Summary
Elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridning (epr-SRS) avbildning av regnbågsliknande Raman-färgämnen är en ny plattform för mycket multiplexerad epitopbaserad proteinavbildning. Här presenterar vi en praktisk guide inklusive antikroppsberedning, vävnadsprovfärgning, SRS-mikroskopmontering och epr-SRS-vävnadsavbildning.
Abstract
Att visualisera ett stort antal specifika biomarkörer i vävnader spelar en viktig roll för att utforska de invecklade organisationerna i komplexa biologiska system. Därför har mycket multiplexerad bildteknik uppskattats alltmer. Här beskriver vi en framväxande plattform för högmultimulerad vibrationsavbildning av specifika proteiner med jämförbar känslighet för standardimmunfluorescens via elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridning (epr-SRS) avbildning av regnbågsliknande Raman-färgämnen. Denna metod kringgår gränsen för spektralt upplösbara kanaler i konventionell immunofluorescens och ger en optisk metod med ett skott för att förhöra flera markörer i vävnader med subcellulär upplösning. Det är i allmänhet kompatibelt med standardvävnadspreparat, inklusive paraformaldehyd-fasta vävnader, frysta vävnader och formalin-fixerade paraffininbäddade (FFPE) mänskliga vävnader. Vi ser framför oss att denna plattform kommer att ge en mer omfattande bild av proteininteraktioner mellan biologiska prover, särskilt för tjocka intakta vävnader. Detta protokoll ger arbetsflödet från antikroppsberedning till vävnadsprovfärgning, till SRS-mikroskopmontering, till epr-SRS-vävnadsavbildning.
Introduction
Komplexa vävnadssystem består av distinkta cellulära delpopulationer vars rumsliga platser och interaktionsnätverk är djupt sammanflätade med deras funktioner och dysfunktioner 1,2. För att avslöja vävnadsarkitekturen och förhöra dess komplexitet är kunskap om proteinernas rumsliga placering vid encellsupplösning avgörande. Därför har mycket multiplexerad proteinavbildningsteknik uppskattats alltmer och kan bli en hörnsten för att studera vävnadsbiologi 3,4,5. Nuvarande vanliga multiplexerade proteinavbildningsmetoder kan klassificeras i två huvudkategorier. Den ena är seriell immunofluorescensavbildning som förlitar sig på flera omgångar av vävnadsfärgning och avbildning, och den andra är avbildning av masscytometri i kombination med tungmetallmärkta antikroppar 6,7,8,9,10,11,12.
Här introduceras en alternativ strategi för multiplexerad antikroppsbaserad proteinavbildning. Till skillnad från den rådande fluorescensavbildningsmodaliteten, som bara kan visualisera 4-5 kanaler samtidigt på grund av de breda excitations- och emissionsspektra (full bredd vid halv maximal (FWHM) ~ 500 cm-1), uppvisar Raman-mikroskopi mycket smalare spektral linjebredd (FWHM ~ 10 cm-1) och ger därmed skalbar multiplexitet. Nyligen, genom att utnyttja det smala spektrumet, har ett nytt schema för Raman-mikroskopi med namnet elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridningsmikroskopi (epr-SRS) utvecklats, vilket ger en kraftfull strategi för multiplexerad avbildning13. Genom att undersöka de elektroniskt kopplade vibrationslägena för Raman-färgämnen uppnår epr-SRS en drastisk förbättringseffekt på 1013-faldigt på Raman-tvärsnitt och övervinner känslighetsflaskhalsen för konventionell Raman-mikroskopi (figur 1A) 13,14,15. Som ett resultat har detektionsgränsen för epr-SRS pressats till sub-μM, vilket möjliggör Raman-detektion av intressanta molekylära markörer såsom specifika proteiner och organeller inuti celler13,16. I synnerhet med användning av Raman-färgkonjugerade antikroppar visades epr-SRS-avbildning av specifika proteiner i celler och vävnader (kallad immuno-eprSRS) med jämförbar känslighet för standardimmunfluorescens (figur 1B)13,17. Genom att ställa in pumpens våglängd med endast 2 nm kommer epr-SRS-signalen att vara helt avstängd (figur 1B), vilket visar hög vibrationskontrast.
