Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.
Abstract
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטה מסורתית המשמשת להגברה של גן מטרה שמילא תפקיד חשוב באבחון ביומולקולרי. עם זאת, PCR מסורתי גוזל זמן רב בגלל יעילות השונות בטמפרטורה נמוכה. עבודה זו מציעה מערכת CONTINUOUS-FLOW-PCR (CF-PCR) המבוססת על שבב מיקרופלואידי. ניתן לקצר מאוד את זמן ההגברה על ידי הפעלת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוץ הממוקם על תנורי חימום המוגדרים בטמפרטורות שונות. יתר על כן, מכיוון שאלקטרופורזה נימית (CE) היא דרך אידיאלית להבדיל בין מוצרי PCR חיוביים וחיוביים כוזבים, מערכת CE נבנתה כדי להשיג הפרדה יעילה של מקטעי ה- DNA. מאמר זה מתאר את תהליך ההגברה של Escherichia coli (E. coli) על ידי מערכת CF-PCR המובנית בתוך החברה ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי CE. התוצאות מראות כי גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות, מה שמצביע על כך ששתי מערכות אלה יכולות לשמש להגברה מהירה וזיהוי של חומצות גרעין.
Introduction
תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה ביולוגית מולקולרית המשמשת להגברת מקטעי DNA ספציפיים, ובכך מגבירה כמויות זעירות של DNA מאות מיליוני פעמים. הוא נמצא בשימוש נרחב באבחון קליני, מחקר רפואי, בטיחות מזון, זיהוי פורנזי ותחומים אחרים. תהליך ה- PCR מורכב בעיקר משלושה שלבים: דנטורציה ב 90-95 ° C, חישול ב 50-60 ° C, והרחבה ב 72-77 ° C. מחזור תרמי הוא חלק חשוב בתהליך ה- PCR; עם זאת, המחזור התרמי המסורתי PCR הוא לא רק מגושם אלא גם לא יעיל, ודורש כ -40 דקות כדי להשלים 25 מחזורים. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נבנתה בתוך החברה מערכת PCR (CF-PCR) בעלת זרימה רציפה, המבוססת על שבב מיקרופלואידי. CF-PCR יכול לחסוך זמן רב על ידי הנעת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוצים הממוקמים על תנורי חימום בטמפרטורות שונות 1,2,3,4,5.
מכיוון שלאלקטרופורזה נימית (CE) יתרונות רבים, כגון רזולוציה גבוהה, מהירות גבוהה ויכולת שחזור מצוינת 6,7,8,9,10,11, היא הפכה לכלי פופולרי במעבדה לניתוח חומצות גרעין וחלבונים. עם זאת, רוב המעבדות, במיוחד מעבדות בעולם המתפתח, אינן יכולות להרשות לעצמן טכנולוגיה זו בגלל מחירו הגבוה של מכשיר CE. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים כיצד לייצר את השבב המיקרופלואידי CF-PCR וכיצד לבנות מערכת CE רב-תכליתית במעבדה. אנו גם מדגימים את תהליך ההגברה של E. coli על ידי מערכת CF-PCR זו ואת זיהוי מוצרי PCR על ידי מערכת CE. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים לייצר שבבים מיקרופלואידים, להכין פתרונות PCR, לבנות מערכת CF-PCR להגברת חומצות גרעין, ולהקים מערכת CE פשוטה, אפילו עם משאבים מוגבלים, כדי להפריד מקטעי DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. ייצור שבב מיקרופלואידי CF-PCR
- חממו את פרוסת הסיליקון בטמפרטורה של 200°C למשך 25 דקות כדי להסיר את הלחות.
- יש להוציא 1 מ"ל של SU-8-2075 photoresist לכל אינץ' של רקיק. סובבו אותו על פרוסת הסיליקון באמצעות ציפוי ספין ב-500 סל"ד למשך 5-10 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה, ולאחר מכן ב-2,000 סל"ד למשך 30 שניות עם תאוצה של 500 סל"ד לשנייה.
- אופים ברכות, את רקיק הסיליקון בטמפרטורה של 65°C למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב-95°C למשך 15 דקות.
- הגדר 150 - 215 mJ/cm² כאנרגיית החשיפה של מכונת הפוטוליתוגרפיה, וחרוט את התבנית המעוצבת על התנגדות הפוטו עם מסיכת פוטוליתוגרפיה. מניחים את פרוסת הסיליקון ואת המסכה מוכנים לחשיפה.
