottoinsiemi di microglia è essenziale per studiare la patogenesi delle malattie demielinizzanti infiammatorie e per trovare le loro potenziali strategie terapeutiche. L'eterogeneità della microglia dipende principalmente dalla specificità molecolare8. È essenziale descrivere accuratamente le alterazioni molecolari della microglia per lo studio dell'eterogeneità. I progressi nella tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (RNA-seq) hanno permesso l'identificazione delle caratteristiche molecolari della microglia attivata in condizioni patologiche13. Pertanto, la capacità di isolare le popolazioni cellulari è fondamentale per ulteriori indagini su queste cellule bersaglio in condizioni specifiche.
Gli studi condotti per comprendere le caratteristiche e le funzioni della microglia sono di solito studi in vitro, poiché è stato riscontrato che un gran numero di microglia primarie possono essere preparate e coltivate dal cervello del cucciolo di topo (1-3 giorni), che si attaccano ai palloni di coltura e crescono sulla superficie plastica con altre cellule gliali miste. Successivamente, la microglia pura può essere isolata in base alla diversa adesività delle cellule gliali miste14,15. Tuttavia, questo metodo può solo isolare la microglia dal cervello perinatale e richiede diverse settimane. Le potenziali variabili in coltura cellulare possono influenzare le caratteristiche microgliali come l'espressione molecolare16. Inoltre, le microglia isolate con questi metodi possono partecipare solo a esperimenti in vitro simulando le condizioni delle malattie del SNC e non possono rappresentare le caratteristiche e le funzioni della microglia negli stati di malattia in vivo. Pertanto, è necessario sviluppare metodi per isolare la microglia dal cervello del topo adulto.
Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e la separazione magnetica sono due metodi ampiamente utilizzati, sebbene abbiano i loro diversi limiti 16,17,18,19. I loro rispettivi vantaggi e svantaggi saranno contrastati nella sezione di discussione. La maturazione della tecnologia MACS offre la possibilità di purificare rapidamente le cellule. Huang et al. hanno sviluppato un metodo conveniente per etichettare le lesioni demielinizzanti nel cervello20. Combinando questi due approcci tecnici, proponiamo un protocollo di separazione magnetica CD11b colonnare rapido ed efficiente, fornendo una descrizione passo-passo per isolare la microglia attorno a lesioni demielinizzanti nel cervello di topo adulto e preservare le caratteristiche molecolari della microglia. Le lesioni demielinizzanti focali sono state causate dall'iniezione stereotassica di 2 μL di soluzione di lisolecitina (1% LPC in 0,9% NaCl) nel corpo calloso 3 giorni prima di iniziare il protocollo21. Questo protocollo pone le basi per eseguire il passo successivo in esperimenti in vitro. Inoltre, questo protocollo consente di risparmiare tempo e rimane fattibile per un uso diffuso in vari esperimenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina.
1. Materiali
- Preparare le soluzioni seguenti prima di iniziare il protocollo.
- Preparare il tampone di carico aggiungendo siero bovino fetale (FBS, 2%) alla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Aggiungere colorante rosso neutro (NR) (finale 1%) al PBS.
- Preparare le seguenti soluzioni utilizzando il kit di dissociazione del cervello adulto disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
- Per preparare la miscela enzimatica 1, pipettare 1,9 mL di Tampone Z e 50 μL di Enzima P in un tubo centrifuga da 15 mL.
- Per preparare la miscela enzimatica 2, pipettare 20 μL di Tampone Y e 10 μL di Enzima A in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
- Preparare la soluzione di rimozione dei detriti.
2. Perfusione e dissezione dei topi
- Iniettare per via intraperitoneale (i.p.) nel topo 500 μL di colorante NR all'1% in PBS 2-3 ore prima dell'anestesia.
NOTA: L'iniezione intraperitoneale di NR in modelli murini demielinizzanti aiuta a discernere le lesioni (Figura 1). - Anestetizzare il topo con pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) e assicurarsi che il topo sia anestetizzato con successo esaminando le risposte al dolore.
- Aprire la cavità toracica del topo ed esporre il cuore.
- Tagliare con cura un piccolo angolo dell'atrio destro e perfondere intracardialmente il mouse con 20-30 ml di PBS freddo dal ventricolo sinistro.
- Decapitare il topo in anestesia.
- Apri il cranio del topo e libera con cura il cervello dal cranio.
