Summary
Detta protokoll beskriver hur man bygger ett polymeraskedjesystem baserat på ett mikrofluidikchip och hur man bygger ett kapillärelektroforessystem i labbet. Den presenterar en enkel metod för analys av nukleinsyror i labbet.
Abstract
Polymeraskedjereaktion (PCR) är en traditionell metod som används för amplifiering av en målgen som har spelat en viktig roll inom biomolekylär diagnostik. Traditionell PCR är dock mycket tidskrävande på grund av den låga temperaturvariationseffektiviteten. Detta arbete föreslår ett CF-PCR-system (Continuous-Flow-PCR) baserat på ett mikrofluidiskt chip. Förstärkningstiden kan minskas avsevärt genom att köra PCR-lösningen i en mikrokanal placerad på värmare inställda på olika temperaturer. Dessutom, eftersom kapillärelektrofores (CE) är ett idealiskt sätt att skilja positiva och falskt positiva PCR-produkter, byggdes ett CE-system för att uppnå effektiv separation av DNA-fragmenten. Detta dokument beskriver processen för amplifiering av Escherichia coli (E. coli) med CF-PCR-systemet som byggts internt och detektionen av PCR-produkterna med CE. Resultaten visar att målgenen för E. coli framgångsrikt amplifierades inom 10 minuter, vilket indikerar att dessa två system kan användas för snabb amplifiering och detektion av nukleinsyror.
Introduction
Polymeraskedjereaktion (PCR) är en molekylärbiologisk teknik som används för att amplifiera specifika DNA-fragment och därigenom förstärka spårmängder av DNA hundratals miljoner gånger. Det har använts i stor utsträckning inom klinisk diagnos, medicinsk forskning, livsmedelssäkerhet, rättsmedicinsk identifiering och andra områden. PCR-processen består huvudsakligen av tre steg: denaturering vid 90–95 °C, glödgning vid 50–60 °C och utvidgning vid 72–77 °C. Termisk cykling är en viktig del av PCR-processen; Den traditionella PCR-termiska cyklerna är dock inte bara skrymmande utan också ineffektiv och kräver cirka 40 minuter för att genomföra 25 cykler. För att övervinna dessa begränsningar byggdes ett PCR-system med kontinuerligt flöde (CF-PCR) internt, baserat på ett mikrofluidiskt chip. CF-PCR kan spara mycket tid genom att driva PCR-lösningen in i mikrokanaler placerade på värmare vid olika temperaturer 1,2,3,4,5.
Eftersom kapillärelektrofores (CE) har många fördelar, såsom hög upplösning, hög hastighet och utmärkt reproducerbarhet 6,7,8,9,10,11, har det blivit ett populärt verktyg i labbet för analys av nukleinsyror och proteiner. De flesta laboratorier, särskilt laboratorier i utvecklingsländerna, har dock inte råd med denna teknik på grund av det höga priset på CE-instrumentet. Här har vi beskrivit protokoll för hur man tillverkar CF-PCR-mikrofluidikchipet och hur man bygger ett mångsidigt CE-system i labbet. Vi demonstrerar också processen för amplifiering av E. coli med detta CF-PCR-system och detektionen av PCR-produkterna med CE-systemet. Genom att följa de procedurer som beskrivs i detta protokoll bör användare kunna tillverka mikrofluidiska chips, förbereda PCR-lösningar, bygga ett CF-PCR-system för nukleinsyraamplifiering och inrätta ett enkelt CE-system, även med begränsade resurser, för att separera DNA-fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Tillverkning av CF-PCR mikrofluidikchip
- Värm kiselskivan vid 200 °C i 25 minuter för att avlägsna fukten.
- Dispensera 1 ml SU-8-2075 fotoresist per tum av skivan. Snurra den på kiselskivan med en spinnbestrykare vid 500 rpm i 5-10 s med en acceleration på 100 rpm/s, och sedan vid 2 000 rpm i 30 s med en acceleration på 500 rpm/s.
- Mjukgrädda kiselskivan i 65 °C i 3 minuter och sedan i 95 °C i 15 minuter.
- Ställ in 150 - 215 mJ/cm² som exponeringsenergi för fotolitografimaskinen och gravera det designade mönstret på fotoresisten med en fotolitografimask. Placera kiselskivan och masken redo för exponering.
- Efter exponeringen, grädda kiselskivan vid 65 °C i 2 minuter och sedan vid 95 °C i 7 minuter.
- Sänk ner kiselskivan i framkallningslösning för att ta bort överflödig fotoresist och ta ut den när mikrokanalerna kan ses (figur 1). Använd isopropanol för att skölja bort framkallningslösningen.
- Blanda prepolymeren av polydimetylsiloxan (PDMS) och härdaren i förhållandet 10:1. Häll den blandade PDMS-lösningen i replikformen och stelna vid 80 °C i 60 minuter.
- Limma fast PDMS-mikrofluidikchipet på ett objektglas efter aktivering med hjälp av en plasmarengörare och stelna dem så snart som möjligt vid 80 °C i 30 minuter (figur 2).
