Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bygger et kontinuerligt flowpolymerasekædesystem baseret på en mikrofluidisk chip, og hvordan man bygger et kapillærelektroforesesystem i laboratoriet. Det præsenterer en enkel metode til analyse af nukleinsyrer i laboratoriet.
Abstract
Polymerasekædereaktion (PCR) er en traditionel metode, der anvendes til amplifikation af et målgen, der har spillet en vigtig rolle i biomolekylær diagnostik. Imidlertid er traditionel PCR meget tidskrævende på grund af variationseffektiviteten ved lave temperaturer. Dette arbejde foreslår et kontinuerligt-flow-PCR (CF-PCR) system baseret på en mikrofluidisk chip. Forstærkningstiden kan reduceres kraftigt ved at køre PCR-opløsningen i en mikrokanal placeret på varmeapparater, der er indstillet til forskellige temperaturer. Da kapillærelektroforese (CE) desuden er en ideel måde at differentiere positive og falsk-positive PCR-produkter på, blev der bygget et CE-system for at opnå effektiv adskillelse af DNA-fragmenterne. Dette papir beskriver processen med amplifikation af Escherichia coli (E. coli) ved hjælp af CF-PCR-systemet, der er indbygget internt, og påvisning af PCR-produkterne ved CE. Resultaterne viser, at målgenet for E. coli blev amplificeret med succes inden for 10 minutter, hvilket indikerer, at disse to systemer kan bruges til hurtig amplifikation og påvisning af nukleinsyrer.
Introduction
Polymerasekædereaktion (PCR) er en molekylærbiologisk teknik, der bruges til at amplificere specifikke DNA-fragmenter og derved forstærke spormængder af DNA hundreder af millioner af gange. Det har været meget udbredt i klinisk diagnose, medicinsk forskning, fødevaresikkerhed, retsmedicinsk identifikation og andre områder. PCR-processen består hovedsageligt af tre trin: denaturering ved 90-95 °C, udglødning ved 50-60 °C og forlængelse ved 72-77 °C. Termisk cykling er en vigtig del af PCR-processen; Den traditionelle termiske PCR-cyklist er dog ikke kun omfangsrig, men også ineffektiv og kræver ca. 40 minutter at gennemføre 25 cyklusser. For at overvinde disse begrænsninger blev der bygget et kontinuerligt flow PCR (CF-PCR) system internt baseret på en mikrofluidisk chip. CF-PCR kan i høj grad spare tid ved at køre PCR-opløsningen ind i mikrokanaler placeret på varmeapparater ved forskellige temperaturer 1,2,3,4,5.
Da kapillærelektroforese (CE) har mange fordele, såsom høj opløsning, høj hastighed og fremragende reproducerbarhed 6,7,8,9,10,11, er det blevet et populært værktøj i laboratoriet til analyse af nukleinsyrer og proteiner. Imidlertid har de fleste laboratorier, især laboratorier i udviklingslandene, ikke råd til denne teknologi på grund af den høje pris på CE-instrumentet. Heri har vi skitseret protokoller for, hvordan man fremstiller CF-PCR-mikrofluidisk chip, og hvordan man bygger et alsidigt CE-system i laboratoriet. Vi demonstrerer også processen med amplifikation af E. coli ved hjælp af dette CF-PCR-system og CE-systemets påvisning af PCR-produkter. Ved at følge procedurerne beskrevet i denne protokol bør brugerne være i stand til at fremstille mikrofluidiske chips, forberede PCR-opløsninger, opbygge et CF-PCR-system til nukleinsyreamplifikation og oprette et simpelt CE-system, selv med begrænsede ressourcer, til at adskille DNA-fragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Fremstilling af CF-PCR mikrofluidisk chip
- Opvarm siliciumskiven ved 200 °C i 25 minutter for at fjerne fugten.
- Dispenser 1 ml SU-8-2075 fotoresist pr. tomme af waferen. Drej den på siliciumskiven ved hjælp af en spincoater ved 500 o / min i 5-10 s med en acceleration på 100 o / s og derefter ved 2,000 o / min i 30 s med en acceleration på 500 o / s / s.
- Soft bage silicium wafer ved 65 ° C i 3 min, derefter ved 95 ° C i 15 min.
- Indstil 150 - 215 mJ/cm² som eksponeringsenergi for fotolitografimaskinen, og gravér det designede mønster på fotoresisten med en fotolitografimaske. Placer siliciumskiven og masken klar til eksponering.
- Efter eksponering bages siliciumskiven ved 65 °C i 2 minutter og derefter ved 95 °C i 7 minutter.
- Dyp siliciumskiven i udvikleropløsningen for at fjerne overskydende fotoresist og tag den ud, når mikrokanalerne kan ses (figur 1). Brug isopropanol til at skylle den resterende udvikleropløsning af.
- Polydimethylsiloxan (PDMS) præpolymer og hærdningsmiddel blandes i forholdet 10:1. Hæld den blandede PDMS-opløsning i kopiformen og størkn den ved 80 °C i 60 minutter.
- Bind PDMS-mikrofluidchippen på et objektglas efter aktivering ved hjælp af en plasmarenser, og størkn dem ved 80 °C i 30 minutter så hurtigt som muligt (figur 2).
BEMÆRK: Chippens ydre mål er 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Der er 40 serpentinkanaler (100 μm × 1,46 mm × 100 μm, bredde × længde × dybde) i den mikrofluidiske chip.
2. Fremstilling af PCR-opløsningen
- Optø reagenserne helt inden konfiguration. Brug en hvirvelblander og centrifuge for at sikre, at reagenserne blandes godt.
- Forbered et centrifugerør, og tilsæt følgende komponenter i denne rækkefølge: 33,75 μL vand, 1,0 μL DNA-skabelon, 0,5 μL primer, 5,0 μL buffer, 4,0 μL dNTP-blanding, 1,5 μL Tween 20, 3,5 μL PVP og endelig 0,25 μL DNA-polymerase.
BEMÆRK: Her er den anvendte DNA-skabelon E. coli. Primerne for E. coli og komponenterne i PCR-opløsningen er anført i henholdsvis tabel 1 og tabel 2. - Bland opløsningen ved hvirvelstrøm.
3. Konstruktion af CF-PCR-systemet
- Forbered to keramiske varmeapparater med positiv temperaturkoefficient (PTC), to solid state-relæer, to PID-temperaturregulatorer, to temperatursensorer og en netledning.
BEMÆRK: Størrelsen på PTC keramiske varmeapparater afhænger af størrelsen på den mikrofluidiske chip; længden skal være større end længden af chippen - længden-bredde-højden af de PTC keramiske varmeapparater, der anvendes her, er 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Tilslut varmelegemet til solid state-relæet.
- Tilslut solid state-relæet til PID-temperaturregulatoren.
- Fastgør temperatursensorsonden til bunden af de to varmeapparater, og tilslut terminalen til PID-temperaturregulatoren.
- Tilslut to solid state-relæer i serie, og tilslut netledningen.
- 3D-print en plads til de to varmeapparater, og hold varmelegemerne på samme plan (se supplerende fil 1 for STL-filer, der kræves til 3D-udskrivning).
BEMÆRK: Efterlad en 12 mm luftspalte mellem de to varmeapparater. - Placer den mikrofluidiske chip på de to varmeapparater.
- Klargør en sprøjtepumpe og en sprøjte, fastgør sprøjten på sprøjtepumpen, tilslut en silikoneslange (0,8 mm indvendig diameter [ID]) med en sprøjte, og tilslut en stålkanyle (0,7 mm ID) til toppen af silikoneslangen (figur 3).
- Indsæt stålnålen i indløbet til den mikrofluidiske chip.
- Placer en pipettespids ved chippens udløb for at opsamle PCR-produkterne.
4. Opbygning af CE-systemet
- Brug en højspændingsstrømforsyning til at generere et pulserende felt elektrisk felt; Bemærk de positive og negative elektroder.
- Brug en kviksølvlampe som lyskilde og filtrer excitationsbølgelængden fra kviksølvlampen gennem et filter.
- Placer kapillæret på mikroskoptrinnet.
- Opsaml fluorescensemissionen med målet, og registrer den derefter ved hjælp af et R928 fotomultiplikatorrør (PMT). Overhold mikroskopet og kapillærrøret. Tænd lyset under mørke rumforhold; excitationslys opsamles af målet.
- Brug den egenudviklede LABVIEW-software til at styre strømforsyningen og fuldføre dataindsamlingen (beskrevet i trin 6.3-6.6). Se https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
BEMÆRK: Alle eksperimenter blev udført i et mørkt rum, og skemaet for CE-systemet er vist i figur 4.
5. Kør PCR-løsningen
- Forindstil temperaturen på varmelegemerne i CF-PCR-systemet til 65 °C og 95 °C.
- Placer den mikrofluidiske chip på de to varmeblokke.
- Spidsen af silikonerøret indsættes i et centrifugeglas indeholdende 50 μL PCR-opløsning (fra trin 2.3). Træk i sprøjtestemplet for langsomt at trække opløsningen ud. Fastgør sprøjten på en sprøjtepumpe. Indsæt stålnålen i indløbet til den mikrofluidiske chip.
- Indstil pumpens flowhastighed til 10 μL/min, og tryk på startknappen for at skubbe opløsningen i mikrokanalen ved mikrochippens indgang.
- Saml PCR-produkterne ved udløbet af den mikrofluidiske chip.
BEMÆRK: Skyl kanalen med ultrarent vand før og efter PCR for at fjerne urenheder.
6. Påvisning af PCR-produkterne ved hjælp af dette CE-system, der er indbygget internt
- Forbered en kapillær med en 8 cm total længde og en 6 cm effektiv længde.
- Forbered separationsbufferen ved at blande 100 μL 1% hydroxyethylcellulose (HEC, w / v), 2 μL 100x SYBR Green I og 98 μL ultrarent vand for at opnå 0,5% HEC (w / v) indeholdende 1x SYBR Green I.
- Fyld kapillærrøret med den forberedte separationsbuffer ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Indtast indsprøjtningsspændingen (800 V) og injektionstiden (2,0 s) på softwaregrænsefladen, klik på startknappen, og vent på, at PCR-produkterne indføres elektrodynamisk i kapillæret ved 100 V / cm (2,0 s).
BEMÆRK: I dette trin placeres PCR-produkterne på den negative elektrode, og bufferen placeres på den positive elektrode. - Indtast DC-spændingen (800 V) på softwaregrænsefladen, klik på startknappen, og kør elektroforesen ved 100 V / cm elektrisk feltstyrke.
BEMÆRK: I dette trin placeres både de positive og negative elektroder med buffer. - Klik på stopknappen , når alle DNA-fragmenter er adskilt i kapillærrøret.
- Skyl kapillærrøret med steriliseret vand i 1 minut efter hver kørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 repræsenterer PCR-produkternes elektroferogrammer og DNA-markørerne. Spor (figur 5A) er CE-resultatet af det CF-PCR-amplificerede produkt, spor (figur 5B) er CE-resultatet af produktet forstærket ved termisk cykling, og spor (figur 5C) er CE-resultatet af 100 bp DNA-stigen. Vi forstærkede først målgenet for E. coli i CF-PCR-systemet; PCR-opløsningen tog ~ 10 minutter, 30 s fra indløbet til chippens udløb. Størrelsen af målamplikonen for E. coli var 544 bp. De amplificerede PCR-produkter blev analyseret i CE-systemet, og CE af en 100 bp DNA-stige blev også udført under de samme eksperimentelle betingelser. PCR-produktets størrelse kan evalueres i henhold til DNA-stigens elektroferogramme. Hvert eksperiment blev udført tre gange for reproducerbarhed. Dataene i figur 5 viser, at toppene svarende til PCR-produkterne fra E. coli blev observeret efter separation, og migrationstiderne for PCR-produkterne i den mikrofluidiske chip var i overensstemmelse med migrationstiderne i en termisk cyklist.
