Summary
Elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) avbildning av regnbue-lignende Raman fargestoffer er en ny plattform for svært multiplekset epitop-basert protein avbildning. Her presenterer vi en praktisk guide, inkludert antistoffpreparat, vevsprøvefarging, SRS mikroskopmontering og epr-SRS vevsavbildning.
Abstract
Visualisering av et stort omfang av spesifikke biomarkører i vev spiller en viktig rolle i å utforske de intrikate organisasjonene av komplekse biologiske systemer. Derfor har svært multipleksede bildeteknologier blitt stadig mer verdsatt. Her beskriver vi en ny plattform med svært multippelxed vibrasjonsavbildning av spesifikke proteiner med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens via elektronisk pre-resonans stimulert Raman spredning (epr-SRS) bildebehandling av regnbuelignende Raman fargestoffer. Denne metoden omgår grensen for spektralt løselige kanaler i konvensjonell immunfluorescence og gir en ett-skudds optisk tilnærming for å forhøre flere markører i vev med subcellulær oppløsning. Det er generelt kompatibelt med standard vevspreparater, inkludert paraformaldehydfast vev, frossent vev og formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) humant vev. Vi ser for oss at denne plattformen vil gi et mer omfattende bilde av proteininteraksjoner av biologiske prøver, spesielt for tykt intakt vev. Denne protokollen gir arbeidsflyten fra antistoffpreparat til vevsprøvefarging, til SRS mikroskopmontering, til epr-SRS vevsavbildning.
Introduction
Komplekse vevssystemer består av distinkte cellulære subpopulasjoner hvis romlige steder og interaksjonsnettverk er dypt sammenflettet med deres funksjoner og dysfunksjoner 1,2. For å avsløre vevsarkitekturen og forhøre kompleksiteten, er kunnskap om de romlige plasseringene av proteiner ved encellet oppløsning viktig. Derfor har svært multipleksede proteinavbildningsteknologier blitt stadig mer verdsatt og kan bli en hjørnestein for å studere vevsbiologi 3,4,5. Nåværende vanlige multipleksede proteinavbildningsmetoder kan klassifiseres i to hovedkategorier. Den ene er seriell immunfluorescensavbildning som er avhengig av flere runder med vevsfarging og avbildning, og den andre er bildemassecytometri kombinert med tungmetallmerkede antistoffer 6,7,8,9,10,11,12.
Her innføres en alternativ strategi for multiplekset antistoffbasert proteinavbildning. I motsetning til den utbredte fluorescensavbildningsmodaliteten, som bare kan visualisere 4-5 kanaler samtidig på grunn av den brede eksitasjonen og utslippsspektraet (full bredde ved halv maksimum (FWHM) ~ 500 cm-1), viser Raman-mikroskopi mye smalere spektral linewidth (FWHM ~ 10 cm-1) og gir dermed skalerbar multipleksitet. Nylig, ved å utnytte det smale spekteret, har en ny ordning med Raman-mikroskopi kalt elektronisk pre-resonans stimulert Raman-spredning (epr-SRS) mikroskopi blitt utviklet, noe som gir en kraftig strategi for multiplekset bildebehandling13. Ved å undersøke de elektronisk koblede vibrasjonsmodusene til Raman-fargestoffer oppnår epr-SRS en drastisk forbedringseffekt på10 13 ganger på Raman-tverrsnitt og overvinner følsomhetsflaskehalsen til konvensjonell Raman-mikroskopi (figur 1A)13,14,15. Som et resultat har deteksjonsgrensen for epr-SRS blitt presset til sub-μM, noe som muliggjør Raman-deteksjon av interessante molekylære markører som spesifikke proteiner og organeller inne i cellene13,16. Spesielt ved bruk av Raman fargestoffkonjugede antistoffer ble epr-SRS-avbildning av spesifikke proteiner i celler og vev (kalt immuno-eprSRS) demonstrert med sammenlignbar følsomhet for standard immunfluorescens (figur 1B) 13,17. Ved å justere pumpebølgelengden med bare 2 nm, vil epr-SRS-signalet være helt av (figur 1B), som viser høy vibrasjonskontrast.
