Summary
彩虹状拉曼染料的电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像是高度多重表位蛋白质成像的新平台。在这里，我们提供了一个实用指南，包括抗体制备，组织样品染色，SRS显微镜组装和epr-SRS组织成像。
Abstract
可视化组织中广泛的特定生物标志物在探索复杂生物系统的复杂组织方面起着至关重要的作用。因此，高度多路复用的成像技术越来越受到赞赏。在这里，我们描述了一个新兴的平台，通过彩虹状拉曼染料的电子预共振激发拉曼散射（epr-SRS）成像，对特定蛋白质进行高度多重振动成像，其灵敏度与标准免疫荧光相当。该方法规避了传统免疫荧光中光谱可分辨通道的极限，并提供了一种一次性光学方法，以亚细胞分辨率询问组织中的多个标记物。它通常与标准组织制剂相容，包括多聚甲醛固定组织，冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人体组织。我们设想该平台将提供生物标本蛋白质相互作用的更全面图片，特别是对于厚的完整组织。该协议提供了从抗体制备到组织样品染色，再到SRS显微镜组装，再到epr-SRS组织成像的工作流程。
Introduction
复杂的组织系统由不同的细胞亚群组成，其空间位置和相互作用网络与其功能和功能障碍深深交织在一起1，2。为了揭示组织结构并质疑其复杂性，了解蛋白质在单细胞分辨率下的空间位置至关重要。因此，高度多重的蛋白质成像技术越来越受到赞赏，并可能成为研究组织生物学的基石3，4，5。目前常用的多重蛋白质成像方法可分为两大类。一种是依靠多轮组织染色和成像的连续免疫荧光成像，另一种是成像大量细胞术与重金属标记抗体6，7，8，9，10，11，12。
在这里，介绍了基于多重抗体的蛋白质成像的替代策略。与流行的荧光成像模式不同，由于激发和发射光谱宽（半最大值全宽（FWHM）~500 cm-1），拉曼显微镜只能同时显示4-5个通道，拉曼显微镜表现出更窄的光谱线宽（FWHM~10 cm-1），因此提供可扩展的多重性。最近，通过利用窄光谱，开发了一种名为电子预共振激发拉曼散射（epr-SRS）显微镜的拉曼显微镜新方案，为多路复用成像提供了强大的策略13。通过探测拉曼染料的电子耦合振动模式，epr-SRS在拉曼横截面上实现了10倍的大幅增强效果，并克服了传统拉曼显微镜的灵敏度瓶颈（图1A）13，14，15。因此，epr-SRS的检测限已被推至亚μM，这使得拉曼能够检测出有趣的分子标记物，例如细胞内的特定蛋白质和细胞器13，16。特别是，利用拉曼染料偶联抗体，细胞和组织中特定蛋白质的epr-SRS成像（称为免疫-eprSRS）被证明具有与标准免疫荧光相当的灵敏度（图1B）13，17。通过仅将泵浦波长调谐2 nm，epr-SRS信号将完全关闭（图1B），这显示出高振动对比度。
在探针侧，已经开发了一组称为曼哈顿拉曼散射（MARS）染料的彩虹状拉曼探针，用于抗体偶联13，18，19，20。这种独特的拉曼调色板由具有π共轭三键（补充材料）的新型染料组成，每种染料在生物正交拉曼光谱范围内显示单个窄的epr-SRS峰（图1C）。通过修改核心发色团的结构并同位素编辑三键的两个原子（补充材料），已经开发了光谱分离的拉曼探针。利用可扩展的多重性，epr-SRS显微镜与MARS染料调色板相结合，为细胞和组织中的一次性多重蛋白质成像提供了一种光学策略。
Immuno-eprSRS为当前具有独特优势的多重蛋白质成像方法提供了一种替代策略。与具有循环染色、成像和信号去除功能的荧光方法相比，这种基于拉曼的平台可确保单轮染色和成像。因此，它规避了循环程序的实际复杂性，并在很大程度上简化了方案，从而开辟了多重蛋白质成像的新领域。例如，利用拉曼染料定制的组织清除方案，immuno-eprSRS已扩展到三维，用于在厚完整组织中进行高度多重的蛋白质图谱17。沿着毫米厚的小鼠脑组织观察超过10个蛋白质靶标17。最近，将免疫-eprSRS与优化的生物分子保留膨胀显微镜（ExM）方案21偶联，还证明了多个靶标的一次性纳米级成像22。与成像质谱4，9相比，epr-SRS是无损的，并且具有固有的光学切片能力。此外，epr-SRS在组织扫描上更省时。通常，对于单个epr-SRS通道，像素尺寸为0.5μm的0.25 mm 2 的组织区域只需几分钟即可成像。例如， 图4 中四个SRS通道加四个荧光通道的总成像时间约为10分钟。
