Summary
Questo protocollo descrive come costruire un sistema a catena di polimerasi a flusso continuo basato su un chip microfluidico e come costruire un sistema di elettroforesi capillare in laboratorio. Presenta un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio.
Abstract
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo tradizionale impiegato per l'amplificazione di un gene bersaglio che ha svolto un ruolo importante nella diagnostica biomolecolare. Tuttavia, la PCR tradizionale richiede molto tempo a causa dell'efficienza di variazione della bassa temperatura. Questo lavoro propone un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR) basato su un chip microfluidico. Il tempo di amplificazione può essere notevolmente ridotto facendo scorrere la soluzione PCR in un microcanale posto su riscaldatori impostati a temperature diverse. Inoltre, poiché l'elettroforesi capillare (CE) è un modo ideale per differenziare i prodotti PCR positivi da quelli falsi positivi, è stato costruito un sistema CE per ottenere una separazione efficiente dei frammenti di DNA. Questo documento descrive il processo di amplificazione di Escherichia coli (E. coli) da parte del sistema CF-PCR costruito internamente e la rilevazione dei prodotti PCR da parte di CE. I risultati dimostrano che il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti, indicando che questi due sistemi possono essere utilizzati per la rapida amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici.
Introduction
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, amplificando così tracce di DNA centinaia di milioni di volte. È stato ampiamente utilizzato nella diagnosi clinica, nella ricerca medica, nella sicurezza alimentare, nell'identificazione forense e in altri campi. Il processo di PCR consiste principalmente in tre fasi: denaturazione a 90-95 °C, ricottura a 50-60 °C ed estensione a 72-77 °C. Il ciclo termico è una parte importante del processo di PCR; tuttavia, il termociclatore PCR tradizionale non è solo ingombrante ma anche inefficiente, richiedendo circa 40 minuti per completare 25 cicli. Per superare queste limitazioni, è stato costruito internamente un sistema di PCR a flusso continuo (CF-PCR), basato su un chip microfluidico. La CF-PCR può far risparmiare molto tempo guidando la soluzione PCR in microcanali posti su riscaldatori a diverse temperature 1,2,3,4,5.
Poiché l'elettroforesi capillare (CE) presenta molti vantaggi, come l'alta risoluzione, l'alta velocità e l'eccellente riproducibilità 6,7,8,9,10,11, è diventata uno strumento popolare in laboratorio per l'analisi di acidi nucleici e proteine. Tuttavia, la maggior parte dei laboratori, in particolare i laboratori nei paesi in via di sviluppo, non possono permettersi questa tecnologia a causa del prezzo elevato dello strumento CE. In questo articolo, abbiamo delineato i protocolli su come fabbricare il chip microfluidico CF-PCR e su come costruire un sistema CE versatile in laboratorio. Dimostriamo anche il processo di amplificazione di E. coli da parte di questo sistema CF-PCR e la rilevazione dei prodotti PCR da parte del sistema CE. Seguendo le procedure descritte in questo protocollo, gli utenti dovrebbero essere in grado di fabbricare chip microfluidici, preparare soluzioni PCR, costruire un sistema CF-PCR per l'amplificazione degli acidi nucleici e impostare un semplice sistema CE, anche con risorse limitate, per separare i frammenti di DNA.
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Protocol
NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo.
1. Fabbricazione del chip microfluidico CF-PCR
- Riscaldare il wafer di silicio a 200 °C per 25 minuti per rimuovere l'umidità.
- Erogare 1 mL di fotoresist SU-8-2075 per pollice del wafer. Centrifugarlo sul wafer di silicio utilizzando uno spin coater a 500 giri/min per 5-10 s con un'accelerazione di 100 giri/min, e poi a 2.000 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 500 giri/min/s.
- Cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 3 minuti, poi a 95 °C per 15 minuti.
- Impostare 150 - 215 mJ/cm² come energia di esposizione per la macchina fotolitografica e incidere il modello progettato sul fotoresist con una maschera per fotolitografia. Posizionare il wafer di silicio e la maschera pronti per l'esposizione.
