Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man bygger et kontinuerlig strømningspolymerasekjedesystem basert på en mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et kapillærelektroforesesystem i laboratoriet. Den presenterer en enkel metode for analyse av nukleinsyrer i laboratoriet.
Abstract
Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en tradisjonell metode som brukes til amplifisering av et målgen som har spilt en viktig rolle i biomolekylær diagnostikk. Tradisjonell PCR er imidlertid svært tidkrevende på grunn av variasjonseffektiviteten ved lave temperaturer. Dette arbeidet foreslår et kontinuerlig flow-PCR (CF-PCR) system basert på en mikrofluidisk chip. Forsterkningstiden kan reduseres kraftig ved å kjøre PCR-løsningen inn i en mikrokanal plassert på varmeovner som er satt til forskjellige temperaturer. Dessuten, da kapillær elektroforese (CE) er en ideell måte å skille mellom positive og falske positive PCR-produkter, ble et CE-system bygget for å oppnå effektiv separasjon av DNA-fragmentene. Dette papiret beskriver prosessen med forsterkning av Escherichia coli (E. coli) av CF-PCR-systemet innebygd internt og påvisning av PCR-produktene ved CE. Resultatene viser at målgenet av E. coli ble vellykket amplifisert innen 10 minutter, noe som indikerer at disse to systemene kan brukes til rask amplifisering og påvisning av nukleinsyrer.
Introduction
Polymerasekjedereaksjon (PCR) er en molekylærbiologisk teknikk som brukes til å amplifisere spesifikke DNA-fragmenter, og derved forsterke spormengder av DNA hundrevis av millioner ganger. Det har blitt mye brukt i klinisk diagnose, medisinsk forskning, mattrygghet, rettsmedisinsk identifikasjon og andre felt. PCR-prosessen består hovedsakelig av tre trinn: denaturering ved 90-95 °C, glødning ved 50-60 °C og forlengelse ved 72-77 °C. Termisk sykling er en viktig del av PCR-prosessen; Den tradisjonelle PCR-termiske syklisten er imidlertid ikke bare klumpete, men også ineffektiv, og krever omtrent 40 minutter for å fullføre 25 sykluser. For å overvinne disse begrensningene ble et kontinuerlig PCR-system (CF-PCR) bygget internt, basert på en mikrofluidisk brikke. CF-PCR kan i stor grad spare tid ved å kjøre PCR-løsningen inn i mikrokanaler plassert på varmeovner ved forskjellige temperaturer 1,2,3,4,5.
Siden kapillær elektroforese (CE) har mange fordeler, for eksempel høy oppløsning, høy hastighet og utmerket reproduserbarhet 6,7,8,9,10,11, har det blitt et populært verktøy i laboratoriet for analyse av nukleinsyrer og proteiner. Imidlertid har de fleste laboratorier, spesielt laboratorier i utviklingsland, ikke råd til denne teknologien på grunn av den høye prisen på CE-instrumentet. Her har vi skissert protokoller for hvordan man fremstiller CF-PCR mikrofluidisk chip og hvordan man bygger et allsidig CE-system i laboratoriet. Vi demonstrerer også prosessen med forsterkning av E. coli ved dette CF-PCR-systemet og påvisning av PCR-produktene av CE-systemet. Ved å følge prosedyrene beskrevet i denne protokollen, bør brukerne kunne fremstille mikrofluidiske chips, forberede PCR-løsninger, bygge et CF-PCR-system for nukleinsyreamplifikasjon og sette opp et enkelt CE-system, selv med begrensede ressurser, for å skille DNA-fragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Fabrikasjon av CF-PCR mikrofluidbrikke
- Varm silisiumskiven ved 200 °C i 25 minutter for å fjerne fuktigheten.
- Dispenser 1 ml SU-8-2075 fotoresist per tomme av waferen. Spinn den på silisiumskiven ved hjelp av en spinnbelegger ved 500 o / min i 5-10 s med en akselerasjon på 100 o / s, og deretter ved 2000 o / min i 30 s med en akselerasjon på 500 o / s.
- Mykstek silisiumskiven ved 65 °C i 3 min, deretter ved 95 °C i 15 minutter.
- Sett 150 - 215 mJ / cm² som eksponeringsenergi for fotolitografimaskinen, og graver det designede mønsteret på fotoresisten med en fotolitografimaske. Plasser silisiumskiven og masken klar for eksponering.