- לאחר החשיפה, אפו את רקיק הסיליקון בטמפרטורה של 65°C למשך 2 דקות, ולאחר מכן ב-95°C במשך 7 דקות.
- טבלו את פרוסת הסיליקון בתמיסת פיתוח כדי להסיר עודפי פוטו-התנגדות והוציאו אותה כאשר ניתן לראות את המיקרו-ערוצים (איור 1). השתמש באיזופרופנול כדי לשטוף את פתרון המפתח השיורי.
- ערבבו את הפרה-פולימר וחומר הריפוי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ביחס של 10:1. יוצקים את תמיסת PDMS המעורבת לתבנית המשוכפלת וממצקים אותה בטמפרטורה של 80°C למשך 60 דקות.
- חברו את השבב המיקרופלואידי PDMS בשקופית לאחר ההפעלה באמצעות מנקה פלזמה, ומצקו אותם בטמפרטורה של 80°C למשך 30 דקות בהקדם האפשרי (איור 2).
הערה: הממדים החיצוניים של השבב הם 80.0 מ"מ × 30.0 מ"מ × 0.4 מ"מ. ישנם 40 תעלות סרפנטין (100 מיקרומטר × 1.46 מ"מ × 100 מיקרומטר, רוחב × אורך × עומק) בשבב microfluidic.
2. הכנת פתרון PCR
- הפשירו את הריאגנטים לחלוטין לפני התצורה. השתמש מערבול מערבולת וצנטריפוגה כדי להבטיח שהריאגנטים מעורבבים היטב.
- הכן צינור צנטריפוגה, הוספת המרכיבים הבאים בסדר זה: 33.75 μL של מים, 1.0 μL של תבנית DNA, 0.5 μL של פריימר, 5.0 μL של חיץ, 4.0 μL של תערובת dNTP, 1.5 μL של Tween 20, 3.5 μL של PVP, ולבסוף 0.25 μL של DNA פולימראז.
הערה: כאן, תבנית הדנ"א המשמשת היא E. coli. הפריימרים עבור E. coli ומרכיבי תמיסת ה-PCR מפורטים בטבלה 1 ובטבלה 2, בהתאמה. - מערבבים את התמיסה על ידי מערבולת.
3. בניית מערכת CF-PCR
- הכן שני תנורי חימום קרמיים בעלי מקדם טמפרטורה חיובי (PTC), שני ממסרי מצב מוצק, שני בקרי טמפרטורה PID, שני חיישני טמפרטורה וכבל חשמל.
הערה: גודל תנורי הקרמיקה PTC תלוי בגודל השבב המיקרופלואידי; האורך צריך להיות גדול יותר מאורך השבב - אורך רוחב - גובה של תנורי קרמיקה PTC המשמשים כאן הוא 10 ס"מ x 2 ס"מ x 0.4 ס"מ. - חבר את תנור החימום לממסר מצב מוצק.
- חבר את ממסר מצב מוצק לבקר הטמפרטורה PID.
- חבר את בדיקת חיישן הטמפרטורה לתחתית שני תנורי החימום וחבר את המסוף לבקר הטמפרטורה PID.
- חבר שני ממסרי Solid-State בסדרה וחבר את כבל החשמל.
- הדפס בתלת-ממד חריץ עבור שני תנורי החימום והשאר את תנורי החימום באותו מישור (ראה קובץ משלים 1 עבור קובצי STL הדרושים להדפסה בתלת-ממד).
הערה: השאירו מרווח אוויר של 12 מ"מ בין שני תנורי החימום. - מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני תנורי החימום.
- הכינו משאבת מזרק ומזרק, תקנו את המזרק על משאבת המזרק, חברו צינור סיליקון (קוטר פנימי של 0.8 מ"מ [ID]) עם מזרק, וחברו מחט פלדה (0.7 מ"מ ID) לחלק העליון של צינור הסיליקון (איור 3).
- הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic.
- מניחים קצה פיפטה בשקע השבב כדי לאסוף את מוצרי ה- PCR.
4. בניית מערכת CE
- השתמש בספק כוח במתח גבוה כדי ליצור שדה חשמלי פועם; שימו לב לאלקטרודות החיוביות והשליליות.