- Dopo l'esposizione, cuocere il wafer di silicio a 65 °C per 2 minuti e poi a 95 °C per 7 minuti.
- Immergere il wafer di silicio nella soluzione di sviluppo per rimuovere il fotoresist in eccesso ed estrarlo quando i microcanali sono visibili (Figura 1). Utilizzare l'isopropanolo per risciacquare la soluzione di rivelatore residua.
- Miscelare il prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente indurente in un rapporto di 10:1. Versare la soluzione PDMS miscelata nello stampo replica e solidificarla a 80 °C per 60 min.
- Incollare il chip microfluidico PDMS su un vetrino dopo l'attivazione utilizzando un pulitore al plasma e solidificarlo a 80 °C per 30 minuti il prima possibile (Figura 2).
NOTA: Le dimensioni esterne del chip sono 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Nel chip microfluidico sono presenti 40 canali a serpentina (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, larghezza × lunghezza × profondità).
2. Preparazione della soluzione PCR
- Scongelare completamente i reagenti prima della configurazione. Utilizzare un miscelatore a vortice e una centrifuga per assicurarsi che i reagenti siano ben miscelati.
- Preparare una provetta da centrifuga, aggiungendo i seguenti componenti in questo ordine: 33,75 μL di acqua, 1,0 μL di DNA stampo, 0,5 μL di primer, 5,0 μL di tampone, 4,0 μL di miscela dNTP, 1,5 μL di Tween 20, 3,5 μL di PVP e infine 0,25 μL di DNA polimerasi.
NOTA: In questo caso, il modello di DNA utilizzato è E. coli. I primer per E. coli e i componenti della soluzione PCR sono elencati rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella 2. - Mescolare la soluzione mediante vortice.
3. Costruzione del sistema CF-PCR
- Preparare due riscaldatori ceramici a coefficiente di temperatura positivo (PTC), due relè a stato solido, due regolatori di temperatura PID, due sensori di temperatura e un cavo di alimentazione.
NOTA: La dimensione dei riscaldatori ceramici PTC dipende dalla dimensione del chip microfluidico; la lunghezza dovrebbe essere maggiore della lunghezza del chip: la lunghezza-larghezza-altezza dei riscaldatori ceramici PTC utilizzati qui è di 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Collegare il riscaldatore al relè a stato solido.
- Collegare il relè a stato solido al regolatore di temperatura PID.
- Collegare la sonda del sensore di temperatura alla parte inferiore dei due riscaldatori e collegare il terminale al regolatore di temperatura PID.
- Collegare due relè a stato solido in serie e collegare il cavo di alimentazione.
- Stampare in 3D uno slot per i due riscaldatori e mantenere i riscaldatori sullo stesso piano (vedere File supplementare 1 per i file STL necessari per la stampa 3D).
NOTA: Lasciare un'intercapedine d'aria di 12 mm tra i due riscaldatori. - Posizionare il chip microfluidico sui due riscaldatori.
- Preparare una pompa a siringa e una siringa, fissare la siringa sulla pompa a siringa, collegare un tubo in silicone (diametro interno di 0,8 mm [ID]) con una siringa e collegare un ago in acciaio (ID 0,7 mm) alla parte superiore del tubo in silicone (Figura 3).
- Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico.
- Posizionare un puntale di pipetta all'uscita del chip per raccogliere i prodotti PCR.
4. Costruzione del sistema CE
- Utilizzare un alimentatore ad alta tensione per generare un campo elettrico a campo pulsato; Notare gli elettrodi positivo e negativo.
- Utilizzare una lampada al mercurio come sorgente luminosa e filtrare la lunghezza d'onda di eccitazione dalla lampada al mercurio attraverso un filtro.
- Posizionare il capillare sul tavolino del microscopio.
