Summary
Ce protocole décrit comment construire un système de chaîne polymérase à flux continu basé sur une puce microfluidique et comment construire un système d’électrophorèse capillaire en laboratoire. Il présente une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire.
Abstract
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode traditionnelle utilisée pour l’amplification d’un gène cible qui a joué un rôle important dans le diagnostic biomoléculaire. Cependant, la PCR traditionnelle prend beaucoup de temps en raison de l’efficacité de la faible variation de température. Ce travail propose un système de PCR en flux continu (CF-PCR) basé sur une puce microfluidique. Le temps d’amplification peut être considérablement réduit en faisant passer la solution PCR dans un microcanal placé sur des réchauffeurs réglés à différentes températures. De plus, comme l’électrophorèse capillaire (EC) est un moyen idéal de différencier les produits de PCR positifs et faussement positifs, un système CE a été construit pour obtenir une séparation efficace des fragments d’ADN. Cet article décrit le processus d’amplification d’Escherichia coli (E. coli) par le système CF-PCR construit en interne et la détection des produits PCR par CE. Les résultats démontrent que le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes, ce qui indique que ces deux systèmes peuvent être utilisés pour l’amplification et la détection rapides des acides nucléiques.
Introduction
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier des fragments d’ADN spécifiques, amplifiant ainsi des traces d’ADN des centaines de millions de fois. Il a été largement utilisé dans le diagnostic clinique, la recherche médicale, la sécurité alimentaire, l’identité médico-légale et d’autres domaines. Le processus de PCR se compose principalement de trois étapes : la dénaturation à 90-95 °C, le recuit à 50-60 °C et l’extension à 72-77 °C. Le cycle thermique est une partie importante du processus de PCR ; cependant, le thermocycleur PCR traditionnel est non seulement encombrant mais aussi inefficace, nécessitant environ 40 minutes pour effectuer 25 cycles. Pour pallier ces limitations, un système de PCR à flux continu (CF-PCR) a été construit en interne, basé sur une puce microfluidique. La CF-PCR permet de gagner beaucoup de temps en conduisant la solution PCR dans des microcanaux placés sur des réchauffeurs à différentes températures 1,2,3,4,5.
Comme l’électrophorèse capillaire (EC) présente de nombreux avantages, tels qu’une haute résolution, une vitesse élevée et une excellente reproductibilité 6,7,8,9,10,11, elle est devenue un outil populaire en laboratoire pour l’analyse des acides nucléiques et des protéines. Cependant, la plupart des laboratoires, en particulier ceux des pays en développement, ne peuvent pas se permettre cette technologie en raison du prix élevé de l’instrument CE. Dans cet article, nous avons décrit les protocoles de fabrication de la puce microfluidique CF-PCR et de construction d’un système CE polyvalent en laboratoire. Nous démontrons également le processus d’amplification d’E. coli par ce système CF-PCR et la détection des produits PCR par le système CE. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les utilisateurs devraient être en mesure de fabriquer des puces microfluidiques, de préparer des solutions de PCR, de construire un système CF-PCR pour l’amplification des acides nucléiques et de mettre en place un système CE simple, même avec des ressources limitées, pour séparer les fragments d’ADN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.
1. Fabrication d’une puce microfluidique CF-PCR
- Chauffez la plaquette de silicone à 200 °C pendant 25 min pour éliminer l’humidité.
- Distribuer 1 mL de résine photosensible SU-8-2075 par pouce de plaquette. Essorez-le sur la plaquette de silicium à l’aide d’une machine à enrober à 500 tr/min pendant 5 à 10 s avec une accélération de 100 tr/min, puis à 2 000 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 500 tr/min.
- Faites cuire la gaufrette en silicone à 65 °C pendant 3 min, puis à 95 °C pendant 15 min.
- Définissez 150 - 215 mJ/cm² comme énergie d’exposition pour la machine de photolithographie et gravez le motif conçu sur la résine photosensible avec un masque de photolithographie. Placez la plaquette de silicone et le masque prêts pour l’exposition.
- Après l’exposition, faites cuire la plaquette de silicium à 65 °C pendant 2 min, puis à 95 °C pendant 7 min.
- Plongez la plaquette de silicium dans la solution de révélateur pour éliminer l’excès de résine photosensible et retirez-la lorsque les microcanaux sont visibles (Figure 1). Utilisez de l’isopropanol pour rincer la solution de révélateur résiduelle.
- Mélanger le prépolymère de polydiméthylsiloxane (PDMS) et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 :1. Versez la solution PDMS mélangée dans le moule de réplique et solidifiez-la à 80 °C pendant 60 min.
- Collez la puce microfluidique PDMS sur une lame après activation à l’aide d’un nettoyeur plasma et solidifiez-la à 80 °C pendant 30 min dès que possible (Figure 2).
REMARQUE : Les dimensions extérieures de la puce sont de 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Il y a 40 canaux serpentins (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, largeur × longueur × profondeur) dans la puce microfluidique.
2. Préparation de la solution PCR
- Décongelez complètement les réactifs avant la configuration. Utilisez un mélangeur vortex et une centrifugeuse pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés.