På sondesiden er det utviklet et sett med regnbuelignende Raman-sonder kalt Manhattan Raman-spredning (MARS) fargestoffer for antistoffkonjugering 13,18,19,20. Denne unike Raman-paletten består av nye fargestoffer som bærer π-konjugiserte trippelbindinger (tilleggsmateriale), som hver viser en enkelt og smal epr-SRS-topp i det bioortogonale Raman-spektralområdet (figur 1C). Ved å modifisere strukturen til kjernekromoforen og isotopisk redigere begge atomene av trippelbindingen (supplementært materiale), er det utviklet spektralt separerte Raman-sonder. Ved hjelp av den skalerbare multipleksiteten tilbyr epr-SRS-mikroskopi kombinert med MARS-fargepaletten en optisk strategi for ett-skudds multipleksproteinavbildning i celler og vev.
Immuno-eprSRS gir en alternativ strategi for dagens multipleks proteinavbildningsmetoder med unike styrker. Sammenlignet med fluorescens tilnærminger med syklisk farging, avbildning og signalfjerning, sikrer denne Raman-baserte plattformen en-rund farging og avbildning. Derfor omgår den praktisk kompleksitet i sykliske prosedyrer og forenkler i stor grad protokollen, og åpner dermed nye territorier for multiplekset proteinavbildning. For eksempel, ved å utnytte en Raman-farget-skreddersydd vevsryddingsprotokoll, har immuno-eprSRS blitt utvidet til tre dimensjoner for svært multiplekset proteinkartlegging i tykt intakt vev17. Over 10 proteinmål ble visualisert langs millimeter tykk musehjernevev17. Mer nylig, kobling immuno-eprSRS med en optimalisert biomolekyl-oppbevaring ekspansjon mikroskopi (ExM) protokoll21, ett-skudd nanoskala bildebehandling av flere mål har også blitt demonstrert22. Sammenlignet med avbildningsmassespektroskopi 4,9, er epr-SRS ikke-ødeleggende og har iboende optisk seksjoneringsevne. Videre er epr-SRS mer tidseffektiv på vevsskanning. Vanligvis tar et vevsområde på 0,25 mm2 med en pikselstørrelse på 0,5 μm bare noen få minutter å bilde for en enkelt epr-SRS-kanal. For eksempel er den totale bildetiden til fire SRS-kanaler pluss fire fluorescenskanaler i figur 4 ca. 10 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen ble utført i samsvar med dyreforsøksprotokollen (AC-AABD1552) godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University.
1. Fremstilling av Raman-farget-konjugede antistoffer
- Klargjør konjugeringsbufferen som ~0,1 M NaHCO3 i PBS-buffer, pH = 8,3, oppbevar ved 4 °C.
- Forbered N-hydroksysuccinimid (NHS) esterfunksjonell MARS-sonde (tilleggsmateriale) løsning som 3 mM i vannfri DMSO. Syntese av MARS-sonder kan henvises til tidligere rapporter 13,17,18.
MERK: For oppbevaringsformål må fargestoffet NHS ester oppløsning beskyttes mot lys og holdes ved -20 °C. - Løs opp antistoffstoffstoffer i konjugeringsbufferen til en konsentrasjon på 2 mg/ml. For antistoffer som er oppløst i andre buffere, bytt dem inn i konjugeringsbufferen til en konsentrasjon på 1-2 mg / ml med sentrifugalfiltre.
MERK: Svært kryss adsorberte sekundære antistoffer foretrekkes for multipleksfarging for å minimere reaktivitet på tvers av arter. De sekundære antistoffene som brukes er oppført i tabell 1 og materialliste. - Utfør konjugeringsreaksjonen.