- Raccogliere l'emissione di fluorescenza con l'obiettivo, quindi rilevarla utilizzando un tubo fotomoltiplicatore R928 (PMT). Osservare il microscopio e il capillare. Accendi la luce in condizioni di stanza buia; La luce di eccitazione viene raccolta dall'obiettivo.
- Utilizzare il software LABVIEW sviluppato internamente per controllare l'alimentazione e completare l'acquisizione dei dati (descritta nei passaggi 6.3-6.6). Vedi https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in una camera oscura e lo schema del sistema CE è mostrato nella Figura 4.
5. Eseguire la soluzione PCR
- Preimpostare la temperatura dei riscaldatori del sistema CF-PCR a 65 °C e 95 °C.
- Posizionare il chip microfluidico sui due blocchi riscaldanti.
- Inserire la punta della provetta in silicone in una provetta da centrifuga contenente 50 μL di soluzione PCR (dal punto 2.3). Tirare lo stantuffo della siringa per prelevare lentamente la soluzione. Fissare la siringa su una pompa a siringa. Inserire l'ago in acciaio nell'ingresso del chip microfluidico.
- Impostare la portata della pompa a 10 μL/min e premere il pulsante di avvio per spingere la soluzione nel microcanale all'ingresso del microchip.
- Raccogliere i prodotti PCR all'uscita del chip microfluidico.
NOTA: Sciacquare il canale con acqua ultrapura prima e dopo la PCR per rimuovere le impurità.
6. Rilevamento dei prodotti PCR da parte di questo sistema CE costruito internamente
- Preparare un capillare con una lunghezza totale di 8 cm e una lunghezza effettiva di 6 cm.
- Preparare il tampone di separazione mescolando 100 μL di idrossietilcellulosa all'1% (HEC, p/v), 2 μL di 100x SYBR Green I e 98 μL di acqua ultrapura per ottenere lo 0,5% di HEC (p/v) contenente 1x SYBR Green I.
- Riempire il capillare con il tampone di separazione preparato utilizzando una pompa a vuoto.
- Inserire la tensione di iniezione (800 V) e il tempo di iniezione (2,0 s) sull'interfaccia software, fare clic sul pulsante di avvio e attendere che i prodotti PCR vengano introdotti elettrodinamicamente nel capillare a 100 V/cm (2,0 s).
NOTA: In questa fase, i prodotti PCR vengono posizionati sull'elettrodo negativo e il tampone viene posizionato sull'elettrodo positivo. - Immettere la tensione CC (800 V) sull'interfaccia software, fare clic sul pulsante di avvio ed eseguire l'elettroforesi a 100 V/cm di intensità del campo elettrico.
NOTA: In questa fase, sia l'elettrodo positivo che quello negativo vengono posizionati con il tampone. - Fare clic sul pulsante di arresto dopo che tutti i frammenti di DNA sono stati separati nel capillare.
- Sciacquare il capillare con acqua sterilizzata per 1 minuto dopo ogni corsa.
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Representative Results
La Figura 5 rappresenta l'elettroferogramma dei prodotti della PCR e dei marcatori del DNA. La traccia (Figura 5A) è il risultato CE del prodotto amplificato CF-PCR, la traccia (Figura 5B) è il risultato CE del prodotto amplificato dal ciclo termico e la traccia (Figura 5C) è il risultato CE della scala del DNA a 100 bp. Per prima cosa abbiamo amplificato il gene bersaglio di E. coli nel sistema CF-PCR; la soluzione PCR ha impiegato ~10 minuti e 30 secondi dall'ingresso all'uscita del chip. La dimensione dell'amplicone bersaglio di E. coli era di 544 bp. I prodotti PCR amplificati sono stati analizzati nel sistema CE e nelle stesse condizioni sperimentali è stata eseguita anche la CE di una scala di DNA da 100 bp. La dimensione del prodotto PCR può essere valutata in base all'elettroferogramma della scala del DNA. Ogni esperimento è stato eseguito tre volte per verificarne la riproducibilità. I dati nella Figura 5 mostrano che i picchi corrispondenti ai prodotti PCR di E. coli sono stati osservati dopo la separazione e i tempi di migrazione dei prodotti PCR nel chip microfluidico erano coerenti con quelli in un termociclatore.