- Trasferire il cervello alla muffa della fetta di cervello del topo e tagliare il cervello in fette di 0,1 cm.
- Rimuovere le fette di cervello e metterle in PBS freddo in una capsula di Petri (60/15 mm). Microdissettare le lesioni marcate dal colorante NR intorno al corpo calloso sotto uno stereomicroscopio usando una pinza microchirurgica.
NOTA: Assicurarsi che il tessuto sezionato sia il più completo possibile per facilitare il successivo trasferimento; il progresso totale della dissezione dovrebbe essere completato in 2 ore. - Trasferire il tessuto sezionato in tubi centrifughi da 15 ml contenenti la quantità appropriata di tampone di carico a freddo.
NOTA: Raggruppare il tessuto del corpo calloso da 2-3 topi insieme in una provetta come un campione.
3. Dissociazione dei tessuti
- Centrifugare il tessuto sezionato a 300 ×g per 30 s (dopo aver raggiunto questa velocità) per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
- Preriscaldare la miscela enzimatica 1 e la miscela enzimatica da 2 a 37 °C in un incubatore.
- Aggiungere 1.950 μL di miscela enzimatica preriscaldata da 1 a un campione e digerire in un incubatore a 37 °C per 5 minuti.
- Aggiungere 30 μL di miscela enzimatica preriscaldata 2 e mescolare delicatamente.
- Digerire in un incubatore a 37 °C per 15 minuti e mescolare delicatamente ogni 5 minuti.
- Aggiungere 4 ml di PBS freddo al tubo dopo la digestione e agitare delicatamente.
- Posizionare filtri da 70 μm su tubi centrifuga da 50 mL e preincidere i filtri con 500 μL di PBS freddo. Filtrare il tessuto dissociato facendo passare i campioni di tessuto digerito attraverso i filtri e trasferire la sospensione filtrata nel tubo della centrifuga da 50 ml in un tubo della centrifuga da 15 ml.
NOTA: saltare questo passaggio se la quantità di tessuto è troppo piccola. - Centrifugare i campioni di tessuto filtrato a 300 ×g per 10 min a 4 °C e aspirare il surnatante lentamente e completamente.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio ad eccezione della digestione enzimatica.
4. Rimozione dei detriti
- Risospendare delicatamente il pellet cellulare con 1.550 μL di PBS freddo.
- Aggiungere 450 μL di soluzione fredda per la rimozione dei detriti e mescolare bene.
- Sovrapporre la miscela di cui sopra molto lentamente e delicatamente con 2 x 1 mL di PBS freddo usando una pipetta da 1.000 μL.
NOTA: Inclinare il tubo della centrifuga di 45 ° e aggiungere lentamente PBS lungo la parete del tubo con la pipetta. - Trasferire il tubo lentamente e delicatamente in una centrifuga e ruotare a 4 °C e 3.000 × g per 10 minuti.
- Cerca tre strati dopo la centrifugazione. Aspirare completamente i due strati superiori utilizzando una pipetta da 1.000 μL (Figura 2).
- Riempire il tubo fino a 5 ml con tampone di carico a freddo e capovolgere delicatamente il tubo tre volte.
- Centrifugare a 4 °C e 1.000 × g per 10 min. Aspirare completamente il surnatante ed evitare di interrompere il pellet cellulare.
5. Separazione magnetica delle cellule microgliali
- Risospesciare il pellet cellulare con 90 μL di tampone di carico e aggiungere 10 μL di perline CD11b (Microglia).
- Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 1 mL di tampone di carico e pipettare delicatamente il liquido su e giù con una pipetta da 1.000 μL per lavare le cellule dopo l'incubazione. Centrifugare le celle a 4 °C e 300 × g per 10 minuti e aspirare completamente il surnatante per rimuovere le perle non legate.
- Risospesciare le celle in 500 μL di buffer di carico.
- Posizionare la colonna MS con il relativo separatore per la selezione positiva nel campo magnetico.
- Risciacquare la colonna con 500 μL di tampone di carico per proteggere le celle e garantire l'efficienza della selezione magnetica basata sul protocollo del produttore.
- Applicare la sospensione di cella sulla colonna MS ed eliminare il flusso passante contenente celle senza etichetta.
- Aggiungere 500 μL di buffer di carico alla colonna tre volte per lavare via le celle che aderiscono alla parete della colonna ed eliminare il flowthrough.