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Protocol
该协议是根据哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案（AC-AABD1552）进行的。
1. 拉曼染料偶联抗体的制备
- 将偶联缓冲液制备为PBS缓冲液中〜0.1M NaHCO3 ，pH = 8.3，储存在4°C。
- 在无水DMSO中制备N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能MARS探针（补充材料）溶液作为3mM。MARS探测器的合成可参考先前的报告13，17，18。
注意：出于储存目的，必须保护染料NHS酯溶液免受光照并保持在-20°C。 - 将抗体固体溶解在偶联缓冲液中至2mg / mL的浓度。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，用离心过滤器将它们交换到偶联缓冲液中，浓度为1-2mg / mL。
注意：高度交叉吸附的二抗是多重染色的首选，以最大限度地减少跨物种反应性。使用的二抗列于 表1 和 材料表中。 - 进行共轭反应。
- 对于二抗，在搅拌下缓慢地将15倍摩尔过量的染料溶液加入玻璃瓶中的抗体溶液中。例如，在0.5 mL 2 mg / mL抗体溶液中，加入35 μL 3 mM染料溶液。
- 将反应混合物在室温（RT）下搅拌1小时孵育。保护反应免受光照。
- 纯化。
- 按照步骤1.5.2-1.5.4在PBS缓冲液中制备凝胶过滤树脂浆料（材料表）。
- 将10 mL凝胶过滤树脂粉末加入50 mL管内的40 mL PBS缓冲液中。
- 将溶液在90°C水浴中保持1小时。
- 倾析上清液，重新加入PBS至40 mL。将浆料储存在4°C。
- 将尺寸排阻柱（直径1厘米，重力流柱）与浆液溶液一起包装至10-15厘米的高度。
- 用~10 mL PBS缓冲液冲洗并洗涤色谱柱，以进一步包装树脂。
- 将共轭反应混合物（~0.5 mL）移入色谱柱。当加载所有反应混合物时，立即加入1 mL PBS缓冲液作为洗脱缓冲液。不断将洗脱缓冲液（PBS）重新填充到色谱柱中。
- 通过观察色谱柱上的颜色（MARS染料具有浅绿色至蓝色）或测量280nm处的吸光度（A280）来收集共轭溶液的洗脱液。
- 用离心过滤器将收集的溶液浓缩至1-2mg / mL。
- 通过使用纳米板读数仪测量偶联物溶液的紫外 -可见光 （UV-Vis） 光谱来确定标记的浓度和平均程度（DOL，染料与蛋白质的比例）。
注意： 补充材料 提供了用于计算的MARS染料NHS酯的性质。二抗的正常DOL约为3。
2. 组织样品制备
- 多聚甲醛固定小鼠脑组织。
- 用异氟醚麻醉小鼠（C57BL / 6J，雌性，产后25天）。通过脚趾捏合测试评估适当的麻醉。
- 通过宫颈置换杀死小鼠。立即用PBS中4%多聚甲醛（PFA）透心注射小鼠。
- 按照步骤2.1.4-2.1.5收集小鼠大脑
- 从脑干沿着矢状缝合线向上切开。将头骨的两半剥开到一边，用镊子舀出大脑。
- 将收集的大脑固定在4°C下PBS中的4%PFA中24小时。然后，在4°C的PBS缓冲液中洗涤大脑24小时以除去多余的PFA。
- 将固体琼脂糖放入水中，最终浓度为7%（w / v），放入烧杯中，盖上松动的盖子。用玻璃搅拌棒搅拌溶液。在微波炉中加热浆料，直到溶液变清。
- 让琼脂糖冷却至45-55°C。
