Summary
このプロトコルでは、マイクロ流体チップに基づいて連続フローポリメラーゼ鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。ラボでの核酸分析のための簡単な方法を紹介します。
Abstract
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、生体分子診断において重要な役割を果たしてきた標的遺伝子の増幅に用いられる従来の方法です。しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究では、マイクロ流体チップを用いた連続フローPCR(CF-PCR)システムを提案します。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。さらに、キャピラリー電気泳動(CE)は、陽性および偽陽性のPCR産物を区別するための理想的な方法であるため、DNA断片の効率的な分離を達成するためにCEシステムが構築されました。本稿では、自社構築のCF-PCR装置による大腸菌の増幅過程と、CEによるPCR産物の検出について述べる。その結果、大腸菌の標的遺伝子を10分以内に増幅することに成功し、核酸の迅速な増幅・検出に利用できることが示されました。
Introduction
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、特定のDNA断片を増幅するために使用される分子生物学的手法であり、それによって微量のDNAを数億倍に増幅します。臨床診断、医学研究、食品安全、法医学的識別などの分野で広く使用されています。PCRプロセスは、主に90〜95°Cでの変性、50〜60°Cでのアニーリング、72〜77°Cでの伸長の3つのステップで構成されています。 サーマルサイクリングはPCRプロセスの重要な部分です。しかし、従来のPCRサーマルサイクラーはかさばるだけでなく、非効率的でもあり、25サイクルを完了するのに約40分かかります。これらの制限を克服するために、マイクロ流体チップをベースにした連続フローPCR(CF-PCR)システムが社内で構築されました。CF-PCRは、異なる温度のヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を駆動することにより、時間を大幅に節約できます1,2,3,4,5。
キャピラリー電気泳動(CE)は、高分解能、高速、優れた再現性6,7,8,9,10,11など、多くの利点があるため、核酸やタンパク質の分析にラボで人気のあるツールとなっています。しかし、ほとんどのラボ、特に発展途上国のラボでは、CE機器の価格が高いため、この技術を購入する余裕がありません。ここでは、CF-PCRマイクロ流体チップの製造方法と、ラボで汎用性の高いCEシステムを構築する方法のプロトコルを概説しました。また、このCF-PCRシステムによる大腸菌の増幅プロセスとCEシステムによるPCR産物の検出についても説明します。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーはマイクロ流体チップを製造し、PCR溶液を調製し、核酸増幅用のCF-PCRシステムを構築し、限られたリソースでもDNA断片を分離するための簡単なCEシステムをセットアップできるはずです。
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Protocol
注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. CF-PCRマイクロ流体チップの作製
- シリコンウェーハを200°Cで25分間加熱し、水分を除去します。
- ウェーハの1インチあたり1mLのSU-8-2075フォトレジストを分注します。スピンコーターを使用してシリコンウェーハ上で500rpmで5〜10秒間、100rpm/sの加速度でスピンし、次に2,000rpmで30秒間、500rpm/sの加速度でスピンします。
- シリコンウェーハを65°Cで3分間、次に95°Cで15分間ソフトベークします。
- フォトリソグラフィ装置の露光エネルギーを150〜215mJ/cm²に設定し、フォトリソグラフィマスクでフォトレジストにデザインしたパターンを彫刻します。シリコンウェーハとマスクを露光する準備をします。
- 露光後、シリコンウェーハを65°Cで2分間焼き、次に95°Cで7分間焼きます。
- シリコンウェーハを現像液に浸して余分なフォトレジストを除去し、マイクロチャネルが見えたら取り出します(図1)。イソプロパノールを使用して、残留現像液を洗い流します。
- ポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマーと硬化剤を10:1の割合で混合します。混合したPDMS溶液をレプリカ型に流し込み、80°Cで60分間固化させます。
- プラズマクリーナーを使用して活性化後、PDMSマイクロ流体チップをスライド上に接着し、できるだけ早く80°Cで30分間固化させます(図2)。
注:チップの外形寸法は80.0mm×30.0mm×0.4mmです。マイクロ流体チップには40個の蛇紋岩チャネル(100μm×1.46mm×100μm、幅×長さ×深さ)があります。
2. PCR溶液の調製
- 構成前に試薬を完全に解凍してください。ボルテックスミキサーと遠心分離機を使用して、試薬が十分に混合されていることを確認します。
- 遠心分離管を調製し、以下の成分をこの順に添加します:水33.75 μL、DNAテンプレート1.0 μL、プライマー0.5 μL、バッファー5.0 μL、dNTP混合物4.0 μL、Tween 20 1.5 μL、PVP3.5 μL、最後にDNAポリメラーゼ0.25 μL。
注:ここで、使用されるDNAテンプレートは 大腸菌です。 大腸菌 用のプライマーおよびPCR溶液の成分をそれぞれ表 1 および 表2に列挙する。 - ボルテックスで溶液を混合します。
3. CF-PCRシステムの構築
- 正温度係数 (PTC) セラミック ヒーター 2 個、ソリッドステート リレー 2 個、PID 温度コントローラー 2 個、温度センサー 2 個、電源コードを用意します。