- For sekundære antistoffer, tilsett 15 ganger molar overskudd av fargestoffløsning til antistoffoppløsningen i et hetteglass med glass sakte med omrøring. For eksempel, i 0,5 ml 2 mg / ml antistoffoppløsning, tilsett 35 μL 3 mM fargestoffoppløsning.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur (RT) med omrøring i 1 time. Beskytt reaksjonen mot lys.
- Rensing.
- Forbered slurry av gelfiltreringsharpiks (Materialliste) i PBS-buffer, i trinn 1.5.2-1.5.4.
- Tilsett 10 ml gelfiltreringsharpikspulver i 40 ml PBS-buffer inne i et 50 ml rør.
- Oppbevar oppløsningen i et 90 °C vannbad i 1 time.
- Dekanter supernatanten og legg PBS til 40 ml på nytt. Oppbevar slammet ved 4 °C.
- Pakk størrelsesekskluderingskolonnen (1 cm diameter, gravitasjonsstrømningskolonner) med slurryoppløsningen til høyden 10-15 cm.
- Skyll og vask kolonnen med ~10 ml PBS-buffer for å pakke harpiksen ytterligere.
- Rør konjugeringsreaksjonsblandingen (~ 0,5 ml) til kolonnen. Tilsett umiddelbart 1 ml PBS-buffer som elutionbuffer når all reaksjonsblanding lastes. Fyll hele tiden elutionbufferen (PBS) på kolonnen.
- Samle eluate av konjugatløsningen ved å se på fargen på kolonnen (MARS fargestoffer har lysegrønne til blå farger) eller måle absorbansen ved 280 nm (A280).
- Konsentrer den oppsamlede oppløsningen til 1-2 mg/ml med et sentrifugalfilter.
- Bestem konsentrasjonen og den gjennomsnittlige graden av merking (DOL, fargestoff-til-protein-forhold) ved å måle det ultrafiolette synlige (UV-Vis) spekteret av konjugatløsningen med en Nano-plateleser.
MERK: Tilleggsmateriale gir egenskaper til MARS-farge NHS-estere for beregning. Den normale DOL for sekundært antistoff er rundt 3.
2. Vev prøve forberedelse
- Paraformaldehyd fast mus hjernevev.
- Bedøv musene (C57BL/6J, Female, 25 d postnatal) med isofluran. Vurder riktig bedøvelse med en tåklemmetest.
- Drep musene ved cervical forskyvning. Perfuse musene umiddelbart med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS transkardialt.
- Samle inn musehjernen ved å følge trinn 2.1.4-2.1.5
- Skjær oppover fra hjernestammen langs sagittal suturen. Skrell de to halvdelene av skallen bort til siden og øs ut hjernen med en pinsett.
- Fest den innsamlede hjernen i 4% PFA i PBS ved 4 °C i 24 timer. Vask deretter hjernen i PBS-buffer ved 4 °C i 24 timer for å fjerne overflødig PFA.
- Plasser fast agarose i vann til en endelig konsentrasjon på 7% (w / v) i et beger, med et løst lokk. Rør løsningen med en glassrørestang. Varm opp slammet i mikrobølgeovn til oppløsningen er klar.
- La agarose avkjøles til 45-55 °C.
- Hell væsken agarose inn i et lite kammer, overfør deretter hjernen fra PBS til flytende agarose og orienter den med en spatel for å legge inn hjernen. Vent til vev-agarose blokken å herdes.
- Del vev-agrose i 40-μm tykke koronalskiver ved hjelp av en vibratom.
- Overfør vevet til en 4-brønns plate for følgende farging. Fjern agarose med en pinsett. Vask vevet med 1 ml PBS, tre ganger.
- Fast frossen mus bukspyttkjertel vev.
- Fest musen pankrea i 4% PFA i PBS ved 4 °C med gynging i 16-20 timer.
- Vask prøven i 1 ml PBS (4 °C) tre ganger for å fjerne PFA.
