Summary
该协议描述了如何构建基于微流控芯片的连续流聚合酶链系统以及如何在实验室中构建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简单方法。
Abstract
聚合酶链反应（PCR）是一种用于扩增靶基因的传统方法，在生物分子诊断中发挥着重要作用。然而，传统的PCR由于温度变化效率低，非常耗时。该工作提出了一种基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。通过将PCR溶液运行到放置在不同温度的加热器上的微通道中，可以大大缩短扩增时间。此外，由于毛细管电泳（CE）是区分阳性和假阳性PCR产物的理想方法，因此构建了CE系统以实现DNA片段的高效分离。本文介绍了通过内部构建的CF-PCR系统扩增大 肠杆菌 （大肠杆菌）的过程以及CE对PCR产物的检测。结果表明， 大肠杆菌 的靶基因在10 min内成功扩增，表明这两个系统可用于核酸的快速扩增和检测。
Introduction
聚合酶链反应（PCR）是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，从而扩增痕量的DNA，数亿次。已广泛应用于临床诊断、医学研究、食品安全、法医鉴定等领域。PCR过程主要包括三个步骤：90-95°C变性，50-60°C退火，72-77°C延伸。 热循环是PCR过程的重要组成部分;然而，传统的PCR热循环仪不仅体积庞大，而且效率低下，大约需要40分钟才能完成25个循环。为了克服这些局限性，在内部建立了一个基于微流控芯片的连续流PCR（CF-PCR）系统。CF-PCR通过将PCR溶液驱动到放置在不同温度下的加热器上的微通道中，可以大大节省时间1,2,3,4,5。
由于毛细管电泳（CE）具有高分辨率、高速和优异的重现性6,7,8,9,10,11等诸多优点，因此已成为实验室中用于分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，由于CE仪器价格高昂，大多数实验室，尤其是发展中国家的实验室，负担不起这项技术。在此，我们概述了如何制造CF-PCR微流控芯片以及如何在实验室中构建多功能CE系统的协议。我们还演示了该CF-PCR系统扩增大肠杆菌的过程以及CE系统对PCR产物的检测。通过遵循本协议中描述的程序，用户应该能够制造微流控芯片，制备PCR溶液，构建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立简单的CE系统，即使资源有限，也可以分离DNA片段。
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Protocol
注：有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。
1. CF-PCR微流控芯片的制备
- 将硅片在200°C下加热25分钟以除去水分。
- 每英寸晶圆分配 1 mL SU-8-2075 光刻胶。使用旋涂机以 500 rpm 的速度在硅片上旋转 5-10 秒，加速度为 100 rpm/s，然后以 2,000 rpm 的速度旋转 30 秒，加速度为 500 rpm/s。
- 将硅片在65°C下软烘烤3分钟，然后在95°C下烘烤15分钟。
- 将 150 - 215 mJ/cm² 设置为光刻机的 曝光能量 ，并用光刻掩模将设计的图案雕刻到光刻胶上。放置硅晶圆和掩模准备曝光。
- 曝光后，将硅片在65°C烘烤2分钟，然后在95°C烘烤7分钟。
- 将硅晶圆浸入显影液中以去除多余的光刻胶，并在可以看到微通道时将其取出（图1）。使用异丙醇冲洗掉残留的显影液。
- 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物和固化剂以10：1的比例混合。将混合的PDMS溶液倒入复制模具中，并在80°C下固化60分钟。
- 使用等离子清洗机激活后将PDMS微流控芯片粘合在载玻片上，并尽快在80°C下固化30分钟（图2）。
注意： 芯片的外部尺寸为 80.0 毫米× 30.0 毫米× 0.4 毫米。微流控芯片中有 40 个蛇形通道（100 μm × 1.46 mm × 100 μm，宽度×长度×深度）。
2. PCR溶液的制备
- 在配置之前完全解冻试剂。使用涡旋混合器和离心机确保试剂充分混合。
