Summary
Dit protocol beschrijft hoe je een continuous-flow-polymeraseketensysteem bouwt op basis van een microfluïdische chip en hoe je een capillair elektroforesesysteem bouwt in het lab. Het presenteert een eenvoudige methode voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium.
Abstract
Polymerasekettingreactie (PCR) is een traditionele methode die wordt gebruikt voor de amplificatie van een doelgen dat een belangrijke rol heeft gespeeld in de biomoleculaire diagnostiek. Traditionele PCR is echter zeer tijdrovend vanwege de variatie-efficiëntie bij lage temperaturen. Dit werk stelt een continuous-flow-PCR (CF-PCR) systeem voor op basis van een microfluïdische chip. De versterkingstijd kan aanzienlijk worden verkort door de PCR-oplossing in een microkanaal te laten lopen dat op verwarmers is geplaatst die op verschillende temperaturen zijn ingesteld. Omdat capillaire elektroforese (CE) een ideale manier is om positieve en vals-positieve PCR-producten te onderscheiden, werd bovendien een CE-systeem gebouwd om een efficiënte scheiding van de DNA-fragmenten te bereiken. Dit artikel beschrijft het proces van amplificatie van Escherichia coli (E. coli) door het in eigen huis gebouwde CF-PCR-systeem en de detectie van de PCR-producten door CE. De resultaten tonen aan dat het doelgen van E. coli binnen 10 minuten met succes werd geamplificeerd, wat aangeeft dat deze twee systemen kunnen worden gebruikt voor de snelle amplificatie en detectie van nucleïnezuren.
Introduction
Polymerasekettingreactie (PCR) is een moleculair-biologische techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten te amplificeren, waardoor sporen van DNA honderden miljoenen keren worden versterkt. Het wordt veel gebruikt in klinische diagnose, medisch onderzoek, voedselveiligheid, forensische identificatie en andere gebieden. Het PCR-proces bestaat voornamelijk uit drie stappen: denaturatie bij 90-95 °C, gloeien bij 50-60 °C en extensie bij 72-77 °C. Thermische cycli zijn een belangrijk onderdeel van het PCR-proces; de traditionele PCR thermische cycler is echter niet alleen omvangrijk, maar ook inefficiënt, en heeft ongeveer 40 minuten nodig om 25 cycli te voltooien. Om deze beperkingen te ondervangen, werd in eigen huis een continuous-flow PCR (CF-PCR) systeem gebouwd, gebaseerd op een microfluïdische chip. CF-PCR kan veel tijd besparen door de PCR-oplossing in microkanalen te drijven die op verwarmers bij verschillende temperaturen zijn geplaatst: 1,2,3,4,5.
Omdat capillaire elektroforese (CE) veel voordelen heeft, zoals hoge resolutie, hoge snelheid en uitstekende reproduceerbaarheid 6,7,8,9,10,11, is het een populair hulpmiddel in het laboratorium geworden voor de analyse van nucleïnezuren en eiwitten. De meeste laboratoria, vooral laboratoria in ontwikkelingslanden, kunnen zich deze technologie echter niet veroorloven vanwege de hoge prijs van het CE-instrument. Hierin hebben we protocollen geschetst voor het fabriceren van de CF-PCR microfluïdische chip en het bouwen van een veelzijdig CE-systeem in het laboratorium. We demonstreren ook het proces van amplificatie van E. coli door dit CF-PCR-systeem en de detectie van de PCR-producten door het CE-systeem. Door de procedures te volgen die in dit protocol worden beschreven, zouden gebruikers in staat moeten zijn om microfluïdische chips te fabriceren, PCR-oplossingen te bereiden, een CF-PCR-systeem voor nucleïnezuuramplificatie te bouwen en een eenvoudig CE-systeem op te zetten, zelfs met beperkte middelen, om DNA-fragmenten te scheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Fabricage van CF-PCR microfluïdische chip
- Verwarm de siliconenwafel gedurende 25 minuten op 200 °C om het vocht te verwijderen.