- Bygg inn prøven (~0,3-0,5 cm i størrelse) i optimale skjæringstemperatur (OCT) sammensatte blokker. Sett 2 dråper OCT i en plastkryomold. Plasser vevet i riktig orientering og hell OCT på toppen av vevet til ingen av vevet forblir utsatt.
- Del bukspyttkjertelen til 8-μm tykke skiver og immobiliser dem på et vevsbindende glasssklie, lagre dem i -80 °C.
- Før farging, likevekt prøven til RT. Vask vevet med PBS for å fjerne OCT-blokker.
- FFPE-prøver.
- Stek FFPE-vevsskuffen ved 60 °C i 10 minutter.
- Deparaffinering og rehydrering: Plasser prøver sekvensielt i følgende løsninger i et 50 ml rør ved RT i 3 minutter hver gang med mild risting:
xylen to ganger,
etanol to ganger,
95% (vol/vol) etanol i deionisert vann to ganger,
70% (vol/vol) etanol i deionisert vann to ganger,
50% (vol/vol) etanol i deionisert vann en gang,
deionisert vann en gang. - Overfør prøven til 20 mM natriumsitrat (pH 8,0) ved 100 °C i en glassburk. Pass på at vevet er nedsenket i løsningen.
- Sett kannen i et 60 °C vannbad i 45 min.
- Vask prøven med deionisert vann ved RT i 5 min.
3. Vev immuno-eprSRS farging
- Bruk en hydrofob penn til å tegne en grense rundt vevsdelene på lysbildet.
MERK: En skyveflekkekanne brukes til å følge inkubasjonstrinnene for vev på lysbildet. Flytende vev (40-μm tykke musehjerneseseksjoner) er farget i brønnplater. - Inkuber vevet med 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 i PBS) i 10 min.
- Inkuber vevet med blokkeringsbuffer (5% eselserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) i 30 min.
- Forbered den primære fargingsløsningen: Tilsett alle primære antistoffer til 200-500 μL fargebuffer (2% eselserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) ved ønskede konsentrasjoner. Sentrifuger den primære fargingsløsningen på 13.000 x g i 5 min. Bruk bare supernatanten hvis det dannes utfellinger.
- Inkuber vevet i den primære antistoffoppløsningen ved 4 °C i 1-2 dager.
MERK: For fargevevsseksjoner på lysbildet, legg prøven i en fargeboks med våtserviett for å opprettholde fuktighet. - Vask lysbildene tre ganger med 0,3-0,5 % PBST ved RT i 5 minutter hver. Bruk 1 ml PBST for flytende vev. For vev på lysbildet, vask lysbildene i en glidende fargekanne og sørg for at vevet alle er nedsenket i løsningen.
- Inkuber vevet i 200-500 μL blokkeringsbuffer i 30 min.
- Forbered den sekundære fargingsløsningen: Tilsett alle sekundære antistoffer (og lectins om nødvendig) til 200-500 μL fargebuffer med ønskede konsentrasjoner (normalt 10 μg / ml). Sentrifuger den sekundære fargingsløsningen på 13.000 x g i 5 min. Bruk bare supernatanten hvis det dannes utfellinger.
- Inkuber vevet i 200-500 μL sekundær antistoffoppløsning ved 4 °C i 1-2 dager.
- Vask lysbildene to ganger med 0,3-0,5 % PBST ved RT i 5 minutter hver.
- Inkuber med 200-500 μL DAPI-oppløsning i 30 min.
- Vask lysbildene tre ganger med PBS på RT i 5 minutter hver.
- For flytende vevsseksjoner, overfør dem til glasssklier med en glassfallende pipette. Spre vevet med en vevsbørste og rengjør omgivelsene med våtservietter om nødvendig.
- Monter vevet i en dråpe antifade reagenser med glassdeksler og fest det med neglelakk.
4. SRS mikroskop montering
MERK: Et kommersielt konfokalt fluorescenssystem brukes i tandem SRS-fluorescensavbildning. Flere beskrivelser finner du i en tidligere rapport17. Denne protokollen vil fokusere på SRS-bildesiden ved hjelp av smalbåndeksitasjon.