- 准备离心管，按以下顺序加入以下组分：33.75 μL 水、1.0 μL DNA 模板、0.5 μL 引物、5.0 μL 缓冲液、4.0 μL dNTP 混合物、1.5 μL 吐温 20、3.5 μL PVP，最后 0.25 μL DNA 聚合酶。
注意：这里使用的DNA模板是 大肠杆菌。 大肠杆菌 的引物和PCR溶液的组分分别列于表 1 和 表2中。 - 通过涡旋混合溶液。
3. CF-PCR系统的构建
- 准备两个正温度系数（PTC）陶瓷加热器、两个固态继电器、两个PID温度控制器、两个温度传感器和一根电源线。
注意： PTC 陶瓷加热器的尺寸取决于微流控芯片的尺寸;长度应大于芯片的长度-此处使用的PTC陶瓷加热器的长-宽-高为10 cm x 2 cm x 0.4 cm。 - 将加热器连接到固态继电器。
- 将固态继电器连接到PID温度控制器。
- 将温度传感器探头连接到两个加热器的底部，并将端子连接到PID温度控制器。
- 串联两个固态继电器并连接电源线。
- 3D 打印两个加热器的插槽，并将加热器保持在同一平面上（有关 3D 打印所需的 STL 文件，请参阅 补充文件 1 ）。
注意： 在两个加热器之间留出 12 毫米的气隙。 - 将微流控芯片放在两个加热器上。
- 准备注射泵和注射器，将注射器固定在注射泵上，用注射器连接硅胶管（0.8 mm内径[ID]），并将钢针（0.7 mm内径）连接到硅胶管的顶部（图3）。
- 将钢针插入微流控芯片的入口。
- 将移液器吸头放在芯片的出口处以收集PCR产物。
4. CE体系的建设
- 使用高压电源产生脉冲场电场;注意正极和负极。
- 使用汞灯作为光源，通过滤光片过滤汞灯的激发波长。
- 将毛细管放在显微镜载物台上。
- 用物镜收集荧光发射，然后使用R928光电倍增管（PMT）进行检测。观察显微镜和毛细管。在黑暗的房间条件下打开灯;激发光由物镜收集。
- 使用自主研发的LABVIEW软件控制电源，完成数据采集（步骤6.3-6.6所述）。请参见 https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi。
注：所有实验均在暗室中进行，CE系统的示意图如图 4所示。
5. 运行PCR溶液
- 将CF-PCR系统的加热器温度预设为65°C和95°C。
- 将微流控芯片放在两个加热块上。
- 将硅胶管的尖端插入含有50μLPCR溶液的离心管中（来自步骤2.3）。拉动注射器柱塞以缓慢抽出溶液。将注射器固定在注射泵上。将钢针插入微流控芯片的入口。
- 将泵的流速设置为 10 μL/min，然后按下 启动 按钮将微芯片入口处的微通道中的溶液推入微通道中。
- 在微流控芯片的出口处收集PCR产物。
注意：在PCR之前和之后用超纯水冲洗通道以去除杂质。
6. 通过内部构建的CE系统检测PCR产物
- 准备总长度为 8 厘米、有效长度为 6 厘米的毛细管。
- 通过混合 100 μL 1% 羟乙基纤维素 （HEC， w/v）、2 μL 100x SYBR Green I 和 98 μL 超纯水制备分离缓冲液，以获得含有 1x SYBR Green I 的 0.5% HEC （w/v）。
- 使用真空泵用准备好的分离缓冲液填充毛细管。
- 在软件界面输入进样电压（800 V）和进样时间（2.0 s），点击开始按钮，等待PCR产物以100 V/cm（2.0 s）的电动力引入毛细管。
注意：在此步骤中，将PCR产物置于负极上，将缓冲液置于正极上。 - 在软件界面输入直流电压（800 V），点击开始按钮，以 100 V/cm 的电场强度运行电泳。
注意：在此步骤中，正极和负极都放置缓冲液。 - 在毛细管中分离所有 DNA 片段后，单击 停止 按钮。
- 每次运行后用消毒水冲洗毛细管 1 分钟。
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Representative Results
图5显示了PCR产物和DNA标记物的电泳图。痕量（图5A）是CF-PCR扩增产物的CE结果，痕量（图5B）是通过热循环扩增产物的CE结果，痕量（图5C）是100 bp DNA分子量标准的CE结果。我们首先在CF-PCR系统中扩增了大肠杆菌的靶基因;PCR溶液从芯片入口到出口需要~10分钟30秒。大肠杆菌靶标扩增子大小为544 bp。扩增的PCR产物在CE系统中进行分析，在相同的实验条件下也对100 bp DNA分子量标准进行CE。PCR产物的大小可以根据DNA分子量标准的电泳图进行评估。为了重现性，每个实验进行三次。从图5中的数据可以看出，分离后观察到与大肠杆菌PCR产物相对应的峰，微流控芯片中PCR产物的迁移时间与热循环仪中的迁移时间一致。