- השתמש במנורת כספית כמקור האור וסנן את אורך גל העירור ממנורת הכספית דרך מסנן.
- מניחים את הנימים על במת המיקרוסקופ.
- אסוף את הפליטה הפלואורסצנטית עם המטרה, ולאחר מכן זהה אותה באמצעות שפופרת מכפיל אור R928 (PMT). התבוננו במיקרוסקופ ובנימים. להדליק את האור בתנאי חדר חשוכים; אור עירור נאסף על ידי המטרה.
- השתמש בתוכנת LABVIEW שפותחה בעצמה כדי לשלוט בספק הכוח ולהשלים את איסוף הנתונים (המתואר בשלבים 6.3-6.6). ראה https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
הערה: כל הניסויים בוצעו בחדר חשוך, והסכמה של מערכת CE מוצגת באיור 4.
5. הפעל את פתרון ה- PCR
- הגדר מראש את הטמפרטורה של תנורי החימום של מערכת CF-PCR ב 65 ° C ו 95 ° C.
- מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני גושי החימום.
- הכנס את קצה צינור הסיליקון לצינור צנטריפוגה המכיל 50 μL של תמיסת PCR (משלב 2.3). משוך את בוכנת המזרק כדי למשוך לאט את התמיסה. תקן את המזרק על משאבת מזרק. הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic.
- הגדר את קצב הזרימה של המשאבה ל- 10 μL / min ולחץ על לחצן התחל כדי לדחוף את התמיסה במיקרו-ערוץ בכניסת השבב.
- לאסוף את מוצרי PCR בשקע של שבב microfluidic.
הערה: יש לשטוף את התעלה במים טהורים במיוחד לפני ואחרי בדיקת ה-PCR כדי להסיר זיהומים.
6. איתור מוצרי PCR על ידי מערכת CE זו המובנית בתוך החברה
- הכינו נימים באורך כולל של 8 ס"מ ובאורך אפקטיבי של 6 ס"מ.
- הכן את מאגר ההפרדה על ידי ערבוב 100 μL של 1% hydroxyethylcellulose (HEC, w / v), 2 μL של 100x SYBR Green I, ו 98 μL של מים טהורים במיוחד כדי לקבל 0.5% HEC (w / v) המכיל 1x SYBR ירוק I.
- מלאו את הנימים במאגר ההפרדה המוכן באמצעות משאבת ואקום.
- הזן את מתח ההזרקה (800 V) ואת זמן ההזרקה (2.0 שניות) בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והמתן עד שמוצרי ה- PCR יוכנסו אלקטרודינמית לנימים ב- 100 V/cm (2.0 שניות).
הערה: בשלב זה, מוצרי ה-PCR ממוקמים על האלקטרודה השלילית והמאגר ממוקם על האלקטרודה החיובית. - הזן את מתח ה- DC (800 V) בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והפעל את האלקטרופורזה בחוזק שדה חשמלי של 100 V/cm.
הערה: בשלב זה, הן האלקטרודות החיוביות והן האלקטרודות השליליות ממוקמות עם חיץ. - לחץ על לחצן העצירה לאחר שכל מקטעי ה- DNA מופרדים בנימים.
- שטפו את הנימים במים מעוקרים למשך דקה אחת לאחר כל ריצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 מייצג את האלקטרופרוגרמה של תוצרי PCR ואת סמני הדנ"א. עקבות (איור 5A) הן תוצאת CE של המוצר המוגבר CF-PCR, עקבות (איור 5B) הן תוצאת CE של המוצר המוגבר על-ידי מחזור תרמי, ועקבות (איור 5C) הן תוצאת CE של סולם הדנ"א של 100 bp. תחילה הגברנו את גן המטרה של E. coli במערכת CF-PCR; פתרון ה- PCR לקח ~ 10 דקות, 30 שניות מהכניסה ליציאת השבב. גודל אמפליקון המטרה של E. coli היה 544 bp. תוצרי ה-PCR המוגבר נותחו במערכת CE, וגם CE של סולם DNA של 100 bp בוצע באותם תנאי ניסוי. ניתן להעריך את גודל מוצר ה- PCR על פי האלקטרופרוגרמה של סולם ה- DNA. כל ניסוי בוצע שלוש פעמים לצורך שחזור. הנתונים באיור 5 מראים כי השיאים המתאימים לתוצרי ה-PCR של E. coli נצפו לאחר ההפרדה, וזמני הנדידה של תוצרי ה-PCR בשבב המיקרופלואידי היו תואמים לאלה שבמחזור תרמי.