Figura 1: Il wafer di silicio pulito. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il chip microfluidico CF-PCR realizzato utilizzando PDMS. I microcanali sono stati riempiti con inchiostro rosso per la visualizzazione. Barra della scala = 1 cm. Abbreviazioni: CF-PCR = PCR a flusso continuo; PDMS = polidimetisilossano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il sistema CF-PCR. (1) chip microfluidico, (2) riscaldatore ceramico PTC, (3) siringa, (4) pompa, (5) tubo in silicone, (6) fessura, (7) ago in acciaio, (8) puntale per pipetta, (9) regolatore di temperatura PID, (10) sensore di temperatura, (11) relè a stato solido. Abbreviazione: CF-PCR = PCR a flusso continuo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La costruzione del sistema CE. Abbreviazioni: CE = elettroforesi capillare; PMT = tubo fotomoltiplicatore; A1, A2 = filtri; B = lente di campo; C = specchio dicroico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'elettroferogramma di Escherichia coli. Amplificazione mediante (A) chip microfluidico CF-PCR, (B) termociclatore PCR tradizionale e (C) marcatori del DNA. Abbreviazione: CF-PCR = PCR a flusso continuo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Bersaglio | Sequenza 5′...... 3′ | Amplicone (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTTTTTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabella 1: Primer impiegati per Escherichia coli. Abbreviazioni: EC = Escherichia coli; F = avanti; R = inverso.
| Buffer veloce 10x I | 5,0 μL |
| Miscela di dNTP (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA Polimerasi | 0,25 μL |
| polivinilpirrolidone (PVP) | 3,5 μL |
| Tween 20 | 1,5 μL |
| sagoma | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| acqua ultrapura | 33,75 μL |
Tabella 2: I componenti della soluzione PCR. Abbreviazioni: EC = Escherichia coli; F = avanti; R = inverso.
File supplementare 1: file STL per la stampa 3D. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
Sia la PCR che la CE sono due biotecnologie popolari nell'analisi degli acidi nucleici. Questo documento descrive l'amplificazione di E. coli e la rilevazione dei prodotti PCR utilizzando i sistemi CF-PCR e CE, entrambi costruiti internamente. Il gene bersaglio di E. coli è stato amplificato con successo entro 10 minuti a causa delle elevate velocità di trasferimento del calore. I frammenti di DNA più piccoli di 1.500 bp sono stati separati entro 8 minuti (Figura 5). Il grande vantaggio di queste due tecniche è che possono far risparmiare molto tempo rispetto ai tradizionali metodi di PCR ed elettroforesi su gel lastra. I ricercatori dovrebbero tenere presente che il chip microfluidico CF-PCR deve essere pulito dopo l'uso e il sistema CE deve essere costruito in una casa pulita e nera per evitare la contaminazione dei campioni. Il sistema CF-PCR basato sul chip microfluidico e il sistema CE introdotto in questo lavoro sono facili da fabbricare e possono offrire un metodo semplice per l'analisi degli acidi nucleici in laboratorio. Tuttavia, un limite della CF-PCR è che può amplificare e rilevare solo un campione alla volta, il che può limitarne l'ampia applicazione; per contrastare questo problema, gli utenti possono sviluppare il chip microfluidico integrato CF-PCR e CE array per risolvere questo problema. La piattaforma riportata in questo lavoro ha un grande potenziale di applicazione nel campo della diagnosi clinica delle malattie infettive e della ricerca sugli acidi nucleici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione per la Scienza e la Tecnologia della Municipalità di Shanghai, in Cina (n. 19ZR1477500 e n. 18441900400). Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dell'Università di Shanghai per la scienza e la tecnologia (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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