图 1：清洁后的硅晶圆。 比例尺 = 1 厘米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：使用 PDMS 制作的 CF-PCR 微流控芯片。 微通道中填充了红色墨水以进行可视化。比例尺 = 1 厘米。缩写：CF-PCR = 连续流PCR;PDMS = 聚二甲基硅氧烷。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：CF-PCR系统 。 （1）微流控芯片，（2）PTC陶瓷加热器，（3）注射器，（4）泵，（5）硅胶管，（6）槽，（7）钢针，（8）移液器吸头，（9）PID温度控制器，（10）温度传感器，（11）固态继电器。缩写：CF-PCR = continuous-flow-PCR。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：CE 系统的构建。 缩写：CE=毛细管电泳;PMT = 光电倍增管;A1、A2 = 滤波器;B = 视场透镜;C = 二向色镜。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：大肠杆菌的电泳图。 通过（A）CF-PCR微流控芯片，（B）传统PCR热循环仪和（C）DNA标记物进行扩增。缩写：CF-PCR = continuous-flow-PCR。请点击这里查看此图的较大版本.
| 目标 | 序列 5′......3′ | 扩增子 （bp） | ||
| EC-F型 | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R型 | AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
表1：用于大肠杆菌的引物。缩写：EC = 大肠杆菌;F = 正向;R = 反向。
| 10x 快速缓冲液 I | 5.0微升 |
| dNTP混合物（2.5μM） | 4.0微升 |
| SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 | 0.25微升 |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP） | 3.5微升 |
| 吐温 20 | 1.5微升 |
| 模板 | 1.0微升 |
| EC-F型 | 0.5微升 |
| EC-R型 | 0.5微升 |
| 超纯水 | 33.75微升 |
表2：PCR溶液的成分。 缩写：EC = 大肠杆菌;F = 正向;R = 反向。
补充文件 1：用于 3D 打印的 STL 文件。请点击这里下载此文件。
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Discussion
PCR 和 CE 都是核酸分析中两种流行的生物技术。本文介绍了使用CF-PCR和CE系统进行 大肠杆 菌扩增和PCR产物检测，两者均由内部构建。由于大肠杆菌的传热速率高，在10 min内成功扩增了 大肠杆 菌的靶基因。小于 1,500 bp 的 DNA 片段在 8 分钟内分离（图 5）。这两种技术的最大优点是，与传统的PCR和平板凝胶电泳方法相比，它可以大大节省时间。研究人员应该记住，CF-PCR微流控芯片在使用后需要清洗，CE系统应该建在干净黑的房子里，以避免样品的污染。本文介绍的基于微流控芯片的CF-PCR系统和CE系统易于制备，可为实验室核酸分析提供一种简单的方法。然而，CF-PCR的局限性在于它一次只能扩增和检测一个样本，这可能会限制其广泛应用;为了解决这个问题，用户可以开发集成的CF-PCR和CE阵列微流控芯片来解决这个问题。本文报道的平台在传染病临床诊断和核酸研究领域具有巨大的应用潜力。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了中国上海市科学技术委员会的支持（No.19ZR1477500和No.18441900400）。我们衷心感谢上海理工大学（No.2017KJFZ049）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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