- Forbered et vibrasjonsisolert optisk bord i et rom med temperaturkontroll.
- Plasser et synkronisert dobbeltlasersystem (pumpe og Stokes) på det optiske bordet (figur 2A) med en kjøler tilkoblet.
MERK: Den grunnleggende laseren i dobbeltlasersystemet gir et utgangspulstog på 1064 nm med 6-ps pulsbredde og 80 MHz repetisjonshastighet. Stokes-strålen er fra den grunnleggende laseren. Intensiteten til Stokes-strålen ble modulert sinusformet av en innebygd elektrooptisk amplitudemodulator (EOM) ved 8 MHz med en modulasjonsdybde på mer enn 90%. Den andre delen av den grunnleggende laseren er frekvens-doblet til 532 nm, som videre brukes til å synkront frø en picosecond optisk parametrisk oscillator (OPO) for å produsere en modus-låst puls tog med 5-6 ps puls bredde (idler strålen av OPO er blokkert med et interferometrisk filter). Utgangsbølgelengden til OPO er justerbar fra 720-950 nm, som fungerer som pumpebjelke. - Monter speilene (bølgelengdeområde: 750-1100 nm), dikroiske strålesplittere (DBS, 980 nm langpassfilter, rektangulært) og linse (akromatisk, AR-belegg for 650-1050 nm) til sine respektive fester. Bruk svært stabilkinematiske speilfester for speil og dikroiske strålesplittere.
- Mål høyden på laserutgangen og strålestørrelsene på pumpen og Stokes-bjelkene. Juster høyden på speil og linser for å sikre at lyset treffer midten av alle de optiske elementene.
- Plasser speil M1 på det optiske bordet og gjør det ~45° til laserutgangen (figur 2B). Bruk knottene på det kinematiske braketten til å foreta spiss- og vippejusteringer. Sørg for at lyset beveger seg i samme høyde langs bordets lengde og en rett linje med hensyn til bordet.
- Plasser og juster dikroiske strålesplittere (980 nm langpassfiltre) og speil for å dele pumpen og Stokes-bjelkene (figur 2A-B).
- Plasser og juster linsepar (L1, L2 og L3, L4) på hver av bjelkebanene for å kollatere bjelkene og utvide bjelkediameterne slik at de samsvarer med bakeleven til målet (figur 2A-B).
- Bruk speilene M7 og M8 til å justere kombinerte laserstråler i mikroskopet (figur 2C). Juster den ene strålen inn i mikroskopet først og bruk speilparene på den andre strålen for å sikre den romlige overlappingen av de to bjelkene.
- Sett opp gjenkjenningsdelen.
- Sett på en infrarød-belagt oljekondensator (1,4-NA) for å samle den fremovergående pumpen og Stokes-bjelkene etter å ha passert prøvene (figur 2C).
- Monter en Si-fotodiode i stort område på en skjermet boks med BNC-kontakter (figur 2E). Legg til en 64 V DC strømforsyning i den monterte fotodioden for å øke metningsterskelen og responsbåndbredden.
- Reflekter lyset fremover med et 2-tommers speil. Fokuser lyset på fotodioden på nytt etter et optisk filter for å blokkere den modulerende Stokes-strålen (figur 2D).
- Send fotodiodens utgangsstrøm til en rask innlåsingsforsterker avsluttet med 50 for signaldemodulering. Send en 8 MHz-utløser til innlåsingsforsterkeren som referansesignal.
- Send X-komponenten i innlåsingsforsterkeren inn i mikroskopets analoge grensesnittboks.
- Optimaliser den tidsmessige overlappingen med det innebygde motoriserte forsinkelsesstadiet ved å måle SRS-signalet for ren D2O-væske ved mikroskopet.
5. Bildeanskaffelse og analyse
- Utfør flerkanals epr-SRS-avbildning med sekvensiell pumpebølgelengdejustering.
- Sett laserkraften til P-pumpen = 10-40 mW og P Stokes = 40-80 mW på laserkontrollpanelet.