NOTA: aggiungere un nuovo buffer di carico per il lavaggio solo quando il serbatoio della colonna è completamente vuoto. - Rimuovere la colonna dal separatore dopo aver lavato la colonna e posizionarla su un tubo centrifugo da 15 ml.
- Aggiungere 1 mL di buffer di carico nella colonna e spingere lo stantuffo sul fondo della colonna per scovare le celle etichettate magneticamente. Ripetere questo passaggio tre volte per raccogliere completamente le cellule etichettate magneticamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le microglia isolate con perline CD11b hanno un'elevata purezza
Le cellule microgliali intorno alle lesioni nei modelli murini di demielinizzazione sono state isolate utilizzando il protocollo sopra menzionato e testate mediante citometria a flusso. Le cellule sono etichettate fluorescentemente con ISOTIOCIANATO CD11b-Fluoresceina (FITC) e CD45-alloficocianina (APC) per determinare la microglia nella citometria a flusso secondo le istruzioni del produttore. Esistono diverse letterature che dimostrano che gli anticorpi CD11b e CD45 sono sufficienti per verificare la purezza della microgliaisolata 19,22. La compensazione della fluorescenza è stata completata sul citometro a flusso utilizzando campioni di controllo non macchiati e monomacchiati. Le celle erano chiuse da forward scatter-height (FSC-H) e side scatter-height (SSC-H); le singole celle erano chiuse da forward scatter-area (FSC-A) e FSC-H. Le proporzioni di microglia (identificate come CD11b+CD45Intermediate) prima e dopo la separazione magnetica sono state testate mediante citometria a flusso. La tecnica del back-loop è stata utilizzata per regolare la strategia di gating dell'analisi della citometria a flusso determinando il gate per la microglia. Rispetto a circa 3 × 104 cellule e 6 × 103 microglia prima della separazione magnetica di ciascun cervello di topo (Figura 3A), MACS produce generalmente circa 2,5 × 103 cellule e 2 × 103 microglia per cervello di topo (Figura 3B), che era circa l'85% di tutte le singole cellule. Tuttavia, quasi il 3% delle cellule mieloidi (identificate come CD11b + CD45alte) erano presenti nelle cellule separate da MACS ed erano difficili da rimuovere dalla popolazione CD11b in questo protocollo. La purezza della microglia isolata può essere aumentata al 95% utilizzando due colonne magnetiche (Figura supplementare S1). Lo smistamento MACS potrebbe catturare circa il 33% delle microglia nel campione di miscela cerebrale.
Le microglia isolate con perline CD11b hanno un'elevata vitalità cellulare
Il fluorocromo 7-aminoactinomicina D (7-AAD) è spesso usato per mostrare la vitalità cellulare nella citometria a flusso. Le cellule 7-AAD+ rappresentano le cellule morte19. La vitalità della microglia separata da MACS era di circa il 95% mediante colorazione cellulare con 7-AAD (Figura 4).
Analisi morfologica delle microglia intorno a lesioni demielinizzanti ordinate per MACS
L'analisi morfologica ha mostrato che le microglia non sono state attivate dal MACS. Le microglia presentano un tipico corpo cellulare bipolare longitudinale dopo MACS, che è simile alla morfologia microgliale dopo FACS19. La microglia intorno alle lesioni demielinizzanti sarà attivata nel modello di demielinizzazione indotta da LPC21. La microglia colorata dalla molecola 1 dell'adattatore legante il calcio ionizzato (Iba-1) ha mostrato la morfologia amebica tipica della microglia attivata in questo protocollo. P2ry12 è una tipica molecola dello stato di riposo microgliale. C'è una piccola frazione di microglia ramificata e P2ry12+ prima del MACS a causa dell'espansione dell'estensione delle lesioni dissociate. Tuttavia, l'esistenza di microglia P2ry12+ dopo MACS indica anche che MACS non attiverà la microglia (Figura supplementare S2).