- Stek silisiumskiven etter eksponering ved 65 °C i 2 minutter og deretter ved 95 °C i 7 minutter.
- Dypp silisiumskiven i utviklerløsning for å fjerne overflødig fotoresist og ta den ut når mikrokanalene kan sees (figur 1). Bruk isopropanol til å skylle av den gjenværende utviklerløsningen.
- Bland polydimetylsiloksan (PDMS) prepolymer og herdemiddel i forholdet 10: 1. Hell den blandede PDMS-oppløsningen i replikaformen og stivne den ved 80 °C i 60 minutter.
- Bind PDMS-mikrovæskebrikken på et lysbilde etter aktivering ved hjelp av et plasmarensemiddel, og stivn dem ved 80 °C i 30 minutter så snart som mulig (figur 2).
MERK: De ytre dimensjonene på brikken er 80,0 mm × 30,0 mm × 0,4 mm. Det er 40 serpentinkanaler (100 μm × 1, 46 mm × 100 μm, bredde × lengde × dybde) i mikrofluidbrikken.
2. Fremstilling av PCR-løsningen
- Tine reagensene helt før konfigurasjon. Bruk en virvelblander og sentrifuge for å sikre at reagensene er godt blandet.
- Forbered et sentrifugerør, og legg til følgende komponenter i denne rekkefølgen: 33, 75 μL vann, 1, 0 μL DNA-mal, 0, 5 μL primer, 5, 0 μL buffer, 4, 0 μL dNTP-blanding, 1, 5 μL mellom 20, 3, 5 μL PVP og til slutt 0, 25 μL DNA-polymerase.
MERK: Her er DNA-malen som brukes E. coli. Primerne for E. coli og komponentene i PCR-løsningen er listet opp i henholdsvis tabell 1 og tabell 2. - Bland løsningen med vortexing.
3. Konstruksjon av CF-PCR-systemet
- Forbered to keramiske varmeovner med positiv temperaturkoeffisient (PTC), to solid-state-reléer, to PID-temperaturregulatorer, to temperatursensorer og en strømledning.
MERK: Størrelsen på PTC keramiske varmeovner avhenger av størrelsen på mikrofluidbrikken; lengden skal være større enn lengden på brikken - lengden-bredde-høyden på PTC keramiske varmeovner som brukes her er 10 cm x 2 cm x 0,4 cm. - Koble varmeren til solid state-reléet.
- Koble solid state-reléet til PID-temperaturregulatoren.
- Fest temperatursensorsonden til bunnen av de to varmeovnene og koble terminalen til PID-temperaturkontrolleren.
- Koble to solid state-reléer i serie og koble strømledningen.
- 3D-print et spor for de to ovnene og hold ovnene på samme plan (se tilleggsfil 1 for STL-filer som kreves for 3D-utskrift).
MERK: La det være en 12 mm luftspalte mellom de to ovnene. - Plasser mikrofluidbrikken på de to varmeovnene.
- Klargjør en sprøytepumpe og en sprøyte, fest sprøyten på sprøytepumpen, koble til et silikonrør (0,8 mm indre diameter [ID]) med en sprøyte, og koble en stålnål (0,7 mm ID) til toppen av silikonslangen (figur 3).
- Sett stålnålen inn i innløpet til mikrofluidbrikken.
- Plasser en pipettespiss ved utløpet av brikken for å samle PCR-produktene.
4. Konstruksjon av CE-systemet
- Bruk en høyspent strømforsyning for å generere et pulserende felt elektrisk felt; Legg merke til de positive og negative elektrodene.
- Bruk en kvikksølvlampe som lyskilde og filtrer eksitasjonsbølgelengden fra kvikksølvlampen gjennom et filter.
- Plasser kapillæren på mikroskopstadiet.
- Samle fluorescensutslippet med målet, og oppdag det deretter ved hjelp av et R928 fotomultiplikatorrør (PMT). Vær oppmerksom på mikroskopet og kapillæren. Slå på lyset under mørke romforhold; Eksitasjonslys samles av målet.
- Bruk den egenutviklede LABVIEW-programvaren til å styre strømforsyningen og fullføre datainnsamlingen (beskrevet i trinn 6.3-6.6). Se https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi.
