Summary
В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. В ней представлен простой метод анализа нуклеиновых кислот в лабораторных условиях.
Abstract
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это традиционный метод, используемый для амплификации гена-мишени, который играет важную роль в биомолекулярной диагностике. Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР (МФ-ПЦР) на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры. Более того, поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) является идеальным способом дифференциации положительных и ложноположительных продуктов ПЦР, была создана система КЭ для достижения эффективного разделения фрагментов ДНК. В данной работе описан процесс амплификации Escherichia coli (E. coli) собственной системой CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью КЭ. Результаты показывают, что ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, что указывает на то, что эти две системы могут быть использованы для быстрой амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.
Introduction
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК, тем самым амплифицируя следовые количества ДНК в сотни миллионов раз. Он широко используется в клинической диагностике, медицинских исследованиях, безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской идентификации и других областях. Процесс ПЦР в основном состоит из трех этапов: денатурация при 90-95 °C, отжиг при 50-60 °C и растяжение при 72-77 °C. Термоциклирование является важной частью процесса ПЦР; однако традиционный ПЦР-амплификатор не только громоздкий, но и неэффективный, ему требуется около 40 минут для завершения 25 циклов. Для преодоления этих ограничений была создана собственная система непрерывной ПЦР (CF-PCR) на основе микрофлюидного чипа. CF-PCR может значительно сэкономить время, загоняя раствор ПЦР в микроканалы, размещенные на нагревателях при различных температурах 1,2,3,4,5.
Поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) имеет много преимуществ, таких как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость 6,7,8,9,10,11, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории. Мы также демонстрируем процесс амплификации E. coli с помощью этой системы CF-PCR и обнаружения продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить растворы для ПЦР, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе.
1. Изготовление микрофлюидного чипа CF-PCR
- Нагрейте кремниевую пластину до 200 °C в течение 25 минут, чтобы удалить влагу.
- Дозируйте 1 мл фоторезиста SU-8-2075 на дюйм пластины. Отжим его на кремниевой пластине с помощью машины для нанесения отжима при 500 об/мин в течение 5-10 с ускорением 100 об/мин, а затем при 2 000 об/мин в течение 30 с ускорением 500 об/с.
- Выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 3 минут, затем при температуре 95 °C в течение 15 минут.
- Установите 150 - 215 мДж/см² в качестве энергии экспозиции для фотолитографического аппарата и выгравируйте разработанный рисунок на фоторезисте с помощью фотолитографической маски. Поместите кремниевую пластину и маску, готовые к экспонированию.
- После выдержки выпекайте кремниевую пластину при температуре 65 °C в течение 2 минут, а затем при температуре 95 °C в течение 7 минут.
- Погрузите кремниевую пластину в раствор проявителя, чтобы удалить излишки фоторезиста, и выньте его, когда микроканалы станут видны (рис. 1). Используйте изопропанол, чтобы смыть остатки раствора проявителя.
- Смешайте преполимер полидиметилсилоксана (ПДМС) и отвердитель в соотношении 10:1. Вылейте смешанный раствор PDMS в реплику формы и затвердейте при 80 °C в течение 60 минут.
- Приклейте микрофлюидный чип PDMS к предметному стеклу после активации с помощью плазменного очистителя и как можно скорее затвердейте при 80 °C в течение 30 минут (рис. 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние размеры чипа составляют 80,0 мм × 30,0 мм × 0,4 мм. В микрофлюидном чипе имеется 40 змеевидных каналов (100 мкм × 1,46 мм × 100 мкм, ширина × длина × глубина).
2. Приготовление ПЦР-раствора
- Полностью разморозьте реагенты перед конфигурацией. Используйте вихревой смеситель и центрифугу, чтобы убедиться, что реагенты хорошо перемешаны.
- Подготовьте центрифужную пробирку, добавив следующие компоненты в следующем порядке: 33,75 мкл воды, 1,0 мкл матрицы ДНК, 0,5 мкл праймера, 5,0 мкл буфера, 4,0 мкл смеси dNTP, 1,5 мкл Tween 20, 3,5 мкл PVP и, наконец, 0,25 мкл ДНК-полимеразы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется матрица ДНК E. coli. Праймеры для E. coli и компоненты ПЦР-раствора перечислены в таблице 1 и таблице 2 соответственно. - Перемешайте раствор путем вихряния.