Figura 1: Immagini delle lesioni demielinizzanti focali etichettate dal colorante rosso neutro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini dei tre strati formati dalla centrifugazione. I due strati superiori (strato 1 + strato 2) devono essere rimossi nel processo di rimozione dei detriti (vedere il passaggio 4.5 del protocollo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi citometrica a flusso di microglia isolate da lesioni demielinizzanti di topi adulti prima e dopo MACS. (A) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nell'analisi citometrica a flusso prima di MACS: FSC-H e SSC-H per la selezione delle cellule, FSC-A e FSC-H per la selezione di singole cellule e CD11b-FITC e CD45-APC per la selezione di cellule mieloidi (su) e microglia (giù). (B) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nel campione di analisi della citometria a flusso dopo MACS. La proporzione di microglia è aumentata significativamente dopo MACS: FSC-H e SSC-H per la selezione delle cellule, FSC-A e FSC-H per la selezione di singole cellule e CD11b-FITC e CD45-APC per la selezione di cellule mieloidi (su) e microglia (giù). Abbreviazioni: SSC-H = side scatter-height; FSC-H = altezza di dispersione in avanti; FSC-A = area di dispersione in avanti; CD45-APC = CD45 con etichetta allococianina; CD11b-FITC = CD11b con etichetta con isotiocianato con fluoresceina; MACS = smistamento cellulare ad attivazione magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Strategia di gating FACS per singole cellule viventi/morte dopo MACS. 7-AAD e SSC-H per la selezione di cellule viventi dopo MACS. Abbreviazioni: SSC-H = side scatter-height; 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; MACS = smistamento cellulare ad attivazione magnetica; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: Analisi citometrica a flusso di microglia isolate da topi adulti demielinizzati. (A) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nel campione di analisi della citometria a flusso prima del MACS. (B) Rappresentazione schematica della strategia di gating utilizzata nel campione di analisi della citometria a flusso dopo MACS utilizzando due colonne magnetiche. (C) Istogramma a parametro singolo di CD11b-FITC e CD45-APC in citometria a flusso dopo MACS utilizzando due colonne magnetiche. Abbreviazioni: SSC-H = side scatter-height; FSC-H = altezza di dispersione in avanti; FSC-A = area di dispersione in avanti; CD45-APC = CD45 con etichetta allococianina; CD11b-FITC = CD11b con etichetta con isotiocianato con fluoresceina; MACS = smistamento cellulare ad attivazione magnetica; CD45Int = espressione CD45 intermedia. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Colorazione a immunofluorescenza di microglia con Iba-1 e P2ry12 prima e dopo MACS. (A) Immagini di microglia prima di MACS. (B) Immagini di microglia isolate dopo MACS. Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: MACS = ordinamento cellulare ad attivazione magnetica; Iba-1 = molecola adattatrice legante calcio ionizzato 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il protocollo propone un metodo per isolare la microglia attorno alle lesioni demielinizzanti, che può aiutare a studiare le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie infiammatorie demielinizzanti. Le microglia catturate utilizzando perline CD11b mostrano un'elevata purezza e vitalità. I passaggi critici del protocollo includono la localizzazione precisa dei fuochi e la purificazione microgliale ottimale. Nella fase di protocollo 2.1, è necessario iniettare la soluzione NR 2 ore prima di sacrificare il mouse per garantire che le lesioni possano essere visualizzate con precisione20. Nella fase di protocollo 2.8, è stata prestata attenzione a posizionare le sezioni del tessuto cerebrale su una ghiacciaia per la dissezione e completare questo passaggio il prima possibile, migliorando così la vitalità cellulare. Nel passaggio 2.9, è necessario selezionare il tessuto appropriato come un campione sia per la digestione enzimatica che per la rimozione dei detriti. Il passaggio 3.7 non può essere saltato quando l'effetto della rimozione dei detriti non è soddisfacente. Nel passaggio 4.3, l'aggiunta di PBS deve essere delicata per formare strati diversi, assicurando che il maggior numero possibile di detriti venga rimosso. Tutte le fasi del protocollo, ad eccezione della digestione enzimatica, devono essere eseguite su ghiaccio per garantire la vitalità cellulare e ridurre la risposta trascrizionale della microglia. Ogni fase del protocollo è lieve e mantiene un'elevata vitalità, quindi non è necessario utilizzare la soluzione di rimozione delle cellule morte22,23.