MERK: Alle eksperimenter ble utført i et mørkt rom, og skjemaet til CE-systemet er vist i figur 4.
5. Kjør PCR-løsningen
- Forhåndsinnstill temperaturen på varmeovnene i CF-PCR-systemet ved 65 °C og 95 °C.
- Plasser mikrofluidbrikken på de to varmeblokkene.
- Sett spissen av silikonrøret inn i et sentrifugerør inneholdende 50 μL PCR-oppløsning (fra trinn 2.3). Trekk i sprøytestempelet for å trekke oppløsningen langsomt ut. Fest sprøyten på en sprøytepumpe. Sett stålnålen inn i innløpet til mikrofluidbrikken.
- Sett pumpens strømningshastighet til 10 μL/min og trykk på startknappen for å skyve løsningen i mikrokanalen ved innløpet til mikrobrikken.
- Samle PCR-produktene ved utløpet av mikrofluidbrikken.
NOTAT: Skyll kanalen med ultrarent vann før og etter PCR for å fjerne urenheter.
6. Deteksjon av PCR-produktene med dette CE-systemet innebygd internt
- Forbered en kapillær med en total lengde på 8 cm og en effektiv lengde på 6 cm.
- Forbered separasjonsbufferen ved å blande 100 μL hydroksyetylcellulose (HEC, w/v), 2 μL 100x SYBR Green I og 98 μL ultrarent vann for å oppnå 0,5 % HEC (w/v) inneholdende 1x SYBR Green I.
- Fyll kapillæren med den forberedte separasjonsbufferen ved hjelp av en vakuumpumpe.
- Skriv inn injeksjonsspenningen (800 V) og injeksjonstiden (2,0 s) på programvaregrensesnittet, klikk på startknappen og vent til PCR-produktene blir elektronisk introdusert i kapillæren ved 100 V / cm (2,0 s).
MERK: I dette trinnet plasseres PCR-produktene på den negative elektroden og bufferen plasseres på den positive elektroden. - Skriv inn likespenningen (800 V) på programvaregrensesnittet, klikk på startknappen, og kjør elektroforesen ved 100 V / cm elektrisk feltstyrke.
MERK: I dette trinnet plasseres både de positive og negative elektrodene med buffer. - Klikk på stoppknappen etter at alle DNA-fragmenter er separert i kapillæren.
- Skyll kapillæren med sterilisert vann i 1 min etter hver løp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 representerer elektroferogrammet til PCR-produktene og DNA-markørene. Spor (figur 5A) er CE-resultatet av CF-PCR-amplifisert produkt, spor (figur 5B) er CE-resultatet av produktet forsterket av termisk syklus, og spor (figur 5C) er CE-resultatet av 100 bp DNA-stigen. Vi forsterket først målgenet til E. coli i CF-PCR-systemet; PCR-løsningen tok ~ 10 min, 30 s fra innløpet til utløpet av brikken. Størrelsen på målamplikonen til E. coli var 544 bp. De amplifiserte PCR-produktene ble analysert i CE-systemet, og CE av en 100 bp DNA-stige ble også utført under de samme eksperimentelle forholdene. Størrelsen på PCR-produktet kan evalueres i henhold til DNA-stigens elektroferogramme. Hvert eksperiment ble utført tre ganger for reproduserbarhet. Dataene i figur 5 viser at toppene som tilsvarer PCR-produktene til E. coli ble observert etter separasjon, og migrasjonstidene til PCR-produktene i mikrofluidbrikken var konsistente med den i en termisk syklist.
Figur 1: Den rensede silisiumskiven. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: CF-PCR mikrofluidbrikken laget med PDMS. Mikrokanalene ble fylt med rødt blekk for visualisering. Skala bar = 1 cm. Forkortelser: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR; PDMS = polydimetysiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: CF-PCR-systemet. (1) Mikrofluidbrikke, (2) PTC keramisk varmeapparat, (3) sprøyte, (4) pumpe, (5) silikonrør, (6) spor, (7) stålnål, (8) pipettespiss, (9) PID temperaturregulator, (10) temperatursensor, (11) solid state-relé. Forkortelse: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Konstruksjonen av CE-systemet. Forkortelser: CE = kapillær elektroforese; PMT = fotomultiplikator rør; A1, A2 = filtre; B = feltlinse; C = dikroisk speil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Elektroherogrammet til Escherichia coli. Forsterkning med (A) CF-PCR mikrofluidisk chip, (B) tradisjonell PCR termisk syklist og (C) DNA-markører. Forkortelse: CF-PCR = kontinuerlig-flow-PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Mål | Sekvens 5 '...... 3′ | Amplicon (bp) | ||
| EC-F | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
Tabell 1: Primere ansatt for Escherichia coli. Forkortelser: EC = Escherichia coli; F = fremover; R = omvendt.