På sondsidan har en uppsättning regnbågsliknande Raman-sonder som kallas Manhattan Raman scattering (MARS) färgämnen utvecklats för antikroppskonjugering 13,18,19,20. Denna unika Raman-palett består av nya färgämnen som bär π-konjugerade trippelbindningar (supplementärt material), var och en visar en enda och smal epr-SRS-topp i det bioortogonala Raman-spektralområdet (figur 1C). Genom att modifiera strukturen hos kärnkromoforen och isotopiskt redigera båda atomerna i trippelbindningen (supplementärt material) har spektralt separerade Raman-sonder utvecklats. Genom att utnyttja den skalbara multiplexiteten erbjuder epr-SRS-mikroskopi i kombination med MARS-färgpaletten en optisk strategi för multiplexproteinavbildning med ett skott i celler och vävnader.
Immuno-eprSRS ger en alternativ strategi till nuvarande multiplexproteinavbildningsmetoder med unika styrkor. Jämfört med fluorescensmetoder med cyklisk färgning, avbildning och signalborttagning säkerställer denna Raman-baserade plattform enkelrund färgning och avbildning. Därför kringgår den praktisk komplexitet i cykliska förfaranden och förenklar till stor del protokollet, vilket öppnar nya territorier för multiplexerad proteinavbildning. Till exempel, genom att utnyttja ett Raman-färgämnesskräddarsyrt vävnadsrensningsprotokoll, har immuno-eprSRS utökats till tre dimensioner för mycket multiplexerad proteinkartläggning i tjocka intakta vävnader17. Över 10 proteinmål visualiserades längs millimetertjocka mushjärnvävnader17. På senare tid har koppling av immuno-eprSRS med ett optimerat biomolekylretentionsexpansionsmikroskopiprotokoll (ExM)21, en-skotts nanoskala avbildning av flera mål också visats22. Jämfört med avbildning av masspektroskopi 4,9 är epr-SRS icke-destruktiv och har inneboende optisk sektioneringsförmåga. Dessutom är epr-SRS mer tidseffektivt vid vävnadsskanning. Vanligtvis tar en vävnadsregion på 0,25 mm2 med en pixelstorlek på 0,5 μm bara några minuter att avbilda för en enda epr-SRS-kanal. Till exempel är den totala avbildningstiden för fyra SRS-kanaler plus fyra fluorescenskanaler i figur 4 cirka 10 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet genomfördes i enlighet med djurförsöksprotokollet (AC-AABD1552) som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Columbia University.
1. Framställning av Raman-färgämne-konjugerade antikroppar
- Förbered konjugeringsbufferten som ~ 0,1 MNaHCO3 i PBS-buffert, pH = 8,3, förvara vid 4 ° C.
- Förbered N-hydroxisuccinimidi (NHS) esterfunktionerad MARS-sond (kompletterande material) lösning som 3 mM i vattenfri DMSO. Syntes av MARS-sonder kan hänvisas till tidigare rapporter 13,17,18.
OBS: För lagringsändamål måste färgämnet NHS-esterlösning skyddas mot ljus och hållas vid -20 ° C. - Lös upp antikroppsfasta ämnen i konjugeringsbufferten till en koncentration av 2 mg/ml. För antikroppar som är upplösta i andra buffertar, byt ut dem i konjugeringsbufferten till en koncentration av 1-2 mg / ml med centrifugalfilter.
OBS: Mycket korsadsorberade sekundära antikroppar föredras för multiplexfärgning för att minimera reaktivitet mellan arter. De sekundära antikroppar som används listas i tabell 1 och materialtabell. - Utför konjugeringsreaktionen.