איור 1: רקיק הסיליקון המנוקה. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השבב המיקרופלואידי CF-PCR שנוצר באמצעות PDMS. המיקרו-ערוצים מולאו בדיו אדום להדמיה. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. קיצורים: CF-PCR = continuous-flow-PCR; PDMS = polydimethysiloxane. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מערכת CF-PCR. (1) שבב מיקרופלואידי, (2) מחמם קרמי PTC, (3) מזרק, (4) משאבה, (5) צינורות סיליקון, (6) חריץ, (7) מחט פלדה, (8) קצה פיפטה, (9) בקר טמפרטורה PID, (10) חיישן טמפרטורה, (11) ממסר מצב מוצק. קיצור: CF-PCR = continuous-flow-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בניית מערכת CE. קיצורים: CE = אלקטרופורזה נימית; PMT = צינור מכפיל אור; A1, A2 = מסננים; B = עדשת שדה; C = מראה דיכרואית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: האלקטרופרוגרמה של Escherichia coli. הגברה על ידי (A) שבב מיקרופלואידי CF-PCR, (B) מחזור תרמי PCR מסורתי, ו-(C) סמני DNA. קיצור: CF-PCR = continuous-flow-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| יעד | רצף 5′...... 3′ | אמפליקון (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC: | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
טבלה 1: פריימרים המשמשים עבור Escherichia coli. קיצורים: EC = Escherichia coli; F = קדימה; R = הפוך.
| 10x מאגר מהיר I | 5.0 מיקרוליטר |
| תערובת dNTP (2.5 מיקרומטר) | 4.0 מיקרוליטר |
| SpeedSTAR HS DNA פולימראז | 0.25 מיקרוליטר |
| פוליוויניל פירולידון (PVP) | 3.5 מיקרוליטר |
| טווין 20 | 1.5 מיקרוליטר |
| תבנית | 1.0 מיקרוליטר |
| EC-F | 0.5 מיקרוליטר |
| EC-R | 0.5 מיקרוליטר |
| מים טהורים במיוחד | 33.75 מיקרוליטר |
טבלה 2: מרכיבי פתרון ה-PCR. קיצורים: EC = Escherichia coli; F = קדימה; R = הפוך.
קובץ משלים 1: קובץ STL להדפסה תלת מימדית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הן PCR והן CE הן שתי ביוטכנולוגיות פופולריות בניתוח חומצות גרעין. מאמר זה מתאר את ההגברה של E. coli ואת זיהוי מוצרי PCR באמצעות מערכות CF-PCR ו- CE, שתיהן מובנות בתוך החברה. גן המטרה של E. coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות בגלל קצבי העברת החום הגבוהים. מקטעי דנ"א קטנים מ-1,500 bp הופרדו תוך 8 דקות (איור 5). היתרון הגדול של שתי טכניקות אלה הוא שזה יכול לחסוך זמן רב בהשוואה לשיטות האלקטרופורזה המסורתיות של PCR וג'ל לוח. חוקרים צריכים לזכור כי יש לנקות את השבב המיקרופלואידי CF-PCR לאחר השימוש, ומערכת CE צריכה להיבנות בבית נקי ושחור כדי למנוע זיהום של דגימות. מערכת CF-PCR המבוססת על השבב המיקרופלואידי ומערכת CE שהוצגה בעבודה זו קלה לייצור ועשויה להציע שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה. עם זאת, מגבלה של CF-PCR היא שהוא יכול רק להגביר ולזהות רק דגימה אחת בכל פעם, מה שעשוי להגביל את היישום הרחב שלה; כדי להתמודד עם זה, משתמשים יכולים לפתח את השבב המיקרופלואידי המשולב CF-PCR ומערך CE כדי לפתור בעיה זו. לפלטפורמה המדווחת בעבודה זו יש פוטנציאל יישום גדול בתחום האבחון הקליני של מחלות זיהומיות ומחקר חומצות גרעין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי, סין (מס '19ZR1477500 ומס '18441900400). אנו מודים בהכרת תודה על תמיכה כספית מאוניברסיטת שנחאי למדע וטכנולוגיה (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
