Summary
यह प्रोटोकॉल बताता है कि माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आधार पर एक निरंतर-प्रवाह-पोलीमरेज़ चेन सिस्टम कैसे बनाया जाए और प्रयोगशाला में केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का निर्माण कैसे किया जाए। यह प्रयोगशाला में न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करता है।
Abstract
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक लक्ष्य जीन के प्रवर्धन के लिए नियोजित एक पारंपरिक विधि है जिसने बायोमोलेक्यूलर डायग्नोस्टिक्स में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। हालांकि, कम तापमान भिन्नता दक्षता के कारण पारंपरिक पीसीआर बहुत समय लेने वाला है। यह काम एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप पर आधारित एक निरंतर-प्रवाह-पीसीआर (सीएफ-पीसीआर) प्रणाली का प्रस्ताव करता है। पीसीआर समाधान को विभिन्न तापमानों पर सेट किए गए हीटर पर रखे माइक्रोचैनल में चलाकर प्रवर्धन समय को बहुत कम किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) सकारात्मक और गलत-सकारात्मक पीसीआर उत्पादों को अलग करने का एक आदर्श तरीका है, डीएनए टुकड़ों के कुशल पृथक्करण को प्राप्त करने के लिए एक सीई प्रणाली बनाई गई थी। यह पेपर इन-हाउस निर्मित सीएफ-पीसीआर सिस्टम द्वारा एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) के प्रवर्धन की प्रक्रिया और सीई द्वारा पीसीआर उत्पादों का पता लगाने का वर्णन करता है। परिणाम बताते हैं कि ई कोलाई के लक्ष्य जीन को 10 मिनट के भीतर सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया था, यह दर्शाता है कि इन दो प्रणालियों का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के तेजी से प्रवर्धन और पहचान के लिए किया जा सकता है।
Introduction
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जिसका उपयोग विशिष्ट डीएनए टुकड़ों को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिससे डीएनए की ट्रेस मात्रा को लाखों बार बढ़ाया जाता है। यह नैदानिक निदान, चिकित्सा अनुसंधान, खाद्य सुरक्षा, फोरेंसिक पहचान और अन्य क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। पीसीआर प्रक्रिया में मुख्य रूप से तीन चरण होते हैं: 90-95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण, 50-60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 72-77 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार। थर्मल साइक्लिंग पीसीआर प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है; हालांकि, पारंपरिक पीसीआर थर्मल साइकलर न केवल भारी है, बल्कि अक्षम भी है, 25 चक्रों को पूरा करने के लिए लगभग 40 मिनट की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आधार पर एक निरंतर-प्रवाह पीसीआर (सीएफ-पीसीआर) प्रणाली का निर्माण किया गया था। सीएफ-पीसीआर पीसीआर समाधान को विभिन्नतापमानों 1,2,3,4,5 पर हीटर पर रखे माइक्रोचैनल्स में चलाकर समय बचा सकता है।
चूंकि केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) के कई फायदे हैं, जैसे कि उच्च रिज़ॉल्यूशन, उच्च गति, और उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता 6,7,8,9,10,11, यह न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है। हालांकि, अधिकांश प्रयोगशालाएं, विशेष रूप से विकासशील दुनिया में प्रयोगशालाएं, सीई उपकरण की उच्च कीमत के कारण इस तकनीक को बर्दाश्त नहीं कर सकती हैं। यहां, हमने सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप बनाने और प्रयोगशाला में एक बहुमुखी सीई सिस्टम बनाने के तरीके के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार की है। हम इस सीएफ-पीसीआर प्रणाली द्वारा ई कोलाई के प्रवर्धन की प्रक्रिया और सीई प्रणाली द्वारा पीसीआर उत्पादों का पता लगाने की प्रक्रिया को भी प्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करके, उपयोगकर्ताओं को माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स बनाने, पीसीआर समाधान तैयार करने, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन के लिए सीएफ-पीसीआर प्रणाली बनाने और डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए सीमित संसाधनों के साथ भी एक सरल सीई प्रणाली स्थापित करने में सक्षम होना चाहिए।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप का निर्माण
- नमी को हटाने के लिए 25 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन वेफर को गर्म करें।
- वेफर के प्रति इंच एसयू-8-2075 फोटोरेसिस्ट के 1 एमएल वितरित करें। इसे सिलिकॉन वेफर पर 500 आरपीएम पर 5-10 सेकंड के त्वरण के साथ 500 आरपीएम पर 100 आरपीएम / सेकंड के त्वरण के साथ और फिर 500 आरपीएम / सेकंड के त्वरण के साथ 30 सेकंड के लिए 2,000 आरपीएम पर स्पिन करें।
- सिलिकॉन वेफर को 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नरम बेक करें, फिर 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
- फोटोलिथोग्राफी मशीन के लिए एक्सपोज़र ऊर्जा के रूप में 150 - 215 एमजे / सेमी² सेट करें, और फोटोलिथोग्राफी मास्क के साथ फोटोरेसिस्ट पर डिज़ाइन किए गए पैटर्न को उत्कीर्ण करें। सिलिकॉन वेफर और मास्क को एक्सपोजर के लिए तैयार रखें।
- एक्सपोजर के बाद, सिलिकॉन वेफर को 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, और फिर 7 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर।
- अतिरिक्त फोटोरेसिस्ट को हटाने के लिए डेवलपर समाधान में सिलिकॉन वेफर को डुबोएं और जब माइक्रोचैनल्स देखे जा सकें तो इसे बाहर निकालें (चित्रा 1)। अवशिष्ट डेवलपर समाधान को धोने के लिए आइसोप्रोपेनोल का उपयोग करें।
- पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) प्रीपॉलिमर और इलाज एजेंट को 10: 1 के अनुपात में मिलाएं। मिश्रित पीडीएमएस घोल को प्रतिकृति मोल्ड में डालें और इसे 60 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ठोस करें।
- प्लाज्मा क्लीनर का उपयोग करके सक्रियण के बाद पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चिप को स्लाइड पर बांधें, और जितनी जल्दी हो सके 30 मिनट के लिए उन्हें 80 डिग्री सेल्सियस पर ठोस करें (चित्रा 2)।
नोट: चिप के बाहरी आयाम 80.0 मिमी × 30.0 मिमी × 0.4 मिमी हैं। माइक्रोफ्लुइडिक चिप में 40 सर्पेंटाइन चैनल (100 μm × 1.46 मिमी × 100 μm, चौड़ाई × लंबाई × गहराई) होते हैं।
2. पीसीआर समाधान की तैयारी
- विन्यास से पहले अभिकर्मकों को पूरी तरह से पिघलाएं। अभिकर्मकों को अच्छी तरह से मिश्रित करने के लिए एक भंवर मिक्सर और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
- इस क्रम में निम्नलिखित घटकों को जोड़ते हुए एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें: 33.75 μL पानी, 1.0 μL डीएनए टेम्पलेट, 0.5 μL प्राइमर, 5.0 μL बफर, 4.0 μL dNTP मिश्रण, 1.5 μL ट्वीन 20, 3.5 μL PVP, और अंत में 0.25 μL DNA पोलीमरेज़।
नोट: यहां, उपयोग किया जाने वाला डीएनए टेम्पलेट ई कोलाई है। ई कोलाई के लिए प्राइमर और पीसीआर समाधान के घटक क्रमशः तालिका 1 और तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं। - घोल को भंवर में डालकर मिलाएं।
3. सीएफ-पीसीआर प्रणाली का निर्माण