Il metodo di dissociazione enzimatica per il cervello di topo nel protocollo si è dimostrato adatto per l'RNA-seq23 a singola cellula. Sebbene gli enzimi nel protocollo siano lievi, Marsh et al. hanno scoperto che vari protocolli di idrolisi enzimatica a 37 °C possono alterare significativamente il trascrittoma della microglia24. Impostare un controllo sano nell'esperimento per il confronto può aiutare a identificare i geni differenzialmente espressi della demielinizzazione, eliminando così la risposta trascrizionale anormale nel protocollo. Nel frattempo, oltre a questo stato trascrizionale anormale dopo la digestione enzimatica, il protocollo può essere ottimizzato aggiungendo vari inibitori della trascrizione e della traduzione come actinomicina D, triptolide e anisomicina in diversi passaggi. L'uso di questi inibitori può rivelare la reale espressione genica della microglia in vivo senza l'impostazione di un controllo. Pertanto, l'aggiunta di questi inibitori al protocollo può ridurre il numero di animali o campioni richiesti nell'esperimento ed è più economica per l'analisi a valle. Tuttavia, va notato che alcuni geni della microglia saranno modulati da questi inibitori, il che potrebbe limitare l'utilizzo di questi inibitori per il lavoro futuro24. L'uso dello strumento dissociatore specializzato dopo l'aggiunta della miscela enzimatica 1 e della miscela enzimatica 2 per la dissociazione tissutale può anche limitare le risposte trascrizionali nella fase di protocollo 323.
Questo protocollo presenta alcune limitazioni. La purezza della microglia è solo circa l'85% nel protocollo, che non riesce a comprendere più del 90% di tutte le singole cellule simili ad altre letterature19,22. La sostituzione della colonna LS con la colonna MS, l'assenza dei filtri e la qualità delle microsfere possono essere le potenziali cause. Se la purezza della microglia isolata non soddisfa i requisiti, prolungare il tempo di incubazione magnetica o far passare le cellule selezionate attraverso una seconda colonna magnetica migliorerà la purezza (Figura supplementare S1). Se il numero di cellule è basso, il tessuto deve essere raccolto da più topi e la perdita di cellule a causa dell'aspirazione incurante evitata. Se la vitalità della cella è bassa, la sostituzione del PBS nel buffer di carico con il mezzo RPMI 1640 potrebbe migliorare significativamente la vitalità della cella. È anche utile per la vitalità cellulare garantire che tutte le soluzioni utilizzate nel protocollo siano fresche e che il protocollo sia completato il prima possibile. È importante che gli utenti bilancino la purezza e il numero di microglia ottenute utilizzando questo protocollo.
Il protocollo utilizza il legame della microglia con perline CD11b e l'arricchimento in un campo magnetico per purificare la microglia. Pertanto, le microglia purificate contengono la contaminazione delle cellule mieloidi, che è inevitabile in questo protocollo. A differenza del FACS , il gold standard per la selezione delle cellule, la purezza delle microglia isolate da MACS non è sufficientemente elevata per alcune applicazioni elaborate come il sequenziamento profondo, che ne limita l'uso diffuso. Inoltre, FACS per lo smistamento delle microglia può eliminare la contaminazione delle cellule mieloidi. Tuttavia, MACS è un metodo più delicato, mantiene caratteristiche morfologiche più originali delle cellule gliali, in particolare gli astrociti, richiede meno tempo per isolare le microglia e ha una resa cellulare più elevata rispetto al FACS, suggerendo che può ridurre il numero di topi da sacrificare e può essere più adatto per esperimenti sensibili al tempo19,25 . Nel frattempo, MACS è più conveniente e ampiamente disponibile e ha requisiti tecnici inferiori per gli sperimentatori. MACS si è dimostrato il metodo più affidabile e coerente per isolare la microglia. L'analisi morfologica ha mostrato che la microglia non sarebbe attivata dal MACS e l'RNA-seq ha dimostrato che le microglia isolate con questo metodo mantengono uno stato di riposo19,26.
Nel complesso, il protocollo è importante per l'indagine della microglia nelle malattie demielinizzanti e la microglia isolata da questo protocollo può essere utilizzata per varie applicazioni a valle come la RT-PCR quantitativa e l'RNA-seq. Il protocollo utilizza colorante rosso neutro per individuare le lesioni demielinizzanti, che garantisce l'accuratezza delle posizioni delle lesioni e riduce qualsiasi confusione con il tessuto normale durante il campionamento. Una localizzazione accurata delle lesioni può aiutare a concentrarsi sugli effetti delle malattie e studiare il fenotipo molecolare unico e le caratteristiche funzionali della microglia nelle malattie demielinizzanti. Ciò fornirà una base per studiare il meccanismo della microglia nelle malattie demielinizzanti. Questo metodo di isolamento della microglia utilizzando perline magnetiche CD11b può purificare la microglia con elevata vitalità e resa cellulare in breve tempo, con requisiti minimi per le condizioni sperimentali, il che consente un uso diffuso per lo studio della microglia in condizioni diverse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dalla Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
