Summary
이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제시합니다.
Abstract
중합효소연쇄반응(PCR)은 생체 분자 진단에서 중요한 역할을 해온 표적 유전자의 증폭에 사용되는 전통적인 방법입니다. 그러나 기존 PCR은 저온 변이 효율로 인해 시간이 많이 걸립니다. 본 연구는 미세유체 칩을 기반으로 하는 연속유동 PCR(CF-PCR) 시스템을 제안한다. 증폭 시간은 PCR 용액을 다른 온도로 설정된 히터에 배치된 마이크로 채널로 실행하여 크게 줄일 수 있습니다. 또한 모세관 전기영동(CE)이 양성 및 위양성 PCR 산물을 구별하는 이상적인 방법이기 때문에 DNA 단편을 효율적으로 분리하기 위해 CE 시스템을 구축했습니다. 본 논문은 자체 제작한 CF-PCR 시스템에 의한 대장균 (E. coli)의 증폭 과정과 CE에 의한 PCR 산물의 검출 과정을 설명합니다. 결과는 대장균 의 표적 유전자가 10분 이내에 성공적으로 증폭되었음을 보여주며, 이는 이 두 시스템이 핵산의 신속한 증폭 및 검출에 사용될 수 있음을 나타냅니다.
Introduction
중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 증폭하는 데 사용되는 분자 생물학 기술로, 미량의 DNA를 수억 번 증폭합니다. 임상 진단, 의학 연구, 식품 안전, 법의학 식별 및 기타 분야에서 널리 사용되었습니다. PCR 공정은 주로 90-95 °C에서 변성, 50-60 °C에서 어닐링, 72-77 °C에서 확장의 세 단계로 구성됩니다. 열 순환은 PCR 과정의 중요한 부분입니다; 그러나, 전통적인 PCR 열 순환기는 뿐만 아니라 부피가 크다, 또한 비효율적이어서, 25의 주기를 완료하는 데 대략 40 분이 요구한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미세유체 칩을 기반으로 하는 연속 흐름 PCR(CF-PCR) 시스템이 사내에 구축되었습니다. CF-PCR은 PCR 용액을 다른 온도 1,2,3,4,5에서 히터에 배치된 마이크로 채널로 구동하여 시간을 크게 절약할 수 있습니다.
모세관 전기영동(CE)은 고분해능, 고속 및 우수한 재현성 6,7,8,9,10,11과 같은 많은 장점이 있기 때문에 핵산 및 단백질 분석을 위한 실험실에서 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 그러나 대부분의 실험실, 특히 개발 도상국의 실험실은 CE 기기의 높은 가격 때문에 이 기술을 감당할 수 없습니다. 여기에서는 CF-PCR 미세유체 칩을 제조하는 방법과 실험실에서 다용도 CE 시스템을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 간략하게 설명했습니다. 또한 이 CF-PCR 시스템에 의한 대장균 증폭 과정과 CE 시스템에 의한 PCR 산물 검출을 시연합니다. 이 프로토콜에 설명된 절차를 따르면 사용자는 미세유체 칩을 제조하고, PCR 용액을 준비하고, 핵산 증폭을 위한 CF-PCR 시스템을 구축하고, 제한된 리소스로도 간단한 CE 시스템을 설정하여 DNA 단편을 분리할 수 있어야 합니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. CF-PCR 미세유체 칩 제작
- 실리콘 웨이퍼를 200°C에서 25분 동안 가열하여 수분을 제거합니다.
- 웨이퍼 인치당 1mL의 SU-8-2075 포토레지스트를 디스펜싱합니다. 100rpm/s의 가속도로 5-10초 동안 5rpm에서 스핀 코터를 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 회전시킨 다음 500rpm/s의 가속도로 30초 동안 2,000rpm에서 회전시킵니다.
- 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 3분 동안 소프트 베이킹한 다음 95°C에서 15분 동안 소프트 베이킹합니다.
- 포토리소그래피 기계의 노광 에너지로 150 - 215 mJ/cm²를 설정하고 포토리소그래피 마스크로 포토레지스트에 디자인된 패턴을 조각합니다. 실리콘 웨이퍼와 마스크를 노출 준비합니다.
