В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. В ней представлен простой метод анализа нуклеиновых кислот в лабораторных условиях.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это традиционный метод, используемый для амплификации гена-мишени, который играет важную роль в биомолекулярной диагностике. Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР (МФ-ПЦР) на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры. Более того, поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) является идеальным способом дифференциации положительных и ложноположительных продуктов ПЦР, была создана система КЭ для достижения эффективного разделения фрагментов ДНК. В данной работе описан процесс амплификации Escherichia coli (E. coli) собственной системой CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью КЭ. Результаты показывают, что ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, что указывает на то, что эти две системы могут быть использованы для быстрой амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК, тем самым амплифицируя следовые количества ДНК в сотни миллионов раз. Он широко используется в клинической диагностике, медицинских исследованиях, безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской идентификации и других областях. Процесс ПЦР в основном состоит из трех этапов: денатурация при 90-95 °C, отжиг при 50-60 °C и растяжение при 72-77 °C. Термоциклирование является важной частью процесса ПЦР; однако традиционный ПЦР-амплификатор не только громоздкий, но и неэффективный, ему требуется около 40 минут для завершения 25 циклов. Для преодоления этих ограничений была создана собственная система непрерывной ПЦР (CF-PCR) на основе микрофлюидного чипа. CF-PCR может значительно сэкономить время, загоняя раствор ПЦР в микроканалы, размещенные на нагревателях при различных температурах 1,2,3,4,5.
Поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) имеет много преимуществ, таких как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость 6,7,8,9,10,11, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории. Мы также демонстрируем процесс амплификации E. coli с помощью этой системы CF-PCR и обнаружения продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить растворы для ПЦР, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК.
И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация E. coli и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 мин ?…
The authors have nothing to disclose.
Работа выполнена при поддержке Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая, Китай (No 19ZR1477500 и No 18441900400). Выражаем благодарность за финансовую поддержку со стороны Шанхайского университета науки и технологий (No2017KJFZ049).
100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN | Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |