Summary
Bu protokol, bir mikroakışkan çipe dayalı bir sürekli akışlı polimeraz zincir sisteminin nasıl oluşturulacağını ve laboratuvarda bir kapiler elektroforez sisteminin nasıl oluşturulacağını açıklar. Laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunar.
Abstract
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), biyomoleküler tanıda önemli bir rol oynayan bir hedef genin amplifikasyonu için kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Bununla birlikte, geleneksel PCR, düşük sıcaklık varyasyon verimliliği nedeniyle çok zaman alıcıdır. Bu çalışma, mikroakışkan bir çipe dayalı bir sürekli akış-PCR (CF-PCR) sistemi önermektedir. Amplifikasyon süresi, PCR solüsyonunun farklı sıcaklıklara ayarlanmış ısıtıcılara yerleştirilen bir mikro kanala çalıştırılmasıyla büyük ölçüde azaltılabilir. Ayrıca, kapiler elektroforez (CE), pozitif ve yanlış pozitif PCR ürünlerini ayırt etmenin ideal bir yolu olduğundan, DNA fragmanlarının verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için bir CE sistemi inşa edilmiştir. Bu makale, Escherichia coli'nin (E. coli) şirket içinde oluşturulan CF-PCR sistemi ile amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE ile tespitini açıklamaktadır. Sonuçlar, E. coli'nin hedef geninin 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini göstermektedir, bu da bu iki sistemin nükleik asitlerin hızlı amplifikasyonu ve tespiti için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA fragmanlarını çoğaltmak için kullanılan bir moleküler biyoloji tekniğidir, böylece eser miktarda DNA'yı yüz milyonlarca kez çoğaltır. Klinik tanı, tıbbi araştırma, gıda güvenliği, adli kimlik tespiti ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PCR işlemi temel olarak üç adımdan oluşur: 90-95 °C'de denatürasyon, 50-60 °C'de tavlama ve 72-77 °C'de uzatma. Termal döngü, PCR sürecinin önemli bir parçasıdır; bununla birlikte, geleneksel PCR termal döngüleyici yalnızca hantal değil, aynı zamanda verimsizdir ve 25 döngüyü tamamlamak için yaklaşık 40 dakika gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, şirket içinde mikroakışkan bir çipe dayalı sürekli akışlı bir PCR (CF-PCR) sistemi kuruldu. CF-PCR, PCR solüsyonunu farklı sıcaklıklardaısıtıcılara yerleştirilen mikro kanallara sürerek zamandan büyük ölçüde tasarruf sağlayabilir 1,2,3,4,5.
Kapiler elektroforez (CE), yüksek çözünürlük, yüksek hız ve mükemmel tekrarlanabilirlik 6,7,8,9,10,11 gibi birçok avantaja sahip olduğundan, laboratuvarda nükleik asitlerin ve proteinlerin analizi için popüler bir araç haline gelmiştir. Bununla birlikte, çoğu laboratuvar, özellikle gelişmekte olan dünyadaki laboratuvarlar, CE cihazının yüksek fiyatı nedeniyle bu teknolojiyi karşılayamaz. Burada, CF-PCR mikroakışkan çipinin nasıl üretileceğine ve laboratuvarda çok yönlü bir CE sisteminin nasıl oluşturulacağına ilişkin protokolleri özetledik. Ayrıca, bu CF-PCR sistemi ile E. coli'nin amplifikasyon sürecini ve PCR ürünlerinin CE sistemi tarafından tespit edilmesini de gösteriyoruz. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, kullanıcılar mikroakışkan çipler üretebilmeli, PCR çözeltileri hazırlayabilmeli, nükleik asit amplifikasyonu için bir CF-PCR sistemi oluşturabilmeli ve DNA parçalarını ayırmak için sınırlı kaynaklarla bile basit bir CE sistemi kurabilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. CF-PCR mikroakışkan çipinin üretimi
- Nemi gidermek için silikon gofreti 200 °C'de 25 dakika ısıtın.
- Gofretin inç başına 1 mL SU-8-2075 fotorezist dağıtın. 100 rpm/s ivme ile 5-10 s boyunca 500 rpm'de ve ardından 500 rpm/s hızlanma ile 30 s boyunca 2.000 rpm'de bir spin kaplayıcı kullanarak silikon gofret üzerinde döndürün.
- Silikon gofreti 65 °C'de 3 dakika, ardından 95 °C'de 15 dakika pişirin.
- Fotolitografi makinesi için pozlama enerjisi olarak 150 - 215 mJ/cm² ayarlayın ve tasarlanan deseni bir fotolitografi maskesi ile fotorezist üzerine kazıyın. Silikon gofreti ve maskeyi pozlamaya hazır hale getirin.
- Maruz kaldıktan sonra, silikon gofreti 65 °C'de 2 dakika ve ardından 95 °C'de 7 dakika pişirin.
- Fazla fotorezisti çıkarmak için silikon gofreti geliştirici solüsyonuna daldırın ve mikrokanallar görülebildiğinde çıkarın (Şekil 1). Artık geliştirici solüsyonunu durulamak için izopropanol kullanın.
- Polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimerini ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırın. Karışık PDMS çözeltisini replika kalıba dökün ve 80 °C'de 60 dakika katılaştırın.
- Bir plazma temizleyici kullanarak aktivasyondan sonra PDMS mikroakışkan çipini bir slayt üzerine yapıştırın ve mümkün olan en kısa sürede 80 ° C'de 30 dakika katılaştırın (Şekil 2).
NOT: Çipin dış boyutları 80.0 mm × 30.0 mm × 0.4 mm'dir. Mikroakışkan çipte 40 adet serpantin kanalı (100 μm × 1.46 mm × 100 μm, genişlik × uzunluk × derinlik) bulunmaktadır.
2. PCR çözeltisinin hazırlanması
- Yapılandırmadan önce reaktifleri tamamen çözün. Reaktiflerin iyice karıştığından emin olmak için bir vorteks karıştırıcı ve santrifüj kullanın.
- Aşağıdaki bileşenleri bu sırayla ekleyerek bir santrifüj tüpü hazırlayın: 33.75 μL su, 1.0 μL DNA şablonu, 0.5 μL primer, 5.0 μL tampon, 4.0 μL dNTP karışımı, 1.5 μL Tween 20, 3.5 μL PVP ve son olarak 0.25 μL DNA polimeraz.
NOT: Burada kullanılan DNA şablonu E. coli'dir. E. coli için primerler ve PCR çözeltisinin bileşenleri sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'de listelenmiştir. - Çözeltiyi girdap yaparak karıştırın.
3. CF-PCR sisteminin yapısı
- İki pozitif sıcaklık katsayısı (PTC) seramik ısıtıcı, iki katı hal rölesi, iki PID sıcaklık kontrol cihazı, iki sıcaklık sensörü ve bir güç kablosu hazırlayın.
NOT: PTC seramik ısıtıcıların boyutu, mikroakışkan çipin boyutuna bağlıdır; uzunluk çip uzunluğundan büyük olmalıdır - burada kullanılan PTC seramik ısıtıcıların uzunluk-genişlik-yüksekliği 10 cm x 2 cm x 0,4 cm'dir. - Isıtıcıyı yarıiletken röleye bağlayın.
- Katı hal rölesini PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.
- Sıcaklık sensörü probunu iki ısıtıcının altına takın ve terminali PID sıcaklık kontrol cihazına bağlayın.
- İki katı hal rölesini seri olarak bağlayın ve güç kablosunu bağlayın.
- 3D iki ısıtıcı için bir yuva yazdırın ve ısıtıcıları aynı düzlemde tutun (3D baskı için gereken STL dosyaları için Ek Dosya 1'e bakın).
NOT: İki ısıtıcı arasında 12 mm hava boşluğu bırakın. - Mikroakışkan çipi iki ısıtıcının üzerine yerleştirin.
- Bir şırınga pompası ve bir şırınga hazırlayın, şırıngayı şırınga pompasına sabitleyin, bir şırınga ile bir silikon boru (0.8 mm iç çap [ID]) bağlayın ve silikon borunun üstüne bir çelik iğne (0.7 mm ID) bağlayın (Şekil 3).
- Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.
- PCR ürünlerini toplamak için çipin çıkışına bir pipet ucu yerleştirin.
4. CE sisteminin inşası
- Darbeli alanlı bir elektrik alanı oluşturmak için yüksek voltajlı bir güç kaynağı kullanın; Pozitif ve negatif elektrotlara dikkat edin.
- Işık kaynağı olarak bir cıva lambası kullanın ve cıva lambasından gelen uyarma dalga boyunu bir filtreden geçirin.
- Kılcal damarı mikroskop tablasına yerleştirin.
- Floresan emisyonunu objektifle toplayın ve ardından bir R928 fotoçoğaltıcı tüp (PMT) kullanarak tespit edin. Mikroskobu ve kılcal damarı gözlemleyin. Karanlık oda koşullarında ışığı açın; Uyarma ışığı objektif tarafından toplanır.
- Güç kaynağını kontrol etmek ve veri toplamayı tamamlamak için kendi geliştirdiği LABVIEW yazılımını kullanın (6.3-6.6 adımlarında açıklanmıştır). https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi bakın.
NOT: Tüm deneyler karanlık bir odada gerçekleştirilmiştir ve CE sisteminin şeması Şekil 4'te gösterilmiştir.
5. PCR çözümünü çalıştırın
- CF-PCR sisteminin ısıtıcılarının sıcaklığını 65 °C ve 95 °C'de önceden ayarlayın.
- Mikroakışkan çipi iki ısıtma bloğuna yerleştirin.
- Silikon tüpün ucunu 50 μL PCR solüsyonu içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin (adım 2.3'ten itibaren). Çözeltiyi yavaşça çekmek için şırınga pistonunu çekin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin. Çelik iğneyi mikroakışkan çipin girişine yerleştirin.
- Pompanın akış hızını 10 μL/dk'ya ayarlayın ve çözeltiyi mikroçipin girişindeki mikrokanala itmek için başlat düğmesine basın.
- PCR ürünlerini mikroakışkan çipin çıkışında toplayın.
NOT: Kirleri gidermek için PCR'den önce ve sonra kanalı ultra saf suyla durulayın.
6. PCR ürünlerinin şirket içinde oluşturulan bu CE sistemi ile tespiti
- Toplam uzunluğu 8 cm ve etkili uzunluğu 6 cm olan bir kılcal damar hazırlayın.
- 100 μL %1 hidroksietilselüloz (HEC, a/h), 2 μL 100x SYBR Green I ve 98 μL ultra saf suyu karıştırarak 1x SYBR Green I içeren %0,5 HEC (a/h) elde ederek ayırma tamponunu hazırlayın.
- Kılcal damarı bir vakum pompası kullanarak hazırlanan ayırma tamponu ile doldurun.
- Yazılım arayüzünde enjeksiyon voltajını (800 V) ve enjeksiyon süresini (2.0 s) girin, başlat düğmesine tıklayın ve PCR ürünlerinin 100 V/cm'de (2.0 s) elektrodinamik olarak kılcal damara verilmesini bekleyin.
NOT: Bu adımda, PCR ürünleri negatif elektrot üzerine yerleştirilir ve tampon pozitif elektrot üzerine yerleştirilir. - Yazılım arayüzüne DC voltajını (800 V) girin, başlat düğmesine tıklayın ve elektroforezi 100 V/cm elektrik alan gücünde çalıştırın.
NOT: Bu adımda, hem pozitif hem de negatif elektrotlar tampon ile yerleştirilir. - Tüm DNA parçaları kılcal damarda ayrıldıktan sonra durdur düğmesine tıklayın.