3. Построение системы CF-PCR
- Подготовьте два керамических нагревателя с положительным температурным коэффициентом (PTC), два твердотельных реле, два ПИД-регулятора температуры, два датчика температуры и шнур питания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер керамических нагревателей PTC зависит от размера микрофлюидной стружки; длина должна быть больше, чем длина стружки - длина-ширина-высота используемых здесь керамических нагревателей PTC составляет 10 см x 2 см x 0,4 см. - Подключите нагреватель к твердотельному реле.
- Подключите твердотельное реле к ПИД-регулятору температуры.
- Прикрепите датчик датчика температуры к нижней части двух нагревателей и подсоедините клемму к ПИД-регулятору температуры.
- Соедините два твердотельных реле последовательно и подключите шнур питания.
- Напечатайте на 3D-принтере паз для двух нагревателей и держите нагреватели в одной плоскости (см. Дополнительный файл 1 для файлов STL, необходимых для 3D-печати).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте воздушный зазор 12 мм между двумя нагревателями. - Поместите микрофлюидный чип на два нагревателя.
- Подготовьте шприцевой насос и шприц, закрепите шприц на шприцевом насосе, соедините силиконовую трубку (внутренний диаметр 0,8 мм [ID]) со шприцем и подсоедините стальную иглу (внутренний диаметр 0,7 мм) к верхней части силиконовой трубки (рисунок 3).
- Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
- Поместите наконечник пипетки на выходе чипа для сбора продуктов ПЦР.
4. Построение системы CE
- Использовать высоковольтный источник питания для создания электрического поля импульсного поля; Обратите внимание на положительный и отрицательный электроды.
- Используйте ртутную лампу в качестве источника света и отфильтруйте длину волны возбуждения от ртутной лампы через фильтр.
- Поместите капилляр на предметный столик микроскопа.
- Соберите флуоресцентное излучение с помощью объектива, а затем зафиксируйте его с помощью фотоумножителя R928 (ФЭУ). Наблюдайте за микроскопом и капилляром. Включайте свет в условиях темного помещения; Возбуждающий свет собирается объективом.
- Используйте программное обеспечение LABVIEW собственной разработки для управления источником питания и завершения сбора данных (описано в шагах 6.3-6.6). Смотрите https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в темной комнате, а схема системы CE показана на рисунке 4.
5. Запустите ПЦР-раствор
- Предварительно установите температуру нагревателей системы CF-PCR на уровне 65 °C и 95 °C.
- Поместите микрофлюидный чип на два нагревательных блока.
- Вставьте кончик силиконовой пробирки в центрифужную пробирку, содержащую 50 мкл раствора ПЦР (с шага 2.3). Потяните за поршень шприца, чтобы медленно извлечь раствор. Зафиксируйте шприц на шприцевом насосе. Вставьте стальную иглу во входное отверстие микрофлюидной стружки.
- Установите расход насоса на 10 мкл/мин и нажмите кнопку запуска , чтобы протолкнуть раствор в микроканале на входе микрочипа.
- Соберите продукты ПЦР на выходе из микрофлюидного чипа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте канал сверхчистой водой до и после ПЦР для удаления примесей.
6. Обнаружение продуктов ПЦР с помощью собственной системы CE
- Подготовьте капилляр общей длиной 8 см и эффективной длиной 6 см.
- Приготовьте разделительный буфер, смешав 100 мкл 1% гидроксиэтилцеллюлозы (HEC, w/v), 2 мкл 100x SYBR Green I и 98 мкл сверхчистой воды для получения 0,5% HEC (w/v), содержащего 1x SYBR Green I.
- Заполните капилляр подготовленным буфером сепарации с помощью вакуумного насоса.
- Введите напряжение впрыска (800 В) и время впрыска (2,0 с) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и дождитесь электродинамического введения продуктов ПЦР в капилляр при 100 В/см (2,0 с).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе продукты ПЦР помещаются на отрицательный электрод, а буфер помещается на положительный электрод. - Введите напряжение постоянного тока (800 В) в программном интерфейсе, нажмите кнопку запуска и запустите электрофорез при напряженности электрического поля 100 В/см.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе как положительные, так и отрицательные электроды помещаются с буфером. - Нажмите кнопку «стоп » после того, как все фрагменты ДНК будут разделены в капилляре.