- Doseer 1 ml SU-8-2075 fotoresist per inch van de wafer. Draai het op de siliciumwafer met behulp van een spincoater op 500 tpm gedurende 5-10 s met een versnelling van 100 tpm/s, en vervolgens op 2,000 tpm gedurende 30 s met een versnelling van 500 tpm/s.
- Bak de siliconenwafel 3 minuten zacht op 65 °C en vervolgens 15 minuten op 95 °C.
- Stel 150 - 215 mJ/cm² in als belichtingsenergie voor de fotolithografiemachine en graveer het ontworpen patroon op de fotoresist met een fotolithografiemasker. Plaats de siliciumwafel en het masker klaar voor belichting.
- Bak de siliciumwafel na blootstelling 2 minuten op 65 °C en vervolgens 7 minuten op 95 °C.
- Dompel de siliciumwafer onder in ontwikkelaarsoplossing om overtollig fotoresist te verwijderen en verwijder het wanneer de microkanalen te zien zijn (Figuur 1). Gebruik isopropanol om de resterende ontwikkelaarsoplossing af te spoelen.
- Meng het polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeer en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1. Giet de gemengde PDMS-oplossing in de replicavorm en laat deze gedurende 60 minuten stollen bij 80 °C.
- Bind de PDMS-microfluïdische chip na activering op een objectglaasje met behulp van een plasmareiniger en laat ze zo snel mogelijk stollen bij 80 °C gedurende 30 minuten (Figuur 2).
NOTITIE: De buitenafmetingen van de chip zijn 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Er zijn 40 kronkelige kanalen (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, breedte × lengte × diepte) in de microfluïdische chip.
2. Bereiding van de PCR-oplossing
- Ontdooi de reagentia volledig voor configuratie. Gebruik een vortexmixer en centrifugeer om ervoor te zorgen dat de reagentia goed gemengd zijn.
- Bereid een centrifugebuis voor en voeg de volgende componenten in deze volgorde toe: 33,75 μL water, 1,0 μL DNA-sjabloon, 0,5 μL primer, 5,0 μL buffer, 4,0 μL dNTP-mengsel, 1,5 μL Tween 20, 3,5 μL PVP en tenslotte 0,25 μL DNA-polymerase.
OPMERKING: Hier is het gebruikte DNA-sjabloon E. coli. De primers voor E. coli en de componenten van de PCR-oplossing staan vermeld in respectievelijk tabel 1 en tabel 2. - Meng de oplossing door middel van vortexen.
3. Bouw van het CF-PCR systeem
- Bereid twee keramische verwarmers met positieve temperatuurcoëfficiënt (PTC), twee solid-state relais, twee PID-temperatuurregelaars, twee temperatuursensoren en een netsnoer voor.
NOTITIE: De grootte van de PTC-keramische verwarmers is afhankelijk van de grootte van de microfluïdische chip; de lengte moet groter zijn dan de lengte van de chip - de lengte-breedte-hoogte van de hier gebruikte PTC-keramische kachels is 10 cm x 2 cm x 0.4 cm. - Sluit de kachel aan op het solid-state relais.
- Sluit het solid-state relais aan op de PID-temperatuurregelaar.
- Bevestig de temperatuursensorsonde aan de onderkant van de twee verwarmers en sluit de terminal aan op de PID-temperatuurregelaar.
- Sluit twee solid-state relais in serie aan en sluit het netsnoer aan.
- 3D-print een sleuf voor de twee kachels en houd de kachels op hetzelfde vlak (zie aanvullend bestand 1 voor STL-bestanden die nodig zijn voor 3D-printen).
NOTITIE: Laat een luchtspleet van 12 mm tussen de twee kachels. - Plaats de microfluïdische chip op de twee verwarmers.
- Bereid een spuitpomp en een spuit voor, bevestig de spuit op de spuitpomp, sluit een siliconenslang (0.8 mm binnendiameter [ID]) aan op een spuit en sluit een stalen naald (0.7 mm ID) aan op de bovenkant van de siliconenslang (Figuur 3).
- Steek de stalen naald in de inlaat van de microfluïdische chip.
- Plaats een pipetpunt bij de uitgang van de chip om de PCR-producten op te vangen.