- Préparez un tube à centrifuger, en ajoutant les composants suivants dans cet ordre : 33,75 μL d’eau, 1,0 μL de matrice d’ADN, 0,5 μL d’amorce, 5,0 μL de tampon, 4,0 μL de mélange dNTP, 1,5 μL de Tween 20, 3,5 μL de PVP et enfin 0,25 μL d’ADN polymérase.
REMARQUE : Ici, le modèle d’ADN utilisé est E. coli. Les amorces pour E. coli et les composants de la solution de PCR sont énumérés dans le tableau 1 et le tableau 2, respectivement. - Mélangez la solution par vortex.
3. Construction du système CF-PCR
- Préparez deux réchauffeurs en céramique à coefficient de température positif (PTC), deux relais à semi-conducteurs, deux régulateurs de température PID, deux capteurs de température et un cordon d’alimentation.
REMARQUE : La taille des éléments chauffants en céramique PTC dépend de la taille de la puce microfluidique ; la longueur doit être supérieure à la longueur de la puce - la longueur-largeur-hauteur des radiateurs en céramique PTC utilisés ici est de 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Connectez l’appareil de chauffage au relais à semi-conducteurs.
- Connectez le relais statique au régulateur de température PID.
- Fixez la sonde du capteur de température au bas des deux radiateurs et connectez la borne au régulateur de température PID.
- Connectez deux relais statiques en série et branchez le cordon d’alimentation.
- Imprimez en 3D une fente pour les deux éléments chauffants et maintenez les éléments chauffants sur le même plan (voir le fichier supplémentaire 1 pour les fichiers STL requis pour l’impression 3D).
REMARQUE : Laissez un espace d’air de 12 mm entre les deux radiateurs. - Placez la puce microfluidique sur les deux radiateurs.
- Préparez un pousse-seringue et une seringue, fixez la seringue sur le pousse-seringue, connectez un tube en silicone (diamètre intérieur de 0,8 mm [ID]) à une seringue et connectez une aiguille en acier (diamètre intérieur de 0,7 mm) au sommet du tube en silicone (Figure 3).
- Insérez l’aiguille en acier dans l’entrée de la puce microfluidique.
- Placez une pointe de pipette à la sortie de la puce pour recueillir les produits PCR.
4. Construction du système CE
- Utilisez une alimentation haute tension pour générer un champ électrique pulsé ; Notez les électrodes positives et négatives.
- Utilisez une lampe au mercure comme source de lumière et filtrez la longueur d’onde d’excitation de la lampe au mercure à travers un filtre.
- Placez le capillaire sur la platine du microscope.
- Collectez l’émission de fluorescence avec l’objectif, puis détectez-la à l’aide d’un tube photomultiplicateur R928 (PMT). Observez le microscope et le capillaire. Allumez la lumière dans des conditions de pièce sombre ; La lumière d’excitation est collectée par l’objectif.
- Utilisez le logiciel LABVIEW développé en interne pour contrôler l’alimentation électrique et terminer l’acquisition des données (décrit aux étapes 6.3 à 6.6). Voir https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
REMARQUE : Toutes les expériences ont été réalisées dans une chambre noire, et le schéma du système CE est illustré à la figure 4.
5. Lancez la solution PCR
- Préréglez la température des réchauffeurs du système CF-PCR à 65 °C et 95 °C.
- Placez la puce microfluidique sur les deux blocs chauffants.
- Insérez l’embout du tube en silicone dans un tube à centrifuger contenant 50 μL de solution PCR (à partir de l’étape 2.3). Tirez sur le piston de la seringue pour retirer lentement la solution. Fixez la seringue sur un pousse-seringue. Insérez l’aiguille en acier dans l’entrée de la puce microfluidique.
- Réglez le débit de la pompe sur 10 μL/min et appuyez sur le bouton de démarrage pour pousser la solution dans le microcanal à l’entrée de la micropuce.
- Récupérez les produits PCR à la sortie de la puce microfluidique.
REMARQUE : Rincez le canal avec de l’eau ultra-pure avant et après la PCR pour éliminer les impuretés.
6. Détection des produits PCR par ce système CE construit en interne
- Préparez un capillaire d’une longueur totale de 8 cm et d’une longueur effective de 6 cm.
- Préparer le tampon de séparation en mélangeant 100 μL d’hydroxyéthylcellulose à 1 % (HEC, p/v), 2 μL de 100x SYBR Green I et 98 μL d’eau ultrapure pour obtenir 0,5 % HEC (p/v) contenant 1x SYBR Green I.
- Remplissez le capillaire avec le tampon de séparation préparé à l’aide d’une pompe à vide.
- Entrez la tension d’injection (800 V) et le temps d’injection (2,0 s) sur l’interface logicielle, cliquez sur le bouton de démarrage et attendez que les produits PCR soient introduits électrodynamiquement dans le capillaire à 100 V/cm (2,0 s).
REMARQUE : Dans cette étape, les produits PCR sont placés sur l’électrode négative et le tampon est placé sur l’électrode positive. - Entrez la tension continue (800 V) sur l’interface logicielle, cliquez sur le bouton de démarrage et exécutez l’électrophorèse à 100 V/cm d’intensité de champ électrique.