- 将液体琼脂糖倒入一个小腔室中，然后将大脑从PBS转移到液体琼脂糖中，并用刮刀将其定向以嵌入大脑。等待组织琼脂糖阻滞硬化。
- 使用振动切片机将组织 - agrose切片成40μm厚的冠状切片。
- 将组织转移到4孔板上进行以下染色。用镊子去除琼脂糖。用1毫升PBS洗涤组织，三次。
- 固定冷冻小鼠胰腺组织。
- 在4°C下将小鼠胰腺固定在PBS中的4%PFA中，摇摆16-20小时。
- 将样品在1mL PBS（4°C）中洗涤三次以除去PFA。
- 将样品（尺寸约0.3-0.5厘米）嵌入最佳切割温度（OCT）化合物块中。将2滴OCT放入塑料冷冻室中。将组织以正确的方向放置，并将OCT倒在组织上，直到没有一个组织保持暴露状态。
- 将胰腺切片至8μm厚的切片，并将其固定在组织结合载玻片上，将其储存在-80°C中。
- 染色前，将标本平衡至室温，用PBS清洗组织以除去OCT阻滞。
- FFPE 示例。
- 将FFPE组织载玻片在60°C下烘烤10分钟。
- 脱蜡和补液：将样品按顺序置于以下溶液中，置于50mL试管中，室温静，每次3分钟，轻轻摇动：
二甲苯两次，
乙醇两次，
95%（体积/体积）乙醇在去离子水中两次，
70%（体积/体积）乙醇在去离子水中两次，
50%（体积/体积）乙醇在去离子水中一次，
去离子水一次。 - 将样品转移到玻璃罐中100°C的20mM柠檬酸钠（pH 8.0）中。确保组织浸入溶液中。
- 将罐子放入60°C水浴中45分钟。
- 用室温下去离子水洗涤样品5分钟。
3. 组织免疫免疫-eprSRS染色
- 使用疏水笔在载玻片上的组织部分周围绘制边界。
注意：载玻片染色罐用于跟踪载玻片上组织的孵育步骤。漂浮组织（40μm厚的小鼠脑切片）在孔板中染色。 - 用0.3-0.5%PBST（PBS中的Triton X-100）孵育组织10分钟。
- 用封闭缓冲液（5%驴血清，0.5%Triton X-100在PBS中）孵育组织30分钟。
- 制备初级染色溶液：将所有一抗以所需浓度加入200-500μL染色缓冲液（2%驴血清，0.5%Triton X-100 in PBS）中。将初级染色溶液以13，000× g 离心5分钟。仅当沉淀形成时才使用上清液。
- 将组织在4°C的一抗溶液中孵育1-2天。
注意：要在载玻片上染色组织切片，请将样品放入带有湿擦拭布的染色盒中以保持湿度。 - 用0.3-0.5%PBST在室温下洗涤载玻片三次，每次5分钟。对漂浮组织使用1毫升PBST。对于载玻片上的组织，在载玻片染色罐中洗涤载玻片，并确保组织全部浸入溶液中。
- 将组织在200-500μL封闭缓冲液中孵育30分钟。
- 制备二级染色溶液：将所有二抗（如果需要，还有凝集素）加入200-500μL具有所需浓度（通常为10μg/ mL）的染色缓冲液中。将二次染色溶液以13，000× g 离心5分钟。仅当沉淀形成时才使用上清液。
- 将组织在4°C的200-500μL二抗溶液中孵育1-2天。
- 在室温下用0.3-0.5%PBST洗涤载玻片两次，每次5分钟。
- 与200-500μLDAPI溶液孵育30分钟。
- 用PBS在室温下洗涤载玻片三次，每次5分钟。
- 对于漂浮的组织切片，用玻璃滴管将它们转移到载玻片上。用纸巾刷铺开纸巾，并在需要时用湿巾清洁周围。
- 用玻璃盖玻片将组织安装在一滴抗淬灭试剂中，并用指甲油固定。
4. SRS显微镜组件
注：商用共聚焦荧光系统用于串联SRS荧光成像。更多描述可以在以前的报告中找到17.该协议将专注于使用窄带激励的SRS成像侧。
- 在具有温度控制的房间里准备一个隔振光学工作台。
- 将同步的双激光系统（泵浦和斯托克斯）放在光学工作台上（图2A），并连接冷却器。