4. Bouw van het CE-systeem
- Gebruik een hoogspanningsvoeding om een elektrisch veld met een pulserend veld op te wekken; Let op de positieve en negatieve elektroden.
- Gebruik een kwiklamp als lichtbron en filter de excitatiegolflengte van de kwiklamp door een filter.
- Plaats het capillair op de microscooptafel.
- Verzamel de fluorescentie-emissie met het objectief en detecteer deze vervolgens met behulp van een R928-fotomultiplicatorbuis (PMT). Observeer de microscoop en het capillair. Doe het licht aan in donkere kameromstandigheden; Excitatielicht wordt opgevangen door het objectief.
- Gebruik de zelf ontwikkelde LABVIEW-software om de stroomvoorziening te regelen en de data-acquisitie te voltooien (beschreven in stap 6.3-6.6). Zie https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in een donkere kamer en het schema van het CE-systeem is weergegeven in figuur 4.
5. Voer de PCR-oplossing uit
- Stel de temperatuur van de verwarmers van het CF-PCR-systeem vooraf in op 65 °C en 95 °C.
- Plaats de microfluïdische chip op de twee verwarmingsblokken.
- Steek de punt van het siliconenslangetje in een centrifugebuisje met 50 μl PCR-oplossing (uit stap 2.3). Trek aan de zuiger van de spuit om de oplossing langzaam op te zuigen. Bevestig de spuit op een spuitpomp. Steek de stalen naald in de inlaat van de microfluïdische chip.
- Stel het debiet van de pomp in op 10 μL/min en druk op de startknop om de oplossing in het microkanaal bij de inlaat van de microchip te duwen.
- Verzamel de PCR-producten aan de uitgang van de microfluïdische chip.
NOTITIE: Spoel het kanaal voor en na de PCR af met ultrapuur water om onzuiverheden te verwijderen.
6. Detectie van de PCR-producten door dit in eigen huis gebouwde CE-systeem
- Maak een capillair met een totale lengte van 8 cm en een effectieve lengte van 6 cm.
- Bereid de scheidingsbuffer voor door 100 μl 1% hydroxyethylcellulose (HEC, w/v), 2 μl 100x SYBR Green I en 98 μl ultrapuur water te mengen om 0,5% HEC (m/v) met 1x SYBR Green I te verkrijgen.
- Vul het capillair met de voorbereide scheidingsbuffer met behulp van een vacuümpomp.
- Voer de injectiespanning (800 V) en de injectietijd (2.0 s) in op de software-interface, klik op de startknop en wacht tot de PCR-producten elektrodynamisch in het capillair zijn ingebracht met 100 V/cm (2.0 s).
OPMERKING: In deze stap worden de PCR-producten op de negatieve elektrode geplaatst en wordt de buffer op de positieve elektrode geplaatst. - Voer de gelijkspanning (800 V) in op de software-interface, klik op de startknop en voer de elektroforese uit met een elektrische veldsterkte van 100 V/cm.
OPMERKING: In deze stap worden zowel de positieve als de negatieve elektroden met buffer geplaatst. - Klik op de stopknop nadat alle DNA-fragmenten in het capillair zijn gescheiden.
- Spoel het capillair na elke run gedurende 1 minuut met gesteriliseerd water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 5 geeft het elektroferogram van de PCR-producten en de DNA-markers weer. Trace (Figuur 5A) is het CE-resultaat van het CF-PCR-geamplificeerde product, trace (Figuur 5B) is het CE-resultaat van het product geamplificeerd door thermische cycli en trace (Figuur 5C) is het CE-resultaat van de 100 bp DNA-ladder. We hebben eerst het doelgen van E. coli geamplificeerd in het CF-PCR-systeem; de PCR-oplossing duurde ~10 min, 30 s van de inlaat tot de uitlaat van de chip. De grootte van het doelamplicon van E. coli was 544 bp. De geamplificeerde PCR-producten werden geanalyseerd in het CE-systeem en CE van een DNA-ladder van 100 bp werd ook uitgevoerd onder dezelfde experimentele omstandigheden. De grootte van het PCR-product kan worden geëvalueerd aan de hand van het elektroferogram van de DNA-ladder. Elk experiment werd drie keer uitgevoerd op reproduceerbaarheid. De gegevens in figuur 5 laten zien dat de pieken die overeenkomen met de PCR-producten van E. coli werden waargenomen na scheiding, en dat de migratietijden van de PCR-producten in de microfluïdische chip consistent waren met die in een thermische cycler.