- दो सकारात्मक तापमान गुणांक (पीटीसी) सिरेमिक हीटर, दो ठोस-राज्य रिले, दो पीआईडी तापमान नियंत्रक, दो तापमान सेंसर और एक पावर कॉर्ड तैयार करें।
नोट: पीटीसी सिरेमिक हीटर का आकार माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आकार पर निर्भर करता है; लंबाई चिप की लंबाई से अधिक होनी चाहिए- यहां उपयोग किए जाने वाले पीटीसी सिरेमिक हीटर की लंबाई-चौड़ाई-ऊंचाई 10 सेमी x 2 सेमी x 0.4 सेमी है। - हीटर को सॉलिड-स्टेट रिले से कनेक्ट करें।
- ठोस-अवस्था रिले को पीआईडी तापमान नियंत्रक से कनेक्ट करें।
- तापमान सेंसर जांच को दो हीटर के नीचे संलग्न करें और टर्मिनल को पीआईडी तापमान नियंत्रक से कनेक्ट करें।
- श्रृंखला में दो ठोस-राज्य रिले कनेक्ट करें और पावर कॉर्ड को कनेक्ट करें।
- 3 डी दो हीटर के लिए एक स्लॉट प्रिंट करें और हीटर को एक ही विमान पर रखें (3 डी प्रिंटिंग के लिए आवश्यक एसटीएल फ़ाइलों के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
नोट: दो हीटरों के बीच 12 मिमी हवा का अंतर छोड़ दें। - दो हीटर पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप रखें।
- एक सिरिंज पंप और एक सिरिंज तैयार करें, सिरिंज पंप पर सिरिंज को ठीक करें, एक सिलिकॉन ट्यूबिंग (0.8 मिमी आंतरिक व्यास [आईडी]) को सिरिंज के साथ कनेक्ट करें, और सिलिकॉन टयूबिंग के शीर्ष पर एक स्टील सुई (0.7 मिमी आईडी) कनेक्ट करें (चित्रा 3)।
- माइक्रोफ्लुइडिक चिप के इनलेट में स्टील की सुई डालें।
- पीसीआर उत्पादों को इकट्ठा करने के लिए चिप के आउटलेट पर एक पिपेट टिप रखें।
4. सीई प्रणाली का निर्माण
- स्पंदित-क्षेत्र विद्युत क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए एक उच्च-वोल्टेज बिजली की आपूर्ति का उपयोग करें; सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड पर ध्यान दें।
- प्रकाश स्रोत के रूप में एक पारा दीपक का उपयोग करें और एक फिल्टर के माध्यम से पारा दीपक से उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को फ़िल्टर करें।
- माइक्रोस्कोप चरण पर केशिका रखें।
- उद्देश्य के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन एकत्र करें, और फिर आर 928 फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) का उपयोग करके इसका पता लगाएं। माइक्रोस्कोप और केशिका का निरीक्षण करें। अंधेरे कमरे की स्थिति में प्रकाश चालू करें; उत्तेजना प्रकाश उद्देश्य द्वारा एकत्र किया जाता है।
- बिजली की आपूर्ति को नियंत्रित करने और डेटा अधिग्रहण को पूरा करने के लिए स्व-विकसित LABVIEW सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (चरण 6.3-6.6 में वर्णित)। https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi देखें।
नोट: सभी प्रयोग एक अंधेरे कमरे में किए गए थे, और सीई प्रणाली का योजनाबद्ध चित्र 4 में दिखाया गया है।
5. पीसीआर समाधान चलाएं
- सीएफ-पीसीआर प्रणाली के हीटर ों के तापमान को 65 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रीसेट करें।
- माइक्रोफ्लुइडिक चिप को दो हीटिंग ब्लॉक पर रखें।
- सिलिकॉन ट्यूब की नोक को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें जिसमें पीसीआर समाधान के 50 μL (चरण 2.3 से) शामिल हैं। धीरे-धीरे घोल को वापस लेने के लिए सिरिंज प्लंजर खींचें। सिरिंज पंप पर सिरिंज ठीक करें। माइक्रोफ्लुइडिक चिप के इनलेट में स्टील की सुई डालें।
- पंप की प्रवाह दर को 10 μL / min पर सेट करें और माइक्रोचिप के इनलेट पर माइक्रोचैनल में समाधान को धक्का देने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं।
- माइक्रोफ्लुइडिक चिप के आउटलेट पर पीसीआर उत्पादों को इकट्ठा करें।