注意：双激光器系统中的基本激光器在1064 nm处提供输出脉冲序列，脉冲宽度为6 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束来自基波激光。斯托克斯光束的强度由内置的电光幅度调制器（EOM）以8 MHz正弦调制，调制深度超过90%。基波激光器的另一部分将频率加倍至 532 nm ，这进一步用于同步播种皮秒光学参数振荡器（ OPO ），以产生脉冲宽度为 5 - 6 ps 的锁模脉冲序列（ OPO 的惰性光束涉滤波片阻挡）。OPO的输出波长可在720-950 nm范围内调谐，用作泵浦光束。 - 将反射镜（波长范围：750-1100 nm）、二向色分束器（DBS，980 nm 长通滤光片，矩形）和透镜（消色差，650-1050 nm 的 AR 镀膜）安装到各自的安装座上。为镜子和二向色分束器使用非常稳定的运动镜架。
- 测量激光输出的高度以及泵浦和斯托克斯光束的光束尺寸。调整镜子和透镜的高度，以确保光线照射到所有光学元件的中心。
- 将反射镜M1放在光学工作台上，使其与激光输出约45°（图2B）。使用运动学安装座上的旋钮进行倾斜和倾斜调整。确保光线沿桌子的长度和相对于桌子的直线以相同的高度传播。
- 放置并对齐二向色分束器（980 nm长通滤光片）和反射镜以分割泵和斯托克斯光束（图2A-B）。
- 在每个光束路径上放置并对齐透镜对（L1，L2和L3，L4），以准直光束并扩大光束直径以匹配物镜的后瞳孔（图2A-B）。
- 使用M7和M8反射镜将组合的激光束对准显微镜（图2C）。首先将一束光束对准显微镜，并在另一束上使用镜子对，以确保两束光束的空间重叠。
- 设置检测部件。
- 戴上红外涂层的油冷凝器（1.4-NA），以在通过试样后收集前进泵和斯托克斯光束（图2C）。
- 将大面积硅光电二极管安装到带有BNC连接器的屏蔽盒上（图2E）。向安装的光电二极管添加一个64 V DC电源，以提高其饱和阈值和响应带宽。
- 用2英寸的镜子反射前进的光线。在光学滤光片后将光重新聚焦到光电二极管上，以阻挡调制斯托克斯光束（图2D）。
- 将光电二极管的输出电流发送到以50端接的快速锁相放大器，以进行信号解调。将一个8 MHz触发器作为参考信号发送到锁相放大器。
- 将锁相放大器的相位X分量送入显微镜的模拟接口盒中。
- 通过在显微镜下测量纯D2O液体的SRS信号，优化与内置电动延迟级的时间重叠。
5. 图像采集和分析
- 通过顺序泵浦波长调谐执行多通道 epr-SRS 成像。
- 在激光控制面板上将激光功率设置为 P泵浦 = 10-40 mW， P斯托克斯 = 40-80 mW。
- 将像素停留时间设置为2-4 μs，并在显微镜软件上使用多帧，平均10-20帧。
注意：避免组合使用高激光功率（P泵浦>40 mW， PStokes>80 mW）和小像素尺寸（<0.2 μm），这可能导致拉曼染料的“漂白效应”，因为多光子激发。 - 将锁相放大器的时间常数设置为像素停留时间的一半。
- 线性频谱解混。
注意：epr-SRS在整个浓度范围内遵循严格的线性信致浓度依赖性;因此，线性频谱解混可以有效地消除通道之间的任何潜在串扰。对于使用N个MARS探针进行N沟道epr-SRS测量，测量信号（S）可以表示为S = MC，其中C是MARS探针浓度，M是由MARS探针的拉曼横截面确定的N x N矩阵。- 在用不同MARS探针标记的单色免疫eprSRS样品上测量基质 M 。
- 使用等式 C = M−1·S 用多重样品信号测量 S来确定MARS探针的浓度矩阵。
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Representative Results
图3显示了不同样品中epr-SRS的示例图像，包括固定细胞（图3A），多聚甲醛（PFA）固定小鼠组织（图3B）和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人类标本（图3C）。SRS显微镜的空间分辨率受衍射限制，典型的横向分辨率约为300 nm，使用近红外光进行激发的轴向分辨率为1-2 μm。结果，通过α微管蛋白的免疫eprSRS成像，忠实地揭示了HeLa细胞中的微管等精细亚细胞结构（图3A）。此外，epr-SRS通常与FFPE组织相容（图3C），这是用于临床诊断和病理学研究的活检标本的常见形式。与双光子荧光显微镜类似，作为一种非线性过程，epr-SRS具有光学切片功能，可可视化具有亚细胞分辨率的三维图案（图3D-E）。