- För sekundära antikroppar, tillsätt 15-faldigt molärt överskott av färgämneslösning till antikroppslösningen i en glasflaska långsamt under omrörning. Till exempel, i 0,5 ml 2 mg / ml antikroppslösning, tillsätt 35 μL 3 mM färglösning.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur (RT) under omrörning i 1 timme. Skydda reaktionen från ljus.
- Rening.
- Förbered uppslamningen av gelfiltreringsharts (materialtabell) i PBS-bufferten enligt steg 1.5.2-1.5.4.
- Tillsätt 10 ml gelfiltreringshartspulver i 40 ml PBS-buffert inuti ett 50 ml rör.
- Förvara lösningen i ett 90 °C vattenbad i 1 timme.
- Dekantera supernatanten och tillsätt PBS till 40 ml. Förvara uppslamningen vid 4 °C.
- Packa storleksuteslutningskolonnen (1 cm diameter, gravitationsflödeskolonner) med uppslamningslösningen till en höjd av 10-15 cm.
- Skölj och tvätta kolonnen med ~ 10 ml PBS-buffert för att ytterligare packa hartset.
- Pipettera konjugationsreaktionsblandningen (~ 0,5 ml) till kolonnen. Tillsätt omedelbart 1 ml PBS-buffert som elueringsbuffert när all reaktionsblandning är laddad. Fyll ständigt på elueringsbufferten (PBS) till kolonnen.
- Samla in eluatet av konjugatlösningen genom att titta på färgen på kolonnen (MARS-färgämnen har ljusgröna till blå färger) eller mäta absorbansen vid 280 nm (A280).
- Koncentrera den uppsamlade lösningen till 1-2 mg/ml med ett centrifugalfilter.
- Bestäm koncentrationen och den genomsnittliga graden av märkning (DOL, färgämne-till-protein-förhållande) genom att mäta det ultravioletta synliga (UV-Vis) spektrumet för konjugatlösningen med en Nano-plattläsare.
OBS: Kompletterande material ger egenskaper hos MARS-färgämne NHS-estrar för beräkning. Den normala DOL för den sekundära antikroppen är cirka 3.
2. Beredning av vävnadsprov
- Paraformaldehyd fasta mushjärnvävnader.
- Bedöva mössen (C57BL/6J, Hona, 25 d postnatal) med isofluran. Bedöm rätt anestesi med ett tåklämprov.
- Döda mössen genom livmoderhalsförskjutning. Perfusera mössen omedelbart med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS transkardiellt.
- Samla mushjärnan genom att följa steg 2.1.4-2.1.5
- Skär uppåt från hjärnstammen längs sagittalsuturen. Skala bort de två halvorna av skallen åt sidan och skopa ut hjärnan med en pincett.
- Fixera den uppsamlade hjärnan i 4% PFA i PBS vid 4 ° C i 24 timmar. Tvätta sedan hjärnan i PBS-buffert vid 4 ° C i 24 timmar för att avlägsna överskott av PFA.
- Placera fast agaros i vatten till en slutlig koncentration på 7% (w / v) i en bägare, med ett löst lock. Rör om lösningen med en glasrörningsstång. Värm uppslamningen i mikrovågsugn tills lösningen är klar.
- Låt agarosen svalna till 45-55 °C.
- Häll vätskan agaros i en liten kammare, överför sedan hjärnan från PBS till flytande agaros och orientera den med en spatel för att bädda in hjärnan. Vänta tills vävnadsagarosblocket härdar.
- Dela vävnads-agrosen i 40-μm-tjocka koronala skivor med hjälp av en vibratom.
- Överför vävnaden till en 4-brunnsplatta för följande färgning. Ta bort agarosen med en pincett. Tvätta vävnaden med 1 ml PBS, tre gånger.
- Fasta frysta mus bukspottkörtelvävnader.
- Fixera muspankreaten i 4% PFA i PBS vid 4 ° C med gungning i 16-20 timmar.
- Tvätta provet i 1 ml PBS (4 °C) tre gånger för att avlägsna PFA.