- 노출 후 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 2분 동안 구운 다음 95°C에서 7분 동안 굽습니다.
- 실리콘 웨이퍼를 현상액에 담가 과도한 감광액을 제거하고 마이크로 채널이 보일 때 꺼냅니다(그림 1). 이소프로판올을 사용하여 잔류 현상액을 헹굽니다.
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머와 경화제를 10:1의 비율로 혼합합니다. 혼합된 PDMS 용액을 복제 금형에 붓고 80°C에서 60분 동안 응고시킵니다.
- 플라즈마 클리너를 사용하여 활성화 후 슬라이드에 PDMS 미세유체 칩을 접착하고 가능한 한 빨리 80°C에서 30분 동안 응고시킵니다(그림 2).
알림: 칩의 외부 치수는 80.0mm × 30.0mm × 0.4mm입니다. 미세유체 칩에는 40개의 구불구불한 채널(100μm × 1.46mm × 100μm, 너비 × 길이 × 깊이)이 있습니다.
2. PCR 용액의 제조
- 구성하기 전에 시약을 완전히 해동하십시오. 와류 믹서와 원심분리기를 사용하여 시약이 잘 혼합되었는지 확인합니다.
- 물 33.75μL, DNA 템플릿 1.0μL, 프라이머 0.5μL, 완충액 5.0μL, dNTP 혼합물 4.0μL, Tween 20 1.5μL, PVP 3.5μL, 마지막으로 DNA 중합효소 0.25μL의 순서로 원심분리 튜브를 준비합니다.
참고: 여기서 사용된 DNA 템플릿은 대장균입니다. 대장균 에 대한 프라이머 및 PCR 용액의 성분은 각각 표 1 및 표 2에 기재되어 있다. - 소용돌이로 용액을 혼합합니다.
3. CF-PCR 시스템 구축
- 정비례 온도 계수(PTC) 세라믹 히터 2개, 솔리드 스테이트 릴레이 2개, PID 온도 컨트롤러 2개, 온도 센서 2개 및 전원 코드를 준비합니다.
주: PTC 세라믹 히이터의 크기는 microfluidic 칩의 크기에 달려 있습니다; 길이는 칩의 길이보다 커야 합니다-여기에 사용된 PTC 세라믹 히터의 길이-너비-높이는 10cm x 2cm x 0.4cm입니다. - 히터를 솔리드 스테이트 릴레이에 연결합니다.
- 솔리드 스테이트 릴레이를 PID 온도 컨트롤러에 연결합니다.
- 온도 센서 프로브를 두 히터의 바닥에 부착하고 단자를 PID 온도 컨트롤러에 연결합니다.
- 두 개의 솔리드 스테이트 릴레이를 직렬로 연결하고 전원 코드를 연결합니다.
- 두 히터의 슬롯을 3D 인쇄하고 히터를 동일한 평면에 유지합니다(3D 인쇄에 필요한 STL 파일은 보충 파일 1 참조).
알림: 두 히터 사이에 12mm의 에어 갭을 남겨 두십시오. - 두 히터에 미세 유체 칩을 놓습니다.
- 주사기 펌프와 주사기를 준비하고, 주사기를 주사기 펌프에 고정하고, 실리콘 튜브(내경 0.8mm[ID])를 주사기로 연결하고, 강철 바늘(0.7mm ID)을 실리콘 튜브 상단에 연결합니다(그림 3).
- 강철 바늘을 미세 유체 칩의 입구에 삽입합니다.
- 칩의 출구에 피펫 팁을 놓아 PCR 산물을 수집합니다.
4. CE 시스템 구축
- 고전압 전원 공급 장치를 사용하여 펄스 필드 전기장을 생성합니다. 양극과 음극에 유의하십시오.
- 수은 램프를 광원으로 사용하고 필터를 통해 수은 램프의 여기 파장을 필터링합니다.
- 모세관을 현미경 스테이지에 놓습니다.