- Sett pikselbotid til 2-4 μs og bruk flere rammer i gjennomsnitt vanligvis 10-20 bilder på mikroskopiprogramvaren.
MERK: Unngå en kombinatorisk bruk av høy lasereffekt (P-pumpe> 40 mW, PStokes> 80 mW) og liten pikselstørrelse (<0,2 μm), som sannsynligvis forårsaker 'bleking effekt' av Raman fargestoffer på grunn av multifoton eksitasjon. - Still inn tidskonstantene til låseforsterkeren til halvparten av pikselens oppholdstid.
- Lineær spektral unmixing.
MERK: epr-SRS følger en streng lineær signal-til-konsentrasjonsavhengighet over hele konsentrasjonsområdet; Dermed er lineær spektral unmixing effektiv for å fjerne potensielle krysssamtaler mellom kanaler. For N-kanal epr-SRS-måling med N MARS-sonder kan målte signaler (S) uttrykkes som S = MC, der C er MARS-sondekonsentrasjonene, og M er en N x N-matrise bestemt av Raman-tverrsnitt av MARS-sonder.- Mål matrise M på immuno-eprSRS-prøver med én farge merket med forskjellige MARS-sonder.
- Bruk ligning C = M−1· S for å bestemme konsentrasjonsmatrisen til MARS-sonden med multiplex prøvesignalmåling S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser eksempelbilder av epr-SRS i forskjellige prøver, inkludert faste celler (figur 3A), paraformaldehyd (PFA)-fast musevev (figur 3B) og formalinfaste parafinin innebygde (FFPE) menneskelige prøver (figur 3C). Den romlige oppløsningen til SRS-mikroskopi er diffraksjonsbegrenset, den typiske laterale oppløsningen er ~ 300 nm, og den aksiale oppløsningen er 1-2 μm ved hjelp av nær-infrarødt lys for eksitasjon. Som et resultat ble fine subcellulære strukturer som mikrotubuler i HeLa-celler trofast avslørt med immuno-eprSRS-avbildning av α-tubulin (figur 3A). Videre er epr-SRS generelt kompatibel med FFPE vev (figur 3C), som er en vanlig form for biopsiprøver for klinisk diagnose og patologiforskning. I likhet med to-foton fluorescensmikroskopi, som en ikke-lineær prosess, har epr-SRS optisk seksjoneringsevne for visualisering av tredimensjonale mønstre med subcellulær oppløsning (figur 3D-E).
Vi viste først multiplex protein avbildning nytte av epr-SRS på faste frosne vev prøver av mus holmer av Langerhans i bukspyttkjertelen. Flere interesserte mål er valgt, inkludert hormonuttrykk (f.eks. insulin, glukoseagonist (glukagon), bukspyttkjertelpolypeptid (PP) og somatostatin) for klassifisering av celletype (β celler og ikke-β celler (α-, δ-celler)) og transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være relatert til β-celle heterogenitet23. Vær oppmerksom på at siden fluorescensdeteksjon er ortogonal til SRS-deteksjon, er epr-SRS fullt kompatibel med konfokal fluorescens og to-foton fluorescens. Som et konseptbevis ble 7-fargers SRS-fluorescens tandemavbildning på en enkelt holme lett oppnådd (figur 4) med god kontrast og riktige mønstre. Mål med lavt uttrykk, for eksempel transkripsjonsfaktoren Pdx1, ble avbildet med tilstrekkelig kontrast.
Vi demonstrerte også en åttefarget SRS-fluorescens tandemavbildning i PFA-fast mus cerebellum vev (figur 5). Gjennom etablerte biomarkører kan forskjellige celletyper, for eksempel cerebellar granulat nevroner (NeuN), Purkinje neuroner (Calbindin), astrocytter (GFAP), oligodendrocytter (MBP) og GABAergiske nevroner (GABA B2 reseptor) identifiseres.
