Summary

Амплификация кишечной палочки в микрофлюидном чипе непрерывной ПЦР и ее детектирование с помощью системы капиллярного электрофореза

Published: November 21, 2023
doi:

Summary

В этом протоколе описывается, как построить систему непрерывной полимеразной цепи на основе микрофлюидного чипа и как построить систему капиллярного электрофореза в лаборатории. В ней представлен простой метод анализа нуклеиновых кислот в лабораторных условиях.

Abstract

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это традиционный метод, используемый для амплификации гена-мишени, который играет важную роль в биомолекулярной диагностике. Тем не менее, традиционная ПЦР занимает очень много времени из-за эффективности низкотемпературных вариаций. В данной работе предложена система непрерывной ПЦР (МФ-ПЦР) на основе микрофлюидного чипа. Время амплификации можно значительно сократить, запустив раствор ПЦР в микроканал, размещенный на нагревателях, настроенных на различные температуры. Более того, поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) является идеальным способом дифференциации положительных и ложноположительных продуктов ПЦР, была создана система КЭ для достижения эффективного разделения фрагментов ДНК. В данной работе описан процесс амплификации Escherichia coli (E. coli) собственной системой CF-PCR и детектирования продуктов ПЦР с помощью КЭ. Результаты показывают, что ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 минут, что указывает на то, что эти две системы могут быть использованы для быстрой амплификации и обнаружения нуклеиновых кислот.

Introduction

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярной биологии, используемый для амплификации определенных фрагментов ДНК, тем самым амплифицируя следовые количества ДНК в сотни миллионов раз. Он широко используется в клинической диагностике, медицинских исследованиях, безопасности пищевых продуктов, судебно-медицинской идентификации и других областях. Процесс ПЦР в основном состоит из трех этапов: денатурация при 90-95 °C, отжиг при 50-60 °C и растяжение при 72-77 °C. Термоциклирование является важной частью процесса ПЦР; однако традиционный ПЦР-амплификатор не только громоздкий, но и неэффективный, ему требуется около 40 минут для завершения 25 циклов. Для преодоления этих ограничений была создана собственная система непрерывной ПЦР (CF-PCR) на основе микрофлюидного чипа. CF-PCR может значительно сэкономить время, загоняя раствор ПЦР в микроканалы, размещенные на нагревателях при различных температурах 1,2,3,4,5.

Поскольку капиллярный электрофорез (КЭ) имеет много преимуществ, таких как высокое разрешение, высокая скорость и отличная воспроизводимость 6,7,8,9,10,11, он стал популярным инструментом в лаборатории для анализа нуклеиновых кислот и белков. Однако большинство лабораторий, особенно в развивающихся странах, не могут позволить себе эту технологию из-за высокой цены прибора CE. В этой статье мы описали протоколы изготовления микрофлюидного чипа CF-PCR и создания универсальной системы CE в лаборатории. Мы также демонстрируем процесс амплификации E. coli с помощью этой системы CF-PCR и обнаружения продуктов ПЦР с помощью системы CE. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи должны иметь возможность изготавливать микрофлюидные чипы, готовить растворы для ПЦР, создавать систему CF-PCR для амплификации нуклеиновых кислот и настраивать простую систему CE даже с ограниченными ресурсами для разделения фрагментов ДНК.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, реагентам и оборудованию, используемым в этом протоколе. 1. Изготовление микрофлюидного чипа CF-PCR Нагрейте кремниевую пластину до 200 °C в течение …

Representative Results

На рисунке 5 представлена электроферограмма продуктов ПЦР и ДНК-маркеров. След (Рисунок 5А) – это результат КЭ амплифицированного продукта МФ-ПЦР, след (Рисунок 5В) – результат КЭ продукта, амплифицированного путем термоциклирования, а след (Рисунок 5С) –<s…

Discussion

И ПЦР, и КЭ являются двумя популярными биотехнологиями в анализе нуклеиновых кислот. В данной статье описывается амплификация E. coli и выявление продуктов ПЦР с помощью систем CF-PCR и CE, разработанных собственными силами. Ген-мишень E. coli был успешно амплифицирован в течение 10 мин ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Комиссии по науке и технологиям муниципалитета Шанхая, Китай (No 19ZR1477500 и No 18441900400). Выражаем благодарность за финансовую поддержку со стороны Шанхайского университета науки и технологий (No2017KJFZ049).

Materials

100 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3422A
10x Fast Buffer I Takara Bio Inc. RR070A
10x TBE Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. T1051
developer solution Alfa Aesar, USA L15459
dNTP mixture (2.5 μM) Takara Bio Inc. RR070A
EC-F Sangon Biotech, Shanghai, China
EC-R Sangon Biotech, Shanghai, China
HEC,1300K Sigma-Aldrich, USA 9004-62-0
isopropanol Aladdin, Shanghai, China 67-63-0
microscope Olympus, Japan BX51
photolithography  SUSS MicroTec, Germany MJB4
photomultiplier tube  Hamamatsu Photonics, Japan R928
photoresist MicroChem, USA SU-8 2075
PID temperature controllers  Shanghai, China XH-W2023
plasma cleaner  Harrick Plasma PDC-32G-2
polyvinyl pyrrolidone (PVP) Aladdin, Shanghai, China P110608
pump Harvard Apparatus PHD2000
silicone tubing  BIO-RAD,USA 7318210
solid-state relays KZLTD, China KS1-25LA
SpeedSTAR HS DNA Polymerase  Takara Bio Inc. RR070A
steel needle zhongxinqiheng,Suzhou,China
SYBR GREEN Equation 1 Solarbio, Beijing, China SY1020
temperature sensors EasyShining Technology, Chengdu, China TCM-M207
Template (E. coli) Takara Bio Inc. AK601
Tween 20 Aladdin, Shanghai, China T104863
voltage power supply  Medina, NY, USA TREK MODEL 610E

References

  1. Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
  2. Crews, N., Wittwer, C., Gale, B. Continuous-flow thermal gradient PCR. Biomedical Microdevices. 10 (2), 187-195 (2008).
  3. Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
  4. Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
  5. Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
  6. Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 88 (1), 299-319 (2016).
  7. Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
  8. Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
  9. Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
  10. Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
  11. Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).

Play Video

Cite This Article
Dong, W., Tao, C., Yang, B., Miyake, E., Li, Z., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System. J. Vis. Exp. (201), e63523, doi:10.3791/63523 (2023).

View Video