- Bädda in provet (~ 0,3-0,5 cm i storlek) i optimala skärtemperaturblock (OCT). Lägg 2 droppar OCT i en kryomal av plast. Placera vävnaden i rätt riktning och häll OCT ovanpå vävnaderna tills ingen av vävnaderna förblir exponerad.
- Dela bukspottkörteln till 8 μm tjocka skivor och immobilisera dem på en vävnadsbindande glasskiva, förvara dem i -80 °C.
- Innan färgning, balansera provet till RT. Tvätta vävnaden med PBS för att ta bort OCT-block.
- FFPE-prover.
- Grädda FFPE-vävnadsrutschkanan vid 60 °C i 10 min.
- Deparaffinisering och rehydrering: Placera prover sekventiellt i följande lösningar i ett 50 ml rör vid RT i 3 minuter varje gång med mild skakning:
xylen två gånger,
etanol två gånger,
95% (vol/vol) etanol i avjoniserat vatten två gånger,
70% (vol/vol) etanol i avjoniserat vatten två gånger,
50% (vol/vol) etanol i avjoniserat vatten en gång,
avjoniserat vatten en gång. - Överför provet till 20 mM natriumcitrat (pH 8,0) vid 100 °C i en glasburk. Se till att vävnaderna är nedsänkta i lösningen.
- Lägg burken i ett 60 ° C vattenbad i 45 min.
- Tvätta provet med avjoniserat vatten vid RT i 5 min.
3. Vävnadsimmun-eprSRS-färgning
- Använd en hydrofob penna för att rita en gräns runt vävnadssektionerna på bilden.
OBS: En glidfärgningsburk används för att följa inkubationssteg av vävnad på bilden. Flytande vävnader (40 μm tjocka mushjärnsektioner) färgas i brunnsplattor. - Inkubera vävnaderna med 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 i PBS) i 10 min.
- Inkubera vävnaderna med blockerande buffert (5% åsneserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) i 30 min.
- Förbered den primära färgningslösningen: tillsätt alla primära antikroppar till 200-500 μL färgningsbuffert (2% åsneserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) vid önskade koncentrationer. Centrifugera den primära färgningslösningen vid 13 000 x g i 5 min. Använd endast supernatanten om utfällningar bildas.
- Inkubera vävnaden i den primära antikroppslösningen vid 4 °C i 1-2 dagar.
OBS: För färgning av vävnadssektioner på bilden, lägg provet i en färgningslåda med en våtservett för att bibehålla fuktigheten. - Tvätta rutschkanorna tre gånger med 0,3-0,5% PBST vid RT i 5 min vardera. Använd 1 ml PBST för flytande vävnader. För vävnader på bilden, tvätta bilderna i en glidfärgningsburk och se till att vävnaderna är nedsänkta i lösningen.
- Inkubera vävnaden i 200-500 μL blockerande buffert i 30 min.
- Förbered den sekundära färgningslösningen: tillsätt alla sekundära antikroppar (och lektiner vid behov) till 200-500 μL färgningsbuffert med önskade koncentrationer (normalt 10 μg / ml). Centrifugera den sekundära färgningslösningen vid 13 000 x g i 5 min. Använd endast supernatanten om utfällningar bildas.
- Inkubera vävnaderna i 200-500 μL sekundär antikroppslösning vid 4 °C i 1-2 dagar.
- Tvätta rutschkanorna två gånger med 0,3-0,5% PBST vid RT i 5 min vardera.
- Inkubera med 200-500 μL DAPI-lösning i 30 min.
- Tvätta rutschkanorna tre gånger med PBS vid RT i 5 minuter vardera.
- För flytande vävnadssektioner, överför dem till glasrutschbanor med en glasdroppande pipett. Sprid vävnaden med en vävnadsborste och rengör omgivningen med våtservetter om det behövs.
- Montera vävnaden i en droppe antifade reagens med en glasöverdrag och säkra den med nagellack.
4. SRS-mikroskopmontering
OBS: Ett kommersiellt konfokalt fluorescenssystem används vid tandem SRS-fluorescensavbildning. Fler beskrivningar finns i en tidigare rapport17. Detta protokoll kommer att fokusera på SRS-bildsidan med hjälp av smalbands excitation.