| 10x rask buffer I | 5,0 μL |
| dNTP-blanding (2,5 μM) | 4,0 μL |
| SpeedSTAR HS DNA-polymerase | 0,25 μL |
| polyvinylpyrrolidon (PVP) | 3,5 μL |
| Mellom 20 | 1,5 μL |
| mal | 1,0 μL |
| EC-F | 0,5 μL |
| EC-R | 0,5 μL |
| ultrarent vann | 33,75 μL |
Tabell 2: Komponentene i PCR-løsningen. Forkortelser: EC = Escherichia coli; F = fremover; R = omvendt.
Tilleggsfil 1: STL-fil for 3D-utskrift. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både PCR og CE er to populære bioteknologier i analysen av nukleinsyrer. Dette papiret beskriver forsterkningen av E. coli og påvisning av PCR-produktene ved hjelp av CF-PCR- og CE-systemene, begge innebygd internt. Målgenet til E. coli ble vellykket forsterket innen 10 minutter på grunn av de høye varmeoverføringshastighetene. DNA-fragmentene mindre enn 1 500 bp ble separert innen 8 minutter (figur 5). Den store fordelen med disse to teknikkene er at det i stor grad kan spare tid sammenlignet med de tradisjonelle PCR- og plategelelektroforesemetodene. Forskere bør huske på at CF-PCR-mikrofluidbrikken må rengjøres etter bruk, og CE-systemet skal bygges i et rent og svart hus for å unngå forurensning av prøver. CF-PCR-systemet basert på mikrofluidbrikken og CE-systemet introdusert i dette arbeidet er enkle å fremstille og kan tilby en enkel metode for analyse av nukleinsyrer i laboratoriet. En begrensning av CF-PCR er imidlertid at den bare kan forsterke og oppdage bare en prøve om gangen, noe som kan begrense dens brede anvendelse; For å motvirke dette kan brukere utvikle den integrerte CF-PCR- og CE-array-mikrofluidbrikken for å løse dette problemet. Plattformen rapportert i dette arbeidet har stort potensial anvendelse innen klinisk diagnostisering av smittsomme sykdommer og nukleinsyreforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, Kina (nr. 19ZR1477500 og No.18441900400). Vi anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra University of Shanghai for Science and Technology (No.2017KJFZ049).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
- Li, Z., et al. Design and fabrication of portable continuous flow PCR microfluidic chip for DNA replication. Biomedical Microdevices. 22 (1), 5 (2019).
- Kim, J. A., et al. Fabrication and characterization of a PDMS-glass hybrid continuous-flow PCR chip. Biochemical Engineering Journal. 29 (1-2), 91-97 (2006).
- Shen, K., Chen, X., Guo, M., Cheng, J. A microchip-based PCR device using flexible printed circuit technology. Sensors and Actuators B: Chemical. 105 (2), 251-258 (2005).
- Harstad, R. K., Johnson, A. C., Weisenberger, M. M., Bowser, M. T.
- Redman, E. A., Mellors, J. S., Starkey, J. A., Ramsey, J. M. Characterization of intact antibody drug conjugate variants using microfluidic capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (4), 2220-2226 (2016).
- Britz-Mckibbin, P., Kranack, A. R., Paprica, A., Chen, D. D. Quantitative assay for epinephrine in dental anesthetic solutions by capillary electrophoresis. Analyst. 123 (7), 1461-1463 (1998).
- Maeda, H., et al. Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, tetQgene and total bacteria. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 39 (1), 81-86 (2003).
- Hajba, L., Guttman, A. Recent advances in column coatings for capillary electrophoresis of proteins. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 38-44 (2017).
- Kleparnik, K. Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory. Electrophoresis. 36 (1), 159-178 (2015).