我们首先展示了epr-SRS在胰腺中朗格汉斯小鼠胰岛的固定冷冻组织样品上的多重蛋白质成像效用。选择几个感兴趣的靶点，包括用于细胞类型分类的激素表达（例如，胰岛素，葡萄糖激动剂（胰高血糖素），胰腺多肽（PP）和生长抑素）（β细胞和非β细胞（α-，δ细胞））和已知与β细胞异质性相关的转录因子23。值得注意的是，由于荧光检测与SRS检测正交，因此epr-SRS与共聚焦荧光和双光子荧光完全兼容。作为概念验证，在单个胰岛上轻松实现7色SRS荧光串联成像（图4），具有良好的对比度和正确的图案。低表达靶标（如转录因子Pdx1）以足够的对比度成像。
我们还在PFA固定的小鼠小脑组织中展示了八色SRS荧光串联成像（图5）。通过建立的生物标志物，可以鉴定不同的细胞类型，例如小脑颗粒神经元（NeuN），浦肯野神经元（Calbindin），星形胶质细胞（GFAP），少突胶质细胞（MBP）和GABA能神经元（GABA B2 受体）。
图 1：用于高度多重蛋白质成像的 Epr-SRS 显微镜。 （A） 自发拉曼、非共振 SRS 和电子预谐振 SRS （epr-SRS） 的能量图。在epr-SRS中，发色团的振动转变速率将提高10到13倍。（B）基于表位的α微管蛋白免疫成像在ATTO740染色的COS-7细胞中得到证实，epr-SRS具有高振动对比度。当泵浦激光波长仅偏离共振2 nm（右）时，epr-SRS信号完全消失。比例尺，20 μm. （C） 补充 材料中列出的NHS酯共轭MARS探针的Epr-SRS光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图2：SRS显微镜设置的设计。（A）SRS设置的示意图。EOM = 电光调制器，M = 反射镜，L = 透镜，DBS = 二向色分束器，DM = 二向色镜，OB = 物镜，CO = 聚光镜，F = 滤光片，PD = 光电二极管。（B）此面板显示了激光激发部分。来自激光输出的双色光束首先被分离，每束光束被准直和膨胀，然后组合并引导到显微镜体内。（C） 此面板显示带有冷凝器传输的集合。（D） 此面板显示 SRS 检测部分。光电二极管和滤光片安装在带有两个BNC母连接器的屏蔽盒上。较低的BNC连接器用于反向偏置电压，较高的BNC连接器用于将电流信号输出到以50 Ω端接的锁定放大器。请点击此处查看此图的大图。
图3：通过免疫标记对不同蛋白质标记物进行拉曼染料成像。（A）HeLa细胞中α微管蛋白的免疫-eprSRS成像。（B）PFA固定小鼠大脑皮层中NeuN的免疫-eprSRS成像。（C）人肾FFPE组织中维门汀的免疫-eprSRS成像。（D）在100μm厚的小鼠脑组织中染色GFAP的MARS2145的体积渲染图像。z中的步长为2μm（E）体积渲染的MARS2228染色的NeuN在40μm厚的小鼠脑组织中的图像。z中的步长为1μm。比例尺，20 μm in （A），50 μm in （B-C），30 μm in （D-E）。请点击此处查看此图的大图。
图4：冷冻小鼠胰岛组织上激素和转录因子的7色串联成像的代表性结果。 Epr-SRS：胰岛素（由Cy5检测，β细胞标记，绿色），Pdx1（由MARS2228检测，转录因子，红色），胰高血糖素（由MARS2216检测，α细胞标记物，黄色），PP（由MARS2147检测，PP细胞标记，蓝色）。荧光：生长抑素（Alexa488，δ细胞标记物，橙色），Nkx2.2（Cy3，转录因子，品红色），DAPI（细胞核，深蓝色）。比例尺，20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图5：PFA固定小鼠切片上细胞类型标记物的8色串联成像的代表性结果。荧光：DNA（DAPI），GABA（γ-氨基丁酸）B受体2（GABA能神经元，Alexa Fluor 488），神经元核（NeuN;神经元，Alexa Fluor 568）和Calbindin（浦肯野神经元，Alexa Fluor 647）;epr-SRS： 小麦胚芽凝集素 （WGA;MARS2228），Vimentin（MARS2200），髓鞘碱性蛋白（MBP;少突胶质细胞，MARS2176）和GFAP（星形胶质细胞和神经干细胞，MARS2145）。比例尺，50 μm。请点击此处查看此图的大图。