- Förbered ett vibrationsisolat optiskt bord i ett rum med temperaturkontroll.
- Placera ett synkroniserat dubbellasersystem (pump och Stokes) på det optiska bordet (figur 2A) med en kylaggregat ansluten.
OBS: Den grundläggande lasern i dubbellasersystemet ger ett utgångspulståg vid 1064 nm med 6 ps pulsbredd och 80 MHz repetitionshastighet. Stokes-strålen är från den grundläggande lasern. Stokes-strålens intensitet modulerades sinusformellt av en inbyggd elektrooptisk amplitudmodulator (EOM) vid 8 MHz med ett moduleringsdjup på mer än 90%. Den andra delen av den grundläggande lasern är frekvensfördubblad till 532 nm, som vidare används för att synkront fröa en pikosekund optisk parametrisk oscillator (OPO) för att producera ett lägeslåst pulståg med 5-6 ps pulsbredd (OPO: s tomgångsstråle blockeras med ett interferometriskt filter). Utgångsvåglängden för OPO kan inte avstämas från 720-950 nm, som fungerar som pumpstrålen. - Montera speglarna (våglängdsområde: 750-1100 nm), dikroiska stråldelare (DBS, 980 nm långpassfilter, rektangulärt) och lins (akromatisk, AR-beläggning för 650-1050 nm) på sina respektive fästen. Använd mycket stabilakinematiska spegelfästen för speglarna och dikroiska stråldelare.
- Mät höjden på laserutgången och strålstorlekarna på pumpen och Stokes-strålarna. Justera höjden på speglar och linser för att säkerställa att ljuset kommer att träffa mitten av alla optiska element.
- Placera spegel M1 på det optiska bordet och gör den ~ 45 ° till laserutgången (figur 2B). Använd rattarna på det kinematiska fästet för att göra spets- och lutningsjusteringar. Se till att ljuset färdas i samma höjd längs bordets längd och en rak linje i förhållande till bordet.
- Placera och rikta in dikroiska stråldelare (980 nm långpassfilter) och speglar för att dela pumpen och Stokes-strålarna (figur 2A-B).
- Placera och justera linspar (L1, L2 och L3, L4) på var och en av strålbanorna för att kollidera balkarna och expandera stråldiametrarna så att de matchar målets bakre pupill (figur 2A-B).
- Använd M7- och M8-speglar för att rikta in kombinerade laserstrålar i mikroskopet (figur 2C). Rikta in en stråle i mikroskopet först och använd spegelparen på den andra strålen för att säkerställa den rumsliga överlappningen av de två strålarna.
- Konfigurera identifieringsdelen.
- Sätt på en infrarödbelagd oljekondensor (1,4-NA) för att samla upp den framåtgående pumpen och Stokes-strålarna efter att ha passerat genom proverna (Figur 2C).
- Montera en Si-fotodiod med stor yta på en skärmad låda med BNC-kontakter (Figur 2E). Lägg till en 64-V likströmsförsörjning till den monterade fotodioden för att öka mättnadströskeln och svarsbandbredden.
- Reflektera det framåtgående ljuset med en 2-tums spegel. Fokusera om ljuset på fotodioden efter ett optiskt filter för att blockera den modulerande Stokes-strålen (Figur 2D).
- Skicka fotodiodens utgångsström till en snabb inlåsningsförstärkare avslutad med 50 för signaldemodulering. Skicka en 8 MHz-utlösare till inlåsningsförstärkaren som referenssignal.
- Skicka infas X-komponenten i inlåsningsförstärkaren till mikroskopets analoga gränssnittsbox.
- Optimera den tidsmässiga överlappningen med det inbyggda motoriserade fördröjningssteget genom att mäta SRS-signalen för renD2O-vätska vid mikroskopet.
5. Bildförvärv och analys
- Utför flerkanalig epr-SRS-avbildning med sekventiell pumpvåglängdsinställning.