- Промывайте капилляр стерилизованной водой в течение 1 мин после каждого запуска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 5 представлена электроферограмма продуктов ПЦР и ДНК-маркеров. След (Рисунок 5А) – это результат КЭ амплифицированного продукта МФ-ПЦР, след (Рисунок 5В) – результат КЭ продукта, амплифицированного путем термоциклирования, а след (Рисунок 5С) – результат КЭ 100.н. лестницы ДНК. Сначала мы амплифицировали ген-мишень E. coli в системе CF-PCR; раствор ПЦР занимал ~10 мин, 30 с от входа до выхода чипа. Размер ампликона-мишени E. coli составил 544.н. Амплифицированные продукты ПЦР анализировали в системе СЕ, а также проводили КЭ 100.н. лестницы ДНК в тех же экспериментальных условиях. Размер ПЦР-продукта можно оценить по электроферограмме ДНК-лестницы. Каждый эксперимент проводился трижды для воспроизводимости. Данные на рисунке 5 показывают, что пики, соответствующие продуктам ПЦР E. coli, наблюдались после разделения, а время миграции продуктов ПЦР в микрофлюидном чипе соответствовало таковому в термоциклере.
Рисунок 1: Очищенная кремниевая пластина. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микрофлюидный чип CF-PCR, изготовленный с использованием PDMS. Микроканалы были заполнены красными чернилами для визуализации. Масштабная линейка = 1 см. Сокращения: CF-PCR = непрерывная ПЦР; ПДМС = полидиметисилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Система CF-PCR. (1) Микрофлюидный чип, (2) керамический нагреватель PTC, (3) шприц, (4) насос, (5) силиконовая трубка, (6) прорезь, (7) стальная игла, (8) наконечник пипетки, (9) ПИД-регулятор температуры, (10) датчик температуры, (11) твердотельное реле. Аббревиатура: CF-PCR = непрерывная ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Построение системы СЕ. Сокращения: CE = капиллярный электрофорез; ФЭУ = фотоумножитель; A1, A2 = фильтры; B = полевая линза; C = дихроичное зеркало. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Электроферограмма кишечной палочки. Амплификация с помощью (A) микрофлюидного чипа CF-PCR, (B) традиционного ПЦР-амплификатора и (C) маркеров ДНК. Аббревиатура: CF-PCR = непрерывная ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Цель | Последовательность 5′...... 3′ | Ампликон (ад) | ||
| ЕС-Ф | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTTTGCTGAC | 544 | ||
| ЭЦ-Р | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Таблица 1: Праймеры, применяемые для лечения кишечной палочки. Сокращения: EC = Escherichia coli; F = вперед; R = реверс.
| 10-кратный быстрый буфер I | 5,0 мкл |
| Смесь dNTP (2,5 мкМ) | 4,0 мкл |
| ДНК-полимераза SpeedSTAR HS | 0,25 мкл |
| поливинилпирролидон (ПВП) | 3,5 мкл |
| Подросток 20 | 1,5 мкл |
| шаблон | 1,0 мкл |
| ЕС-Ф | 0,5 мкл |
| ЭЦ-Р | 0,5 мкл |
| Сверхчистая вода | 33,75 мкл |
Таблица 2: Компоненты ПЦР-раствора. Сокращения: EC = Escherichia coli; F = вперед; R = реверс.
Дополнительный файл 1: STL-файл для 3D-печати. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация E. coli и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 мин из-за высокой скорости теплопередачи. Фрагменты ДНК размером менее 1500.н. были разделены в течение 8 минут (рис. 5). Большим преимуществом этих двух методов является то, что они могут значительно сэкономить время по сравнению с традиционными методами ПЦР и электрофореза в пластинчатом геле. Исследователи должны иметь в виду, что микрофлюидный чип CF-PCR должен быть очищен после использования, а система CE должна быть построена в чистом и черном доме, чтобы избежать загрязнения образцов. Система CF-PCR на основе микрофлюидного чипа и система CE, представленная в этой работе, просты в изготовлении и могут предложить простой метод анализа нуклеиновых кислот в лаборатории. Однако ограничением CF-PCR является то, что она может амплифицировать и обнаруживать только один образец за раз, что может ограничить ее широкое применение; Чтобы противостоять этому, пользователи могут разработать интегрированный микрофлюидный чип CF-PCR и матрицы CE для решения этой проблемы. Представленная в данной работе платформа имеет большой потенциал применения в области клинической диагностики инфекционных заболеваний и исследования нуклеиновых кислот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая, Китай (No 19ZR1477500 и No 18441900400). Выражаем благодарность за финансовую поддержку со стороны Шанхайского университета науки и технологий (No2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