注意: PTCセラミックヒーターのサイズは、マイクロ流体チップのサイズによって異なります。長さはチップの長さよりも大きくする必要があります-ここで使用されるPTCセラミックヒーターの長さ-幅-高さは10 cm x 2 cm x 0.4 cmです。 - ヒーターをソリッドステートリレーに接続します。
- ソリッドステートリレーをPID温度コントローラに接続します。
- 温度センサープローブを2つのヒーターの下部に取り付け、端子をPID温度コントローラーに接続します。
- 2つのソリッドステートリレーを直列に接続し、電源コードを接続します。
- 2つのヒーター用のスロットを3Dプリントし、ヒーターを同じ平面に保ちます(3Dプリントに必要なSTLファイルについては、 補足ファイル1 を参照してください)。
注意: 2つのヒーターの間に12mmのエアギャップを残してください。 - マイクロ流体チップを2つのヒーターに置きます。
- シリンジポンプとシリンジを用意し、シリンジポンプにシリンジを固定し、シリンジにシリコンチューブ(内径0.8mm[ID])を接続し、シリコーンチューブの上部にスチールニードル(内径0.7mm)を接続します(図3)。
- スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。
- チップの出口にピペットチップを置き、PCR産物を回収します。
4. CEシステムの構築
- 高電圧電源を使用してパルス電界を生成します。正極と負極に注意してください。
- 水銀ランプを光源とし、水銀ランプからの励起波長をフィルターでろ過します。
- キャピラリーを顕微鏡ステージに置きます。
- 対物レンズで蛍光発光を捕集し、R928光電子増倍管(PMT)を用いて検出します。顕微鏡とキャピラリーを観察します。暗い部屋の条件下でライトをオンにします。励起光は対物レンズによって収集されます。
- 自社開発のLABVIEWソフトウェアを使用して電源を制御し、データ集録を完了します(ステップ6.3-6.6で説明)。https://github.com/starliyan/labview/blob/main/CZE20170723.vi を参照してください。
注:すべての実験は暗室で行われ、CEシステムの概略図を 図4に示します。
5. PCR溶液の実行
- CF-PCRシステムのヒーターの温度を65°Cと95°Cにプリセットします。
- マイクロ流体チップを2つの加熱ブロックの上に置きます。
- シリコンチューブの先端を、50 μLのPCR溶液が入った遠心チューブに挿入します(ステップ2.3から)。シリンジプランジャーを引いて、溶液をゆっくりと引き出します。シリンジをシリンジポンプに固定します。スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。
- ポンプの流量を10μL/minに設定し、 スタート ボタンを押して、マイクロチップの入口にあるマイクロ流路に溶液を押し込みます。
- マイクロ流体チップの出口でPCR産物を回収します。
注:PCRの前後にチャネルを超純水ですすぎ、不純物を除去します。
6. 自社開発のCEシステムによるPCR産物の検出
- 全長8cm、有効長6cmのキャピラリーを用意します。
- 100 μL の 1% ヒドロキシエチルセルロース(HEC、w/v)、2 μL の 100x SYBR Green I、98 μL の超純水を混合して分離バッファーを調製し、1x SYBR Green I を含む 0.5% HEC(w/v)を得ます。
- 真空ポンプを使用して、調製した分離バッファーをキャピラリーに充填します。
- 注入電圧(800 V)と注入時間(2.0 秒)をソフトウェアインターフェースに入力し、スタートボタンをクリックして、PCR産物が100 V/cm(2.0 秒)でキャピラリーに電気力学的に導入されるのを待ちます。
注:このステップでは、PCR産物を負極に置き、バッファーを正極に置きます。 - ソフトウェアインターフェースでDC電圧(800 V)を入力し、スタートボタンをクリックして、100 V/cmの電界強度で電気泳動を実行します。
注:このステップでは、正極と負極の両方をバッファーと一緒に配置します。 - すべてのDNA断片がキャピラリーで分離されたら、 停止 ボタンをクリックします。
- 各実行後、キャピラリーを滅菌水で1分間洗い流します。
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Representative Results
図5は、PCR産物とDNAマーカーのエレクトロフェログラムを表しています。トレース(図 5A)は CF-PCR 増幅産物の CE 結果、トレース(図 5B)はサーマルサイクルで増幅した産物の CE 結果、トレース(図 5C)は 100 bp DNA ラダーの CE 結果です。まず、CF-PCRシステムで大腸菌の標的遺伝子を増幅しました。PCR溶液は、チップの入口から出口まで10~30秒かかりました。大腸菌の標的アンプリコンのサイズは544bpであった。増幅したPCR産物をCEシステムで分析し、100 bpのDNAラダーのCEも同じ実験条件で行いました。PCR産物のサイズは、DNAラダーのエレクトロフェログラムに従って評価できます。各実験は再現性のために3回行った。図5のデータは、大腸菌のPCR産物に対応するピークが分離後に観察され、マイクロ流体チップ内のPCR産物の移動時間がサーマルサイクラーのものと一致していることを示しています。
図1:洗浄されたシリコンウェーハ。 スケールバー = 1 cm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:PDMSを用いて作製されたCF-PCRマイクロ流体チップ。 マイクロチャネルは、視覚化のために赤いインクで満たされました。スケールバー = 1 cm。略語:CF-PCR = continuous-flow-PCR;PDMS = ポリジメチシロキサン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:CF-PCRシステム 。 (1)マイクロ流体チップ、(2)PTCセラミックヒーター、(3)シリンジ、(4)ポンプ、(5)シリコンチューブ、(6)スロット、(7)スチールニードル、(8)ピペットチップ、(9)PID温度コントローラー、(10)温度センサー、(11)ソリッドステートリレー。略語:CF-PCR = continuous-flow-PCR。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:CEシステムの構築 略語:CE =キャピラリー電気泳動;PMT = 光電子増倍管;A1、A2 =フィルター;B =フィールドレンズ;C = ダイクロイックミラー。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:大腸菌のエレクトロフェログラム。 (A)CF-PCRマイクロ流体チップ、(B)従来のPCRサーマルサイクラー、および(C)DNAマーカーによる増幅。略語:CF-PCR = continuous-flow-PCR。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| ターゲット | 配列5'......3′ | アンプリコン(bp) | ||