नोट: अशुद्धियों को दूर करने के लिए पीसीआर से पहले और बाद में चैनल को अल्ट्राप्योर पानी से धोएं।
6. इन-हाउस निर्मित इस सीई सिस्टम द्वारा पीसीआर उत्पादों का पता लगाना
- 8 सेमी कुल लंबाई और 6 सेमी प्रभावी लंबाई के साथ एक केशिका तैयार करें।
- 100 μL 1% हाइड्रॉक्सीएथिलसेल्यूलोज (HEC, w/v), 100x SYBR Green I के 2 μL, और 1x SYBR Green I युक्त 0.5% HEC (w/v) प्राप्त करने के लिए 98 μL अल्ट्राप्योर पानी मिलाकर पृथक्करण बफर तैयार करें।
- वैक्यूम पंप का उपयोग करके तैयार पृथक्करण बफर के साथ केशिका भरें।
- सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर इंजेक्शन वोल्टेज (800 वी) और इंजेक्शन समय (2.0 एस) इनपुट करें, स्टार्ट बटन पर क्लिक करें, और पीसीआर उत्पादों को 100 वी / सेमी (2.0 एस) पर केशिका में इलेक्ट्रोडायनामिक रूप से पेश किए जाने की प्रतीक्षा करें।
नोट: इस चरण में, पीसीआर उत्पादों को नकारात्मक इलेक्ट्रोड पर रखा जाता है और बफर को सकारात्मक इलेक्ट्रोड पर रखा जाता है। - सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर डीसी वोल्टेज (800 वी) इनपुट करें, स्टार्ट बटन पर क्लिक करें, और विद्युत क्षेत्र की ताकत के 100 वी / सेमी पर वैद्युतकणसंचलन चलाएं।
नोट: इस चरण में, सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोड दोनों को बफर के साथ रखा जाता है। - केशिका में सभी डीएनए टुकड़े अलग होने के बाद स्टॉप बटन पर क्लिक करें।
- प्रत्येक रन के बाद 1 मिनट के लिए केशिका को निष्फल पानी से फ्लश करें।
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Representative Results
चित्रा 5 पीसीआर उत्पादों और डीएनए मार्करों के इलेक्ट्रोफेरोग्राम का प्रतिनिधित्व करता है। ट्रेस (चित्रा 5 ए) सीएफ-पीसीआर प्रवर्धित उत्पाद का सीई परिणाम है, ट्रेस (चित्रा 5 बी) थर्मल साइकिलिंग द्वारा प्रवर्धित उत्पाद का सीई परिणाम है, और ट्रेस (चित्रा 5 सी) 100 बीपी डीएनए सीढ़ी का सीई परिणाम है। हमने पहली बार सीएफ-पीसीआर प्रणाली में ई कोलाई के लक्ष्य जीन को बढ़ाया; पीसीआर समाधान को इनलेट से चिप के आउटलेट तक ~ 10 मिनट, 30 सेकंड लगे। ई कोलाई के लक्ष्य एम्प्लिकॉन का आकार 544 बीपी था। सीई प्रणाली में प्रवर्धित पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण किया गया था, और 100 बीपी डीएनए सीढ़ी का सीई भी उसी प्रयोगात्मक परिस्थितियों में किया गया था। पीसीआर उत्पाद के आकार का मूल्यांकन डीएनए सीढ़ी के इलेक्ट्रोफेरोग्राम के अनुसार किया जा सकता है। प्रजनन क्षमता के लिए प्रत्येक प्रयोग तीन बार किया गया था। चित्रा 5 के आंकड़ों से पता चलता है कि ई कोलाई के पीसीआर उत्पादों के अनुरूप चोटियों को अलग होने के बाद देखा गया था, और माइक्रोफ्लुइडिक चिप में पीसीआर उत्पादों का प्रवास समय थर्मल साइकलर में एक के अनुरूप था।
चित्र 1: साफ सिलिकॉन वेफर। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पीडीएमएस का उपयोग करके बनाई गई सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप। विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोचैनल्स को लाल स्याही से भर दिया गया था। स्केल बार = 1 सेमी। संक्षेप: सीएफ-पीसीआर = निरंतर-प्रवाह-पीसीआर; पीडीएमएस = पॉलीडिमेथिसिलोक्सेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: सीएफ-पीसीआर प्रणाली। (1) माइक्रोफ्लुइडिक चिप, (2) पीटीसी सिरेमिक हीटर, (3) सिरिंज, (4) पंप, (5) सिलिकॉन टयूबिंग, (6) स्लॉट, (7) स्टील सुई, (8) पिपेट टिप, (9) पीआईडी तापमान नियंत्रक, (10) तापमान सेंसर, (11) ठोस-अवस्था रिले। संक्षिप्त नाम: सीएफ-पीसीआर = निरंतर-प्रवाह-पीसीआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: सीई प्रणाली का निर्माण। संक्षेप: सीई = केशिका वैद्युतकणसंचलन; पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; ए 1, ए 2 = फिल्टर; बी = फील्ड लेंस; सी = डाइक्रोइक दर्पण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: एस्चेरिचिया कोलाई का इलेक्ट्रोफेरोग्राम। (ए) सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप, (बी) पारंपरिक पीसीआर थर्मल साइक्लर, और (सी) डीएनए मार्करों द्वारा प्रवर्धन। संक्षिप्त नाम: सीएफ-पीसीआर = निरंतर-प्रवाह-पीसीआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| लक्ष्य | अनुक्रम 5'...... 3′ | एम्प्लिकॉन (बीपी) | ||
| ईसी-एफ | GGAAGAAGCTTGCTTCTCTCTGCTGac | 544 | ||
| ईसी-आर | AGCCCGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
तालिका 1: एस्चेरिचिया कोलाई के लिए नियोजित प्राइमर।संक्षेप: ईसी = एस्चेरिचिया कोलाई; एफ = आगे; R = उल्टा।
| 10x फास्ट बफर I | 5.0 μL |
| dNTP मिश्रण (2.5 μM) | 4.0 μL |
| स्पीडस्टार एचएस डीएनए पोलीमरेज़ | 0.25 μL |
| पॉलीविनाइल पाइरोलिडोन (पीवीपी) | 3.5 μL |
| ट्वीन 20 | 1.5 μL |
| साँचा | 1.0 μL |
| ईसी-एफ | 0.5 μL |
| ईसी-आर | 0.5 μL |
| अति शुद्ध पानी | 33.75 μL |
तालिका 2: पीसीआर समाधान के घटक। संक्षेप: ईसी = एस्चेरिचिया कोलाई; एफ = आगे; R = उल्टा।
पूरक फ़ाइल 1: 3 डी प्रिंटिंग के लिए एसटीएल फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पीसीआर और सीई दोनों न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण में दो लोकप्रिय जैव प्रौद्योगिकी हैं। यह पेपर ई कोलाई के प्रवर्धन और सीएफ-पीसीआर और सीई सिस्टम का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों का पता लगाने का वर्णन करता है, दोनों इन-हाउस निर्मित हैं। उच्च गर्मी हस्तांतरण दर के कारण ई कोलाई के लक्ष्य जीन को 10 मिनट के भीतर सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया था। 1,500 बीपी से छोटे डीएनए टुकड़े 8 मिनट के भीतर अलग हो गए (चित्रा 5)। इन दो तकनीकों का बड़ा लाभ यह है कि यह पारंपरिक पीसीआर और स्लैब जेल वैद्युतकणसंचलन विधियों की तुलना में समय बचा सकता है। शोधकर्ताओं को यह ध्यान रखना चाहिए कि सीएफ-पीसीआर माइक्रोफ्लुइडिक चिप को उपयोग के बाद साफ करने की आवश्यकता होती है, और नमूनों के संदूषण से बचने के लिए सीई सिस्टम को एक साफ और काले घर में बनाया जाना चाहिए। माइक्रोफ्लुइडिक चिप और इस काम में पेश की गई सीई प्रणाली पर आधारित सीएफ-पीसीआर प्रणाली को गढ़ना आसान है और प्रयोगशाला में न्यूक्लिक एसिड के विश्लेषण के लिए एक सरल विधि प्रदान कर सकता है। हालांकि, सीएफ-पीसीआर की एक सीमा यह है कि यह एक समय में केवल एक नमूने को बढ़ा और पता लगा सकता है, जो इसके व्यापक अनुप्रयोग को सीमित कर सकता है; इसका मुकाबला करने के लिए, उपयोगकर्ता इस समस्या को हल करने के लिए एकीकृत सीएफ-पीसीआर और सीई सरणी माइक्रोफ्लुइडिक चिप विकसित कर सकते हैं। इस काम में रिपोर्ट किए गए मंच में संक्रामक रोगों और न्यूक्लिक एसिड अनुसंधान के नैदानिक निदान के क्षेत्र में बहुत संभावित अनुप्रयोग है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को शंघाई नगर पालिका, चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (नंबर 19ZR1477500 और नंबर 18441900400) द्वारा समर्थित किया गया था। हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए शंघाई विश्वविद्यालय (संख्या 2017KJFZ049) से वित्तीय सहायता को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