Figuur 1: De gereinigde siliciumwafel. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De CF-PCR microfluïdische chip gemaakt met behulp van PDMS. De microkanaaltjes werden gevuld met rode inkt voor visualisatie. Schaalbalk = 1 cm. Afkortingen: CF-PCR = continuous-flow-PCR; PDMS = polydimethysiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het CF-PCR-systeem. (1) Microfluïdische chip, (2) PTC keramische verwarmer, (3) spuit, (4) pomp, (5) siliconen slang, (6) sleuf, (7) stalen naald, (8) pipetpunt, (9) PID-temperatuurregelaar, (10) temperatuursensor, (11) solid-state relais. Afkorting: CF-PCR = continuous-flow-PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De opbouw van het CE-systeem. Afkortingen: CE = capillaire elektroforese; PMT = fotomultiplicatorbuis; A1, A2 = filters; B = veldlens; C = dichroïsche spiegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het elektroferogram van Escherichia coli. Amplificatie door (A) CF-PCR microfluïdische chip, (B) traditionele PCR thermische cycler en (C) DNA-markers. Afkorting: CF-PCR = continuous-flow-PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Doel | Sequentie 5′...... 3′ | Amplicon (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabel 1: Primers gebruikt voor Escherichia coli. Afkortingen: EC = Escherichia coli; F = vooruit; R = achteruit.
| 10x Snelle Buffer I | 5,0 μL |
| dNTP-mengsel (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA-polymerase | 0,25 μL |
| polyvinylpyrrolidon (PVP) | 3,5 μL |
| Tween 20 | 1,5 μL |
| sjabloon | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| ultrapuur water | 33,75 μL |
Tabel 2: De bestanddelen van de PCR-oplossing. Afkortingen: EC = Escherichia coli; F = vooruit; R = achteruit.
Aanvullend bestand 1: STL-bestand voor 3D-printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zowel PCR als CE zijn twee populaire biotechnologieën bij de analyse van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft de amplificatie van E. coli en de detectie van de PCR-producten met behulp van de CF-PCR- en CE-systemen, beide in eigen huis gebouwd. Het doelgen van E. coli werd binnen 10 minuten met succes geamplificeerd vanwege de hoge warmteoverdrachtssnelheden. De DNA-fragmenten kleiner dan 1.500 bp werden binnen 8 minuten gescheiden (Figuur 5). Het grote voordeel van deze twee technieken is dat het veel tijd kan besparen in vergelijking met de traditionele PCR- en plakgelelektroforesemethoden. Onderzoekers moeten er rekening mee houden dat de CF-PCR-microfluïdische chip na gebruik moet worden schoongemaakt en dat het CE-systeem in een schoon en zwart huis moet worden gebouwd om besmetting van monsters te voorkomen. Het CF-PCR-systeem op basis van de microfluïdische chip en het CE-systeem dat in dit werk is geïntroduceerd, zijn eenvoudig te fabriceren en kunnen een eenvoudige methode bieden voor de analyse van nucleïnezuren in het laboratorium. Een beperking van CF-PCR is echter dat het slechts één monster tegelijk kan amplificeren en detecteren, wat de brede toepassing ervan kan beperken; om dit tegen te gaan, kunnen gebruikers de geïntegreerde CF-PCR en CE array microfluïdische chip ontwikkelen om dit probleem op te lossen. Het platform dat in dit werk wordt gerapporteerd, heeft een groot potentieel voor toepassing op het gebied van klinische diagnose van infectieziekten en nucleïnezuuronderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai, China (nr. 19ZR1477500 en nr. 18441900400). We zijn dankbaar voor de financiële steun van de Universiteit van Shanghai voor Wetenschap en Technologie (nr. 2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