- 대물렌즈로 형광 방출을 수집한 다음 R928 광전자 증배관(PMT)을 사용하여 검출합니다. 현미경과 모세관을 관찰하십시오. 어두운 방 조건에서 조명을 켜십시오. 여기광은 대물렌즈에 의해 수집됩니다.
- 자체 개발한 LABVIEW 소프트웨어를 사용하여 전원 공급을 제어하고 데이터 수집을 완료합니다 (6.3-6.6 단계에서 설명). https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi 참조.
알림: 모든 실험은 어두운 방에서 수행되었으며 CE 시스템의 회로도는 그림 4에 나와 있습니다.
5. PCR 용액 실행
- CF-PCR 시스템의 히터 온도를 65 °C 및 95 °C로 미리 설정합니다.
- 두 개의 가열 블록에 미세 유체 칩을 놓습니다.
- 실리콘 튜브의 팁을 50μL의 PCR 용액이 들어 있는 원심분리기 튜브에 삽입합니다(2.3단계에서). 주사기 플런저를 당겨 용액을 천천히 빼냅니다. 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다. 강철 바늘을 미세 유체 칩의 입구에 삽입합니다.
- 펌프의 유량을 10μL/min으로 설정하고 시작 버튼을 눌러 마이크로칩 입구의 마이크로채널에서 용액을 밀어 넣습니다.
- 미세유체 칩의 출구에서 PCR 산물을 수집합니다.
알림: PCR 전후에 채널을 초순수로 헹구어 불순물을 제거합니다.
6. 사내에 구축된 이 CE 시스템에 의한 PCR 제품의 검출
- 총 길이 8cm, 유효 길이 6cm의 모세관을 준비합니다.
- 100μL의 1% 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC, w/v), 2μL의 100x SYBR Green I 및 98μL의 초순수를 혼합하여 1x SYBR Green I을 포함하는 0.5% HEC(w/v)를 얻어 분리 완충액을 준비합니다.
- 진공 펌프를 사용하여 준비된 분리 완충액으로 모세관을 채웁니다.
- 소프트웨어 인터페이스에 주입 전압(800V)과 주입 시간(2.0초)을 입력하고 시작 버튼을 클릭한 다음 PCR 산물이 100V/cm(2.0초)의 속도로 모세관에 전기역학적으로 도입될 때까지 기다립니다.
참고: 이 단계에서, PCR 산물은 음극 상에 놓이고, 완충액은 양극 상에 놓인다. - 소프트웨어 인터페이스에 DC 전압(800V)을 입력하고 시작 버튼을 클릭한 다음 100V/cm의 전기장 강도에서 전기영동을 실행합니다.
알림: 이 단계에서는 양극과 음극 모두 완충액과 함께 배치됩니다. - 모든 DNA 조각이 모세관에서 분리된 후 중지 버튼을 클릭합니다.
- 각 실행 후 1분 동안 멸균수로 모세관을 씻어냅니다.
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Representative Results
그림 5는 PCR 산물과 DNA 마커의 전기 페로그램을 나타냅니다. 미량(그림 5A)은 CF-PCR 증폭 산물의 CE 결과이고, 미량(그림 5B)은 열 순환에 의해 증폭된 산물의 CE 결과이며, 미량(그림 5C)은 100bp DNA ladder의 CE 결과입니다. 우리는 먼저 CF-PCR 시스템에서 대장균의 표적 유전자를 증폭했습니다. PCR 용액은 칩의 입구에서 출구까지 ~ 10 분, 30 초가 걸렸습니다. 대장균의 표적 앰플리콘의 크기는 544bp였다. 증폭된 PCR 산물은 CE 시스템에서 분석하고, 100 bp DNA ladder의 CE도 동일한 실험 조건에서 수행하였다. PCR 산물의 크기는 DNA 사다리의 전기 페로그램에 따라 평가할 수 있습니다. 각 실험은 재현성을 위해 세 번 수행되었습니다. 도 5에 있는 자료는 E. coli의 PCR 산물에 대응하는 첨단은 별거 후에 관찰되고, microfluidic 칩에 있는 PCR 산물의 이동 시간은 열 순환기에 있는 것과 일치한다는 것을 보여준다.