REMARQUE : Dans cette étape, les électrodes positive et négative sont placées avec un tampon. - Cliquez sur le bouton d’arrêt une fois que tous les fragments d’ADN ont été séparés dans le capillaire.
- Rincez le capillaire avec de l’eau stérilisée pendant 1 min après chaque passage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 5 représente l’électrophérogramme des produits PCR et des marqueurs ADN. La trace (Figure 5A) est le résultat CE du produit amplifié par CF-PCR, la trace (Figure 5B) est le résultat CE du produit amplifié par cyclage thermique, et la trace (Figure 5C) est le résultat CE de l’échelle d’ADN de 100 pb. Nous avons d’abord amplifié le gène cible d’E. coli dans le système CF-PCR ; la solution PCR a pris ~10 min, 30 s de l’entrée à la sortie de la puce. La taille de l’amplicon cible d’E. coli était de 544 pb. Les produits de PCR amplifiés ont été analysés dans le système CE, et l’EC d’une échelle d’ADN de 100 pb a également été réalisée dans les mêmes conditions expérimentales. La taille du produit PCR peut être évaluée en fonction de l’électrophérogramme de l’échelle d’ADN. Chaque expérience a été réalisée trois fois pour la reproductibilité. Les données de la figure 5 montrent que les pics correspondant aux produits PCR d’E. coli ont été observés après séparation, et que les temps de migration des produits PCR dans la puce microfluidique étaient cohérents avec ceux d’un thermocycleur.
Figure 1 : La plaquette de silicium nettoyée. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La puce microfluidique CF-PCR fabriquée à l’aide de PDMS. Les microcanaux ont été remplis d’encre rouge pour la visualisation. Barre d’échelle = 1 cm. Abréviations : CF-PCR = PCR en flux continu ; PDMS = polydiméthysiloxane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le système CF-PCR. (1) puce microfluidique, (2) réchauffeur en céramique PTC, (3) seringue, (4) pompe, (5) tube en silicone, (6) fente, (7) aiguille en acier, (8) pointe de pipette, (9) régulateur de température PID, (10) capteur de température, (11) relais à semi-conducteurs. Abréviation : CF-PCR = PCR en flux continu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : La construction du système CE. Abréviations : CE = électrophorèse capillaire ; PMT = tube photomultiplicateur ; A1, A2 = filtres ; B = lentille de champ ; C = miroir dichroïque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’électrophérogramme d’Escherichia coli. Amplification par (A) puce microfluidique CF-PCR, (B) thermocycleur PCR traditionnel et (C) marqueurs ADN. Abréviation : CF-PCR = PCR en flux continu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Cible | Séquence 5′...... 3′ | Amplicon (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tableau 1 : Amorces utilisées pour Escherichia coli. Abréviations : EC = Escherichia coli ; F = vers l’avant ; R = inverse.
| 10x Tampon rapide I | 5,0 μL |
| Mélange de dNTP (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS ADN POLYMÉRASE | 0,25 μL |
| polyvinylpyrrolidone (PVP) | 3,5 μL |
| Entre 20 ans | 1,5 μL |
| modèle | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| Eau ultra-pure | 33,75 μL |
Tableau 2 : Les composants de la solution PCR. Abréviations : EC = Escherichia coli ; F = vers l’avant ; R = inverse.
Fichier supplémentaire 1 : Fichier STL pour l’impression 3D. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La PCR et l’EC sont deux biotechnologies populaires dans l’analyse des acides nucléiques. Cet article décrit l’amplification d’E. coli et la détection des produits PCR à l’aide des systèmes CF-PCR et CE, tous deux construits à l’interne. Le gène cible d’E. coli a été amplifié avec succès en 10 minutes en raison des taux de transfert de chaleur élevés. Les fragments d’ADN inférieurs à 1 500 pb ont été séparés en 8 minutes (Figure 5). Le grand avantage de ces deux techniques est qu’elles permettent de gagner beaucoup de temps par rapport aux méthodes traditionnelles de PCR et d’électrophorèse sur gel de dalle. Les chercheurs doivent garder à l’esprit que la puce microfluidique CF-PCR doit être nettoyée après utilisation et que le système CE doit être construit dans une maison propre et noire pour éviter la contamination des échantillons. Le système CF-PCR basé sur la puce microfluidique et le système CE introduit dans ce travail sont faciles à fabriquer et peuvent offrir une méthode simple pour l’analyse des acides nucléiques en laboratoire. Cependant, l’une des limites de la CF-PCR est qu’elle ne peut amplifier et détecter qu’un seul échantillon à la fois, ce qui peut limiter son application à grande échelle. Pour contrer cela, les utilisateurs peuvent développer la puce microfluidique intégrée CF-PCR et CE array pour résoudre ce problème. La plate-forme rapportée dans ce travail a un grand potentiel d’application dans le domaine du diagnostic clinique des maladies infectieuses et de la recherche sur les acides nucléiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai, en Chine (n° 19ZR1477500 et n° 18441900400). Nous remercions chaleureusement l’Université de Shanghai pour la science et la technologie (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