| EC-F(エフ) | GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC | 544 | ||
| EC-R(エシーアール) | AGCCCGGGGGGATTTCACATCTGACTTA | |||
表1:大腸菌に用いたプライマー。略語:EC = Escherichia coli;F = フォワード;R = 逆。
| 10 x 高速バッファ I | 5.0μL |
| dNTP混合物(2.5 μM) | 4.0μL |
| SpeedSTAR HS DNAポリメラーゼ | 0.25μL |
| ポリビニルピロリドン(PVP) | 3.5μL |
| トゥイーン 20 | 1.5μL |
| テンプレート | 1.0 μL |
| EC-F(エフ) | 0.5μL |
| EC-R(エシーアール) | 0.5μL |
| 純水 | 33.75μL |
表2:PCR溶液の成分。 略語:EC = Escherichia coli;F = フォワード;R = 逆。
補足ファイル1:3Dプリント用のSTLファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。本稿では、自社で構築したCF-PCRシステムとCEシステムを用いた 大腸菌 の増幅とPCR産物の検出について述べる。 大腸菌 の標的遺伝子は、熱伝達率が高いため、10分以内に増幅することに成功しました。1,500 bp 未満の DNA 断片は 8 分以内に分離されました(図 5)。これら2つの技術の大きな利点は、従来のPCRおよびスラブゲル電気泳動法と比較して時間を大幅に節約できることです。研究者は、CF-PCRマイクロ流体チップは使用後に洗浄する必要があり、CEシステムはサンプルの汚染を避けるために清潔で黒い家に構築する必要があることを念頭に置く必要があります。本研究で紹介したマイクロ流体チップとCEシステムをベースにしたCF-PCRシステムは、製造が容易であり、ラボでの核酸分析のための簡便な方法を提供する可能性がある。しかし、CF-PCRの限界は、一度に1つのサンプルしか増幅および検出できないことであり、その幅広い用途が制限される可能性があります。これに対抗するために、ユーザーはこの問題を解決するために統合されたCF-PCRおよびCEアレイマイクロ流体チップを開発することができます。本研究で報告されたプラットフォームは、感染症の臨床診断や核酸研究の分野で大きな応用の可能性を秘めています。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
本研究は、中国上海市科学技術委員会(No.19ZR1477500、No.18441900400)の支援を受けて行われました。上海大学科学技術支援(No.2017KJFZ049)の助成に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| developer solution | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP mixture (2.5 μM) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC,1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| microscope | Olympus, Japan | BX51 | |
| photolithography | SUSS MicroTec, Germany | MJB4 | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| photoresist | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID temperature controllers | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| polyvinyl pyrrolidone (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| silicone tubing | BIO-RAD,USA | 7318210 | |
| solid-state relays | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| steel needle | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  |
Solarbio, Beijing, China | SY1020 | |
| temperature sensors | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Template (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| voltage power supply | Medina, NY, USA | TREK MODEL 610E |
References
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- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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