그림 1: 세척된 실리콘 웨이퍼. 축척 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PDMS를 사용하여 만든 CF-PCR 미세유체 칩. 마이크로 채널은 시각화를 위해 빨간색 잉크로 채워졌습니다. 눈금 막대 = 1cm. 약어: CF-PCR = 연속 흐름-PCR; PDMS = 폴리디메티실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CF-PCR 시스템. (1) 미세유체 칩, (2) PTC 세라믹 히터, (3) 주사기, (4) 펌프, (5) 실리콘 튜브, (6) 슬롯, (7) 강철 바늘, (8) 피펫 팁, (9) PID 온도 컨트롤러, (10) 온도 센서, (11) 솔리드 스테이트 릴레이. 약어: CF-PCR = continuous-flow-PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CE 시스템의 구성. 약어: CE = 모세관 전기영동; PMT = 광전자 증배관; A1, A2 = 필터; B = 필드 렌즈; C = 이색성 거울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대장균의 전기 페로그램. (A) CF-PCR 미세유체 칩, (B) 기존 PCR 열 순환기 및 (C) DNA 마커에 의한 증폭. 약어: CF-PCR = continuous-flow-PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 과녁 | 시퀀스 5′...... 3′ | 앰플리콘 (bp) | ||
| EC-에프 | 갸아가아그크트그cttctttgctgac | 544 | ||
| EC-R (에코-R) | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
표 1: 대장균에 사용된 프라이머.약어: EC = 대장균; F = 앞으로; R = 역방향.
| 10x 고속 버퍼 I | 5.0 μL |
| dNTP 혼합물(2.5μM) | 4.0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA 중합효소 | 0.25 마이크로리터 |
| 폴리비닐피롤리돈(PVP) | 3.5 μL |
| 트윈 20 | 1.5 μL |
| 템플렛 | 1.0 μL |
| EC-에프 | 0.5 μL |
| EC-R (에코-R) | 0.5 μL |
| 초순수 | 33.75 마이크로리터 |
표 2: PCR 용액의 구성 요소. 약어: EC = 대장균; F = 앞으로; R = 역방향.
보충 파일 1: 3D 인쇄용 STL 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PCR과 CE는 모두 핵산 분석에서 널리 사용되는 두 가지 생명 공학입니다. 이 논문은 사내에 내장된 CF-PCR 및 CE 시스템을 사용하여 대장균 의 증폭과 PCR 산물의 검출에 대해 설명합니다. 대장균 의 표적 유전자는 높은 열 전달 속도 덕분에 10분 이내에 성공적으로 증폭되었습니다. 1,500bp보다 작은 DNA 단편은 8분 이내에 분리되었습니다(그림 5). 이 2개의 기술의 중대한 이점은 매우 전통적인 PCR와 석판 젤 전기 이동법 방법에 비교된 시간을 절약할 수 있다 입니다. 연구원은 CF-PCR 미세유체 칩을 사용 후 세척해야 하며 CE 시스템은 샘플의 오염을 방지하기 위해 깨끗하고 검은 집에 구축되어야 한다는 점을 명심해야 합니다. 미세유체 칩을 기반으로 하는 CF-PCR 시스템과 이 연구에서 소개된 CE 시스템은 제작이 용이하며 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제공할 수 있습니다. 그러나 CF-PCR의 한계는 한 번에 하나의 샘플만 증폭하고 검출할 수 있어 광범위한 적용이 제한될 수 있다는 것입니다. 이에 대응하기 위해 사용자는 통합 CF-PCR 및 CE 어레이 미세유체 칩을 개발하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. 이 연구에서 보고된 플랫폼은 감염성 질환의 임상 진단 및 핵산 연구 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 상하이시 과학기술위원회(No. 19ZR1477500 및 No.18441900400)의 지원을 받았습니다. 상하이 과학 기술 대학 (No.2017KJFZ049)의 재정 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
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- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