OBS: Chipets yttermått är 80.0 mm × 30.0 mm × 0.4 mm. Det finns 40 serpentinkanaler (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, bredd × längd × djup) i mikrofluidikchipet.
2. Beredning av PCR-lösningen
- Tina reagenserna helt före konfiguration. Använd en virvelblandare och centrifug för att säkerställa att reagenserna är väl blandade.
- Bered ett centrifugrör och tillsätt följande komponenter i denna ordning: 33,75 μL vatten, 1,0 μL DNA-mall, 0,5 μL primer, 5,0 μL buffert, 4,0 μL dNTP-blandning, 1,5 μL Tween 20, 3,5 μL PVP och slutligen 0,25 μL DNA-polymeras.
OBS: Här är DNA-mallen som används E. coli. Primrarna för E. coli och komponenterna i PCR-lösningen anges i tabell 1 respektive tabell 2. - Blanda lösningen genom att virvla.
3. Uppbyggnad av CF-PCR-systemet
- Förbered två keramiska värmare med positiv temperaturkoefficient (PTC), två halvledarreläer, två PID-temperaturregulatorer, två temperatursensorer och en nätsladd.
OBS: Storleken på PTC-keramiska värmare beror på storleken på mikrofluidikchipet; längden bör vara större än chipets längd - längden-bredd-höjden på PTC-keramiska värmare som används här är 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Anslut värmaren till halvledarreläet.
- Anslut halvledarreläet till PID-temperaturregulatorn.
- Fäst temperatursensorsonden på botten av de två värmarna och anslut terminalen till PID-temperaturregulatorn.
- Anslut två solid-state-reläer i serie och anslut nätsladden.
- 3D-printa en plats för de två värmarna och håll värmarna på samma plan (se Tilläggsfil 1 för STL-filer som krävs för 3D-utskrift).
OBS: Lämna en luftspalt på 12 mm mellan de två värmarna. - Placera mikrofluidikchipet på de två värmarna.
- Förbered en sprutpump och en spruta, fäst sprutan på sprutpumpen, anslut en silikonslang (0,8 mm innerdiameter [ID]) med en spruta och anslut en stålnål (0,7 mm ID) till toppen av silikonslangen (Figur 3).
- Sätt in stålnålen i inloppet på mikrofluidchipet.
- Placera en pipettspets vid chipets utlopp för att samla upp PCR-produkterna.
4. Uppbyggnad av CE-systemet
- Använd en högspänningsströmförsörjning för att generera ett pulserande elektriskt fält; Notera de positiva och negativa elektroderna.
- Använd en kvicksilverlampa som ljuskälla och filtrera excitationsvåglängden från kvicksilverlampan genom ett filter.
- Placera kapillären på mikroskopetage.
- Samla in fluorescensemissionen med objektivet och detektera den sedan med hjälp av ett R928 fotomultiplikatorrör (PMT). Observera mikroskopet och kapillären. Tänd ljuset under mörka rumsförhållanden; Excitationsljus samlas in av objektivet.
- Använd den egenutvecklade programvaran LABVIEW för att styra strömförsörjningen och slutföra datainsamlingen (beskrivs i steg 6.3-6.6). Se https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
OBS: Alla experiment utfördes i ett mörkrum och schemat för CE-systemet visas i figur 4.
5. Kör PCR-lösningen
- Förinställ temperaturen på värmarna i CF-PCR-systemet till 65 °C och 95 °C.
- Placera mikrofluidikchipet på de två värmeblocken.
- Sätt in spetsen på silikonröret i ett centrifugrör som innehåller 50 μL PCR-lösning (från steg 2.3). Dra i sprutkolven för att långsamt dra upp lösningen. Fäst sprutan på en sprutpump. Sätt in stålnålen i inloppet på mikrofluidchipet.
- Ställ in pumpens flödeshastighet på 10 μL/min och tryck på startknappen för att trycka in lösningen i mikrokanalen vid mikrochipets inlopp.
- Samla PCR-produkterna vid utloppet av mikrofluidikchipet.
OBS: Skölj kanalen med ultrarent vatten före och efter PCR för att ta bort föroreningar.
6. Detektion av PCR-produkterna med detta CE-system byggt internt
- Förbered en kapillär med en total längd på 8 cm och en effektiv längd på 6 cm.
- Bered separationsbufferten genom att blanda 100 μL 1 % hydroxietylcellulosa (HEC, w/v), 2 μL 100x SYBR Green I och 98 μL ultrarent vatten för att erhålla 0.5 % HEC (w/v) innehållande 1x SYBR Green I.
- Fyll kapillären med den förberedda separationsbufferten med hjälp av en vakuumpump.
- Mata in injektionsspänningen (800 V) och injektionstiden (2.0 s) på programvarugränssnittet, klicka på startknappen och vänta tills PCR-produkterna förs in elektrodynamiskt i kapillären med 100 V/cm (2.0 s).