- Ställ in lasereffekten på P-pumpen = 10-40 mW och P Stokes = 40-80 mW på laserkontrollpanelen.
- Ställ in pixeluppehållstiden till 2-4 μs och använd flera ramar i genomsnitt 10-20 bilder på mikroskopiprogramvaran.
OBS: Undvik en kombinatorisk användning av hög lasereffekt (P-pump> 40 mW, PStokes> 80 mW) och liten pixelstorlek (<0,2 μm), vilket sannolikt orsakar "blekningseffekt" av Raman-färgämnen på grund av multifoton excitation. - Ställ in tidskonstanterna för inlåsningsförstärkaren på hälften av pixelns uppehållstid.
- Linjär spektral blandning.
OBS: epr-SRS följer ett strikt linjärt signal-till-koncentrationsberoende över hela koncentrationsområdet. således är linjär spektral unmixing effektiv för att avlägsna eventuella korssamtal mellan kanaler. För N-kanals epr-SRS-mätning med N MARS-sonder kan uppmätta signaler (S) uttryckas som S = MC, där C är MARS-sondkoncentrationerna och M är en N x N-matris bestämd av Raman-tvärsnitt av MARS-sonder.- Mät matris M på enfärgade immuno-eprSRS-prover märkta med olika MARS-sonder.
- Använd ekvation C = M−1· S för att bestämma koncentrationsmatrisen för MARS-sonden med multiplex provsignalmätning S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar exempelbilder av epr-SRS i olika prover, inklusive fasta celler (figur 3A), paraformaldehyd (PFA)-fasta musvävnader (figur 3B) och formalin-fixerade paraffininbäddade (FFPE) humana prover (figur 3C). Den rumsliga upplösningen av SRS-mikroskopi är diffraktionsbegränsad, den typiska laterala upplösningen är ~ 300 nm och den axiella upplösningen är 1-2 μm med hjälp av nära infrarött ljus för excitation. Som ett resultat avslöjades fina subcellulära strukturer såsom mikrotubuli i HeLa-celler troget med immuno-eprSRS-avbildning av α-tubulin (figur 3A). Dessutom är epr-SRS i allmänhet kompatibel med FFPE-vävnader (figur 3C), vilket är en vanlig form av biopsiprover för klinisk diagnos och patologisk forskning. I likhet med tvåfotonfluorescensmikroskopi, som en olinjär process, har epr-SRS optisk sektionsförmåga för att visualisera tredimensionella mönster med subcellulär upplösning (Figur 3D-E).
Vi visade först upp epr-SRS multiplexproteinavbildningsverktyg på fasta frysta vävnadsprover av musöar av Langerhans i bukspottkörteln. Flera intresserade mål väljs ut, inklusive hormonuttryck (t.ex. insulin, glukosagonist (glukagon), bukspottkörtelpolypeptid (PP) och somatostatin) för celltypsklassificering (β-celler och icke-β-celler (α-, δ-celler)) och transkriptionsfaktorer som är kända för att vara relaterade till β-cellheterogenitet23. Observera att eftersom fluorescensdetektering är ortogonal till SRS-detektion, är epr-SRS helt kompatibel med konfokal fluorescens och tvåfotonfluorescens. Som ett bevis på konceptet uppnåddes 7-färgs SRS-fluorescens tandemavbildning på en enda ö lätt (figur 4) med god kontrast och korrekta mönster. Mål med lågt uttryck, såsom transkriptionsfaktorn Pdx1, avbildades med tillräcklig kontrast.
Vi demonstrerade också en åttafärgad SRS-fluorescens tandemavbildning i PFA-fasta mus cerebellumvävnader (Figur 5). Genom etablerade biomarkörer kan olika celltyper, såsom cerebellära granulatneuroner (NeuN), Purkinje-neuroner (Calbindin), astrocyter (GFAP), oligodendrocyter (MBP) och GABAerga neuroner (GABAB2-receptor ) identifieras.