- Her çalıştırmadan sonra kılcal damarı 1 dakika sterilize suyla yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5, PCR ürünlerinin elektroferogramını ve DNA belirteçlerini temsil etmektedir. İz (Şekil 5A), CF-PCR ile çoğaltılmış ürünün CE sonucudur, iz (Şekil 5B), termal döngü ile çoğaltılan ürünün CE sonucudur ve iz (Şekil 5C), 100 bp DNA merdiveninin CE sonucudur. İlk olarak CF-PCR sisteminde E. coli'nin hedef genini çoğalttık; PCR çözeltisi, çipin girişinden çıkışına kadar ~ 10 dakika, 30 saniye sürdü. E. coli'nin hedef amplikonunun büyüklüğü 544 bp idi. Amplifiye edilmiş PCR ürünleri CE sisteminde analiz edildi ve aynı deneysel koşullar altında 100 bp'lik bir DNA merdiveninin CE'si de gerçekleştirildi. PCR ürününün boyutu, DNA merdiveninin elektroferogramına göre değerlendirilebilir. Tekrarlanabilirlik için her deney üç kez gerçekleştirildi. Şekil 5'teki veriler, ayrılmadan sonra E. coli'nin PCR ürünlerine karşılık gelen piklerin gözlendiğini ve mikroakışkan çipteki PCR ürünlerinin migrasyon sürelerinin bir termal döngüleyicideki ile tutarlı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Temizlenmiş silikon gofret. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PDMS kullanılarak yapılan CF-PCR mikroakışkan çipi. Mikrokanallar görselleştirme için kırmızı mürekkeple dolduruldu. Ölçek çubuğu = 1 cm. Kısaltmalar: CF-PCR = sürekli akış-PCR; PDMS = polidimetililoksan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CF-PCR sistemi. (1) Mikroakışkan çip, (2) PTC seramik ısıtıcı, (3) şırınga, (4) pompa, (5) silikon boru, (6) yuva, (7) çelik iğne, (8) pipet ucu, (9) PID sıcaklık kontrolörü, (10) sıcaklık sensörü, (11) katı hal rölesi. Kısaltma: CF-PCR = sürekli akış-PCR. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CE sisteminin yapısı. Kısaltmalar: CE = kapiler elektroforez; PMT = fotoçoğaltıcı tüp; A1, A2 = filtreler; B = alan merceği; C = dikroik ayna. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Escherichia coli'nin elektroferogramı. (A) CF-PCR mikroakışkan çipi, (B) geleneksel PCR termal döngüleyici ve (C) DNA belirteçleri ile amplifikasyon. Kısaltma: CF-PCR = sürekli akış-PCR. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef | Sıra 5′...... 3′ | Amplikon (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tablo 1: Escherichia coli için kullanılan primerler.Kısaltmalar: EC = Escherichia coli; F = ileri; R = ters.
| 10x Hızlı Tampon I | 5,0 μL |
| dNTP karışımı (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA Polimeraz | 0,25 μL |
| polivinil pirolidon (PVP) | 3,5 μL |
| Ara 20 | 1,5 μL |
| şablon | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| ultra saf su | 33,75 μL |
Tablo 2: PCR çözümünün bileşenleri. Kısaltmalar: EC = Escherichia coli; F = ileri; R = ters.
Ek Dosya 1: 3D baskı için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hem PCR hem de CE, nükleik asitlerin analizinde iki popüler biyoteknolojidir. Bu makale, her ikisi de şirket içinde yerleşik olan CF-PCR ve CE sistemleri kullanılarak E. coli'nin amplifikasyonunu ve PCR ürünlerinin tespitini açıklamaktadır. E. coli'nin hedef geni, yüksek ısı transfer hızları nedeniyle 10 dakika içinde başarılı bir şekilde amplifiye edildi. 1.500 bp'den küçük DNA parçaları 8 dakika içinde ayrıldı (Şekil 5). Bu iki tekniğin en büyük avantajı, geleneksel PCR ve levha jel elektroforezi yöntemlerine kıyasla büyük ölçüde zaman kazandırabilmesidir. Araştırmacılar, CF-PCR mikroakışkan çipinin kullanımdan sonra temizlenmesi gerektiğini ve numunelerin kontaminasyonunu önlemek için CE sisteminin temiz ve siyah bir evde inşa edilmesi gerektiğini unutmamalıdır. Mikroakışkan çipe dayalı CF-PCR sistemi ve bu çalışmada tanıtılan CE sisteminin üretilmesi kolaydır ve laboratuvarda nükleik asitlerin analizi için basit bir yöntem sunabilir. Bununla birlikte, CF-PCR'nin bir sınırlaması, bir seferde yalnızca bir numuneyi çoğaltabilmesi ve tespit edebilmesidir, bu da geniş uygulamasını sınırlayabilir; Buna karşı koymak için, kullanıcılar bu sorunu çözmek için entegre CF-PCR ve CE dizisi mikroakışkan çipini geliştirebilirler. Bu çalışmada bildirilen platform, bulaşıcı hastalıkların klinik teşhisi ve nükleik asit araştırmaları alanında büyük bir potansiyel uygulamaya sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin'in Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu tarafından desteklenmiştir (No. 19ZR1477500 ve No.18441900400). Şanghay Bilim ve Teknoloji Üniversitesi'nin (No.2017KJFZ049) mali desteğini minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