OBS: I detta steg placeras PCR-produkterna på den negativa elektroden och bufferten placeras på den positiva elektroden. - Mata in DC voltage (800 V) på mjukvarugränssnittet, klicka på startknappen och kör elektroforesen med 100 V/cm elektrisk fältstyrka.
OBS: I detta steg placeras både de positiva och negativa elektroderna med buffert. - Klicka på stoppknappen efter att alla DNA-fragment har separerats i kapillären.
- Spola kapillären med steriliserat vatten i 1 minut efter varje körning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 visar elektroferogrammet för PCR-produkterna och DNA-markörerna. Spår (figur 5A) är CE-resultatet för den CF-PCR-amplifierade produkten, spår (figur 5B) är CE-resultatet för produkten amplifierad genom termisk cykling och spår (figur 5C) är CE-resultatet för 100 bp DNA-stegen. Vi var först med att förstärka målgenen för E. coli i CF-PCR-systemet; PCR-lösningen tog ~10 min, 30 s från inloppet till chipets utlopp. Storleken på målamplicon för E. coli var 544 bp. De amplifierade PCR-produkterna analyserades i CE-systemet, och CE av en 100 bp DNA-stege utfördes också under samma experimentella förhållanden. Storleken på PCR-produkten kan utvärderas enligt DNA-stegens elektroferogram. Varje experiment utfördes tre gånger för reproducerbarhet. Data i figur 5 visar att topparna som motsvarar PCR-produkterna av E. coli observerades efter separering, och migrationstiderna för PCR-produkterna i mikrofluidikchipet överensstämde med den i en termisk cykler.
Figur 1: Den rengjorda kiselskivan. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: CF-PCR-mikrofluidikchipet tillverkat med PDMS. Mikrokanalerna fylldes med rött bläck för visualisering. Skalstreck = 1 cm. Förkortningar: CF-PCR = kontinuerligt-flöde-PCR; PDMS = polydimetysiloxan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CF-PCR-systemet. (1) Microfluidic chip, (2) PTC keramisk värmare, (3) spruta, (4) pump, (5) silikonslang, (6) slits, (7) stålnål, (8) pipettspets, (9) PID-temperaturregulator, (10) temperatursensor, (11) halvledarrelä. Förkortning: CF-PCR = kontinuerligt-flöde-PCR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uppbyggnaden av CE-systemet. Förkortningar: CE = kapillärelektrofores; PMT = fotomultiplikatorrör; A1, A2 = filter; B = fältlins; C = dikroisk spegel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Elektroferogram för Escherichia coli. Amplifiering med (A) CF-PCR mikrofluidiskt chip, (B) traditionell PCR termisk cykler och (C) DNA-markörer. Förkortning: CF-PCR = kontinuerligt-flöde-PCR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Mål | Sekvens 5′...... 3′ | Amplicon (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabell 1: Primers som används för Escherichia coli. Förkortningar: EC = Escherichia coli; F = framåt; R = omvänd.
| 10x snabb buffert I | 5,0 μL |
| dNTP-blandning (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA-polymeras | 0,25 μL |
| polyvinylpyrrolidon (PVP) | 3,5 μL |
| Interpolering 20 | 1,5 μL |
| mall | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| Ultrarent vatten | 33,75 μL |
Tabell 2: Komponenterna i PCR-lösningen. Förkortningar: EC = Escherichia coli; F = framåt; R = omvänd.
Tilläggsfil 1: STL-fil för 3D-utskrift. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både PCR och CE är två populära biotekniker vid analys av nukleinsyror. Detta dokument beskriver amplifieringen av E. coli och detektionen av PCR-produkterna med hjälp av CF-PCR- och CE-systemen, båda byggda internt. Målgenen för E. coli amplifierades framgångsrikt inom 10 minuter på grund av de höga värmeöverföringshastigheterna. DNA-fragment som var mindre än 1 500 bp separerades inom 8 minuter (Figur 5). Den stora fördelen med dessa två tekniker är att de kan spara mycket tid jämfört med de traditionella PCR- och plattgelelektroforesmetoderna. Forskare bör komma ihåg att CF-PCR-mikrofluidikchipet måste rengöras efter användning, och CE-systemet bör byggas i ett rent och svart hus för att undvika kontaminering av prover. CF-PCR-systemet baserat på mikrofluidikchipet och CE-systemet som introduceras i detta arbete är lätta att tillverka och kan erbjuda en enkel metod för analys av nukleinsyror i labbet. En begränsning med CF-PCR är dock att den endast kan amplifiera och detektera endast ett prov åt gången, vilket kan begränsa dess breda tillämpning. För att motverka detta kan användare utveckla det integrerade CF-PCR- och CE-arraymikrofluidikchipet för att lösa detta problem. Plattformen som redovisas i detta arbete har stor potential att tillämpas inom klinisk diagnostik av infektionssjukdomar och nukleinsyraforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr 19ZR1477500 och nr 18441900400). Vi är tacksamma för ekonomiskt stöd från University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