Figur 1: Epr-SRS-mikroskopi for svært multiplekset proteinavbildning. (A) Energidiagram for spontan Raman, ikke-resonans SRS og elektronisk preresonans SRS (epr-SRS). Vibrasjonsovergangshastigheten til kromoforer vil bli forbedret i epr-SRS med opptil 1013 ganger. (B) Epitope-basert immuno-avbildning av α-tubulin ble demonstrert i COS-7 celler farget av ATTO740 med høy vibrasjonskontrast av epr-SRS. Epr-SRS-signalet forsvinner helt når pumpelaserbølgelengden er off-resonans med bare 2 nm (høyre). Skalastenger, 20 μm. (C) Epr-SRS spektra av NHS ester-konjugerte MARS-sonder som oppført i tilleggsmateriale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Utformingen av SRS-mikroskopoppsett. (A) Skjematisk diagram over SRS-oppsettet. EOM = elektrooptisk modulator, M = speil, L = linse, DBS = dikroisk strålesplitter, DM = dikroisk speil, OB = objektiv linse, CO = kondensator, F = filter, PD = fotodiode. (B) Dette panelet viser lasereksitasjonsdelen. Dobbeltfarget stråle fra laserutgang skilles først med hver stråle som samles og utvides og senere kombineres og rettes inn i mikroskopkroppen. (C) Dette panelet viser den overførte samlingen med en kondensator. (D) Dette panelet viser SRS-deteksjonsdelen. Fotodiode og filter er montert på skjermet boks med to BNC kvinnelige kontakter. Nedre BNC-kontakt er for reversspenning, og den høyere BNC-kontakten er for strømsignalutgang til innlåsingsforsterker avsluttet med 50 Ω. (E) Dette panelet viser hvordan Si-fotodioden er montert inne i skjermboksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Raman fargestoffavbildning av distinkte proteinmarkører via immunisolering. (A) Immuno-eprSRS avbildning av α-tubulin i HeLa-celler. (B) Immuno-eprSRS-avbildning av NeuN i PFA-fast mus hjernebark. (C) Immuno-eprSRS-avbildning av Vimentin i humant nyre FFPE-vev. (D) Volumgjengivelsesbilde avMARS2145 farget GFAP i 100-μm tykt musehjernevev. Trinnstørrelsen i z var 2 μm. (E) Volumgjengivelsesbilde avMARS2228 farget NeuN i 40-μm tykt musehjernevev. Trinnstørrelsen i z var 1 μm. Skalastenger, 20 μm i (A), 50 μm in (B-C), 30 μm in (D-E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av 7-fargers tandemavbildning av hormoner og transkripsjonsfaktorer på frossent museøyevev. Epr-SRS: Insulin (påvist av Cy5, β-cellemarkør, grønn), Pdx1 (oppdaget av MARS2228, transkripsjonsfaktor, rød), Glukagon (oppdaget av MARS2216, α-cellemarkør, gul), PP (oppdaget av MARS2147, PP-cellemarkør, blå). Fluorescens: Somatostatin (Alexa488, δ-cellemarkør, oransje), Nkx2.2 (Cy3, transkripsjonsfaktor, magenta), DAPI (kjerne, mørk blå). Skalalinje, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av 8-fargers tandemavbildning av celletypemarkører på PFA-fast musehjernedel. Fluorescens: DNA (DAPI), GABA (γ-aminosmørsyre) B-reseptor 2 (GABAergic neuroner, Alexa Fluor 488), nevronale kjerner (NeuN; nevroner, Alexa Fluor 568) og Calbindin (Purkinje nevroner, Alexa Fluor 647); epr-SRS: hvetekim agglutinin (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), myelin grunnleggende protein (MBP; oligodendrocytter, MARS2176) og GFAP (astrocytter og nevrale stamceller, MARS2145). Skalastang, 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Validerte antistoffer mot immuno-eprSRS. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsmateriale: Egenskaper til 8 brukte NHS-ester-funksjonaliserte MARS-sonder. λabs og eksitasjonskoeffisienter av MARS-fargestoffer ble målt i DMSO-oppløsning på UV-Vis spektrometer ved hjelp av 1 cm glasscuvette som beholder. De absolutte Raman-tverrsnittene av MARS-fargestoffer ble bestemt i DMSO ved å sammenligne epr-SRS-signalet til MARS-fargestoffer med standard C-O stretchmodus (1030 cm-1) metanol. Det absolutte Raman-tverrsnittet for standard C−O stretchmodus (1030 cm-1) metanol ble rapportert som 2,1 x 10-30 cm2 ved 785 nm. Et tverrsnitt på 0,9 x 10-30 cm2 ble estimert til under 860 nm pumpebølgelengde ved ekstrapolering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi immuno-eprSRS-protokollen som i stor grad gjelder for vanlige vevstyper, inkludert ferskt bevart musevev, FFPE-humant vev og frossent musevev. Immuno-eprSRS er validert for et panel av epitoper i celler og vev, som oppført i tabell 1. Denne one-shot plattformen er spesielt egnet for applikasjoner der sykliske strategier ikke fungerer bra. For eksempel er syklisk fluorescens krevende for tykt vev, da flere runder med 3D-immunisolering er upraktisk lang17. Det er også svært sannsynlig å innføre registreringsfeil på grunn av ikke-lineære 3D-histologiske endringer11,17. Immuno-eprSRS overvinner praktiske barrierer for syklisk fluorescens i et slikt scenario og gir muligheter til å avsløre proteininteraksjonsnettverk over et stort volum17.
Nåværende multipleksitet er hovedsakelig begrenset av tilgjengeligheten av sekundære antistoffer. Mens vi var i denne protokollen fokuserte vi på indirekte immunisolering, der MARS-sonder blir konjugert til sekundære antistoffer, direkte immunisolering og lectinfarging er mulig17. Etter mer primær antistoffvalidering med Raman fargestoffer, forventes 20 kanaler med for tiden utviklede Raman fargestoffer 13,18,24. Videre kan det være utfordrende for epr-SRS å se for svært lave mål på grunn av den litt kompromitterte følsomheten sammenlignet med det konfiskere fluorescenssystemet. I denne forbindelse anbefaler vi å tildele relativt lave mål til lysere MARS-fargestoffer og lavuttrykksmål til fluorescenskanaler.
Et kritisk aspekt ved protokollen er tilgjengeligheten av instrumenter og sonder. Instrumenteringsmessig består et SRS-mikroskop vanligvis av en tofarget laserkilde med en optisk modulator, et mikroskop, en fotodiodedetektor og en innlåsingsforsterker for demodulering25. Hver komponent er kommersielt tilgjengelig med en litt høyere totalkostnad enn et to-foton laserskanningsmikroskop. Et fullt integrert multimodalt SRS/fluorescensforskningsmikroskop har blitt kommersialisert26 ved hjelp av en lignende picosecond laser som her for SRS eksitasjon og kontinuerlig bølge (CW) lasersett for fluorescens. Dette systemet er lett anvendelig for multiplex vibrasjonsavbildning i daglig biologisk forskning. Sondemessig har ikke MARS-sonder blitt kommersialisert ennå og krever noen syntesefunksjoner. Alternativt kan mange kommersielle fjernrøde fluoroforer (se Utvidet datatabell 1 i L. Wei et al. Nature 201713) brukes til epr-SRS. Likevel kan multipleksiteten bli kompromittert. Videre, siden MARS-sonder av natur er små organiske molekyler, ligner immuno-eprSRS immunfluorescens når det gjelder vevsfarging. Derfor kan arkivet med validerte affinitetsreagenser som antistoffer i immunfluorescens lett overføres til immuno-eprSRS-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ruth A. Singer og Richard K.P. Benninger for å ha gitt mus bukspyttkjertelvev. W.M. anerkjenner støtte fra NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) og US Army (W911NF-19-1-0214).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al.
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).