Figur 1: Den rensede siliciumskive. Vægtstang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: CF-PCR mikrofluidisk chip fremstillet ved hjælp af PDMS. Mikrokanalerne blev fyldt med rødt blæk til visualisering. Skalastang = 1 cm. Forkortelser: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR; PDMS = polydimethysiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: CF-PCR-systemet. (1) Mikrofluidisk chip, (2) PTC keramisk varmelegeme, (3) sprøjte, (4) pumpe, (5) silikonerør, (6) slids, (7) stålnål, (8) pipettespids, (9) PID-temperaturregulator, (10) temperatursensor, (11) faststofrelæ. Forkortelse: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Opbygningen af CE-systemet. Forkortelser: CE = kapillær elektroforese; PMT = fotomultiplikatorrør; A1, A2 = filtre; B = feltlinse; C = dikroisk spejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Escherichia coli's elektroferogramme. Forstærkning med (A) CF-PCR mikrofluidisk chip, (B) traditionel PCR termisk cyklist og (C) DNA-markører. Forkortelse: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Mål | Sekvens 5′...... 3′ | Amplicon (bp) | ||
| EF-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabel 1: Primere anvendt til Escherichia coli. Forkortelser: EC = Escherichia coli; F = fremad; R = omvendt.
| 10x hurtig buffer I | 5,0 μL |
| dNTP-blanding (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA-polymerase | 0,25 μL |
| polyvinylpyrrolidon (PVP) | 3,5 μL |
| Mellem 20 | 1,5 μL |
| skabelon | 1,0 μL |
| EF-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| ultrarent vand | 33,75 μL |
Tabel 2: PCR-opløsningens komponenter. Forkortelser: EC = Escherichia coli; F = fremad; R = omvendt.
Supplerende fil 1: STL-fil til 3D-udskrivning. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både PCR og CE er to populære bioteknologier i analysen af nukleinsyrer. Dette papir beskriver forstærkningen af E. coli og påvisningen af PCR-produkterne ved hjælp af CF-PCR- og CE-systemerne, begge bygget internt. Målgenet for E. coli blev amplificeret inden for 10 minutter på grund af de høje varmeoverførselshastigheder. DNA-fragmenterne mindre end 1.500 bp blev adskilt inden for 8 minutter (figur 5). Den store fordel ved disse to teknikker er, at det i høj grad kan spare tid sammenlignet med de traditionelle PCR- og pladegelelektroforesemetoder. Forskere skal huske på, at CF-PCR-mikrofluidisk chip skal rengøres efter brug, og CE-systemet skal bygges i et rent og sort hus for at undgå forurening af prøver. CF-PCR-systemet baseret på den mikrofluidiske chip og CE-systemet, der introduceres i dette arbejde, er lette at fremstille og kan tilbyde en enkel metode til analyse af nukleinsyrer i laboratoriet. En begrænsning ved CF-PCR er imidlertid, at den kun kan forstærke og detektere kun én prøve ad gangen, hvilket kan begrænse dens brede anvendelse; For at imødegå dette kan brugerne udvikle den integrerede CF-PCR og CE array mikrofluidiske chip til at løse dette problem. Den platform, der rapporteres i dette arbejde, har stor potentiel anvendelse inden for klinisk diagnose af infektionssygdomme og nukleinsyreforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr. 19ZR1477500 og nr. 18441900400). Vi anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