Figur 1: Epr-SRS-mikroskopi för mycket multiplexerad proteinavbildning. (A) Energidiagram för spontan Raman, icke-resonant SRS och elektronisk pre-resonant SRS (epr-SRS). Vibrationsövergångshastigheten för kromoforer kommer att förbättras i epr-SRS med upp till 1013-faldigt. (B) Epitopbaserad immunavbildning av α-tubulin visades i COS-7-celler färgade av ATTO740 med hög vibrationskontrast av epr-SRS. Epr-SRS-signalen försvinner helt när pumpens laservåglängd är avresonans med endast 2 nm (höger). Skalstänger, 20 μm. (C) Epr-SRS-spektra av NHS-esterkonjugerade MARS-sonder enligt listan i Kompletterande material. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utformningen av SRS-mikroskopuppsättningen. (A) Schematiskt diagram över SRS-uppsättningen. EOM = elektrooptisk modulator, M = spegel, L = lins, DBS = dikroisk stråldelare, DM = dikroisk spegel, OB = objektivlins, CO = kondensor, F = filter, PD = fotodiod. (B) Denna panel visar laser excitationsdelen. Dubbelfärgad stråle från laserutgång separeras först med varje stråle som kollimeras och expanderas och senare kombineras och riktas in i mikroskopkroppen. (C) Denna panel visar den överförda samlingen med en kondensor. (D) Denna panel visar SRS-detekteringsdelen. Fotodiod och filter är monterade på skärmad låda med två BNC-honkontakter. Lägre BNC-kontakt är för omvänd förspänning, och den högre BNC-kontakten är för strömsignalutgång till inlåsningsförstärkare avslutad med 50 Ω. (E) Denna panel visar hur Si-fotodioden är monterad inuti den skärmade lådan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Raman-färgämnesavbildning av distinkta proteinmarkörer via immunmärkning. (A) Immuno-eprSRS-avbildning av α-tubulin i HeLa-celler. (B) Immuno-eprSRS-avbildning av NeuN i PFA-fixerad mus hjärnbark. (C) Immuno-eprSRS-avbildning av Vimentin i human njure FFPE-vävnad. (D) Volymåtergiven bild avMARS2145 färgad GFAP i 100 μm tjock mushjärnvävnad. Stegstorleken i z var 2 μm. (E) Volymrenderad bild avMARS2228 färgad NeuN i 40 μm tjock mushjärnvävnad. Stegstorleken i z var 1 μm. Skalstänger, 20 μm in (A), 50 μm in (B-C), 30 μm in (D-E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa resultat av 7-färgs tandemavbildning av hormoner och transkriptionsfaktorer på frusen musövävnad. Epr-SRS: Insulin (detekterat av Cy5, β-cellmarkör, grönt), Pdx1 (detekterat av MARS2228, transkriptionsfaktor, rött), Glukagon (detekterat av MARS2216, α-cellmarkör, gul), PP (detekterad av MARS2147, PP-cellmarkör, blå). Fluorescens: Somatostatin (Alexa488, δ cellmarkör, orange), Nkx2.2 (Cy3, transkriptionsfaktor, magenta), DAPI (kärna, mörkblå). Skala bar, 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa resultat av 8-färgs tandemavbildning av celltypsmarkörer på PFA-fixerad mushjärnsektion. Fluorescens: DNA (DAPI), GABA (γ-aminosmörsyra) B-receptor 2 (GABAerga neuroner, Alexa Fluor 488), neuronala kärnor (NeuN; neuroner, Alexa Fluor 568) och Calbindin (Purkinje neuroner, Alexa Fluor 647); epr-SRS: vetegroddar agglutinin (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), myelinbasiskt protein (MBP; oligodendrocyter, MARS2176) och GFAP (astrocyter och neurala stamceller, MARS2145). Skalstång, 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Validerade antikroppar för immuno-eprSRS. Se Materialförteckningen för mer information. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande material: Egenskaper hos 8 använda NHS-esterfunktionaliserade MARS-sonder. λabs och excitationskoefficienter för MARS-färgämnen mättes i DMSO-lösning på UV-Vis-spektrometer med 1 cm glaskyvett som behållare. De absoluta Raman-tvärsnitten av MARS-färgämnen bestämdes i DMSO genom att jämföra epr-SRS-signalen för MARS-färgämnen med standard C-O-sträckläget (1030 cm-1) för metanol. Det absoluta Raman-tvärsnittet för standard C-O-stretchläget (1030 cm-1) för metanol rapporterades som 2,1 x 10-30 cm2 vid 785 nm. Ett tvärsnitt på 0,9 x 10-30 cm2 uppskattades under 860 nm pumpvåglängd genom extrapolering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi immuno-eprSRS-protokollet som i stort sett är tillämpligt på vanliga vävnadstyper, inklusive nybevarade musvävnader, FFPE-mänskliga vävnader och frysta musvävnader. Immuno-eprSRS har validerats för en panel av epitoper i celler och vävnader, enligt tabell 1. Denna one-shot-plattform är särskilt lämplig för applikationer där cykliska strategier inte fungerar bra. Till exempel är cyklisk fluorescens krävande för tjocka vävnader eftersom flera omgångar av 3D-immunmärkning är opraktiska långa17. Det är också mycket troligt att införa registreringsfel på grund av icke-linjära 3D-histologiska förändringar11,17. Immuno-eprSRS övervinner praktiska hinder för cyklisk fluorescens i ett sådant scenario och ger möjligheter att avslöja proteininteraktionsnätverk över en stor volym17.
Nuvarande multiplexitet begränsas huvudsakligen av tillgången på sekundära antikroppar. Medan vi i detta protokoll fokuserade på indirekt immunmärkning, där MARS-sonder konjugeras till sekundära antikroppar, är direkt immunmärkning och lektinfärgning möjlig17. Efter mer primär antikroppsvalidering med Raman-färgämnen förväntas 20 kanaler med för närvarande utvecklade Raman-färgämnen 13,18,24. Dessutom kan avbildning av mycket låga rikliga mål vara utmanande för epr-SRS på grund av dess något komprometterade känslighet jämfört med konfokalfluorescenssystemet. I detta avseende rekommenderar vi att man tilldelar relativt låga rikliga mål till ljusare MARS-färgämnen och låguttrycksmål till fluorescenskanaler.
En kritisk aspekt av protokollet är tillgängligheten av instrument och sonder. Instrumenteringsmässigt består ett SRS-mikroskop i allmänhet av en dubbelfärgad laserkälla med en optisk modulator, ett mikroskop, en fotodioddetektor och en inlåsningsförstärkare för demodulering25. Varje komponent är kommersiellt tillgänglig med en något högre totalkostnad än ett tvåfotonlaserskanningsfluorescensmikroskop. Ett helt integrerat multimodalt SRS/fluorescensforskningsmikroskop har kommersialiserats26 med en liknande pikosekundlaser som här för SRS-excitation och CW-lasersatser (kontinuerlig våg) för fluorescens. Detta system är lätt att tillämpa för multiplex vibrationsavbildning i vardaglig biologisk forskning. Sondmässigt har MARS-sonder inte kommersialiserats ännu och kräver vissa syntesfunktioner. Alternativt kan många kommersiella långröda fluoroforer (se Extended Data Table 1 i L. Wei et al. Nature 201713) användas för epr-SRS. Ändå kan multiplexiteten äventyras. Dessutom, eftersom MARS-sonder av naturen är små organiska molekyler, liknar immuno-eprSRS immunofluorescens när det gäller vävnadsfärgning. Därför kan arkivet med validerade affinitetsreagenser såsom antikroppar vid immunofluorescens lätt överföras till immuno-eprSRS-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ruth A. Singer och Richard K.P. Benninger för att de tillhandahåller vävnader i bukspottkörteln i musen. W.M. erkänner stöd från NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) och US Army (W911NF-19-1-0214).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al.
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).