表 1：经过验证的免疫 eprSRS 抗体。 有关更多详细信息，请参阅 材料表 。 请按此下载此表格。
补充材料：8种使用NHS酯功能化MARS探头的性质。以1 cm玻璃比色皿为容器，在紫外可见分光度计的DMSO溶液中测定MARS染料的λabs和激发系数。在DMSO中，通过将MARS染料的epr-SRS信号与甲醇的标准C−O拉伸模式（1030 cm-1）进行比较，测定了MARS染料的绝对拉曼截面。据报道，甲醇标准C-O拉伸模式（1030 cm-1）的绝对拉曼横截面在785 nm处为2.1 x 10-30 cm 2。通过外推法估计在860nm泵浦波长下横截面为0.9 x 10-30 cm2。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们提出了免疫-eprSRS方案，该方案广泛适用于常见的组织类型，包括新鲜保存的小鼠组织，FFPE人体组织和冷冻小鼠组织。免疫-eprSRS已经验证了细胞和组织中的一组表位，如 表1所示。这种一次性平台特别适用于循环策略不能很好地运行的应用程序。例如，循环荧光对厚组织的要求很高，因为多轮3D免疫标记是不切实际的冗长17。由于非线性3D组织学变化11，17，也极有可能引入配准误差。在这种情况下，Immuno-eprSRS克服了环状荧光的实际障碍，并带来了在大量17中揭示蛋白质相互作用网络的机会。
目前的多重性主要受二抗可用性的限制。而在该方案中，我们专注于间接免疫标记，其中MARS探针与二抗偶联，直接免疫标记和凝集素染色是可行的17。经过拉曼染料的更多一抗验证后，预计目前开发的拉曼染料为13，18，24，20个通道。此外，对于epr-SRS来说，成像非常低丰度的目标可能具有挑战性，因为与共聚焦荧光系统相比，它的灵敏度略有降低。在这方面，我们建议将相对低丰度的靶标分配给较亮的MARS染料，将低表达的靶标分配给荧光通道。
该协议的一个关键方面是仪器和探头的可访问性。仪器方面，SRS显微镜通常由带有光调制器的双色激光源，显微镜，光电二极管检测器和用于解调的锁相放大器25组成。每个组件都是市售的，总成本略高于双光子激光扫描荧光显微镜。完全集成的多模态SRS/荧光研究显微镜已经商业化26 ，使用与此处类似的皮秒激光器进行SRS激发和连续波（CW）激光器组进行荧光。该系统易于适用于日常生物学研究中的多重振动成像。在探针方面，MARS探针尚未商业化，需要一些合成能力。或者，许多商业远红色荧光基团（参见L. Wei等人 的扩展 数据表1，Nature 201713）可用于epr-SRS。然而，多重性可能会受到影响。此外，由于MARS探针本质上是小的有机分子，因此在组织染色方面，immuno-eprSRS与免疫荧光相似。因此，经过验证的亲和试剂（如免疫荧光中的抗体）的存档可以很容易地转移到免疫-eprSRS应用中。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Ruth A. Singer和Richard K.P. Benninger提供小鼠胰腺组织。W.M.感谢NIH R01（GM128214），R01（GM132860），R01（EB029523）和美国陆军（W911NF-19-1-0214）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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