Summary
Elektronisk præresonansstimuleret Raman scattering (epr-SRS) billeddannelse af regnbuelignende Raman farvestoffer er en ny platform for stærkt multiplexeret epitopbaseret proteinbilleddannelse. Her præsenterer vi en praktisk vejledning, herunder antistofforberedelse, vævsprøvefarvning, SRS-mikroskopsamling og epr-SRS-vævsbilleddannelse.
Abstract
Visualisering af et stort omfang af specifikke biomarkører i væv spiller en afgørende rolle i udforskningen af de indviklede organisationer af komplekse biologiske systemer. Derfor er stærkt multiplexede billeddannelsesteknologier i stigende grad blevet værdsat. Her beskriver vi en ny platform for stærkt multiplexeret vibrationsbilleddannelse af specifikke proteiner med sammenlignelig følsomhed over for standard immunofluorescens via elektronisk præresonansstimuleret Raman scattering (epr-SRS) billeddannelse af regnbuelignende Raman farvestoffer. Denne metode omgår grænsen for spektraltopløselige kanaler i konventionel immunfluorescens og giver en one-shot optisk tilgang til at forhøre flere markører i væv med subcellulær opløsning. Det er generelt kompatibelt med standardvævspræparater, herunder paraformaldehyd-fast væv, frosne væv og formalin-fast paraffinindlejret (FFPE) humant væv. Vi forestiller os, at denne platform vil give et mere omfattende billede af proteininteraktioner mellem biologiske prøver, især for tykt intakt væv. Denne protokol giver arbejdsgangen fra antistofforberedelse til vævsprøvefarvning, til SRS-mikroskopsamling til epr-SRS-vævsbilleddannelse.
Introduction
Komplekse vævssystemer består af forskellige cellulære subpopulationer, hvis rumlige placeringer og interaktionsnetværk er dybt sammenflettet med deres funktioner og dysfunktioner 1,2. For at afsløre vævsarkitekturen og forhøre dens kompleksitet er viden om de rumlige placeringer af proteiner ved enkeltcelleopløsning afgørende. Derfor er stærkt multiplexerede proteinbilleddannelsesteknologier i stigende grad blevet værdsat og kan blive en hjørnesten for at studere vævsbiologi 3,4,5. Nuværende almindelige multiplexerede proteinbilleddannelsesmetoder kan klassificeres i to hovedkategorier. Den ene er seriel immunofluorescensbilleddannelse, der er afhængig af flere runder vævsfarvning og billeddannelse, og den anden er billeddannelse af massecytometri kombineret med tungmetalmærkede antistoffer 6,7,8,9,10,11,12.
Her introduceres en alternativ strategi for multiplexeret antistofbaseret proteinbilleddannelse. I modsætning til den fremherskende fluorescensbilleddannelsesmodalitet, som kun kan visualisere 4-5 kanaler samtidigt på grund af de brede excitations- og emissionsspektre (fuld bredde ved halv maksimum (FWHM) ~ 500 cm-1), udviser Raman-mikroskopi meget smallere spektral linjebredde (FWHM ~ 10 cm-1) og giver dermed skalerbar multiplexitet. For nylig, ved at udnytte det smalle spektrum, er der udviklet en ny ordning med Raman-mikroskopi ved navn elektronisk præresonansstimuleret Raman-spredning (epr-SRS) mikroskopi, hvilket giver en stærk strategi for multiplexeret billeddannelse13. Ved at undersøge de elektronisk koblede vibrationstilstande for Raman-farvestoffer opnår epr-SRS en drastisk forbedringseffekt på 1013 gange på Raman-tværsnit og overvinder følsomhedsflaskehalsen i konventionel Raman-mikroskopi (figur 1A) 13,14,15. Som følge heraf er detektionsgrænsen for epr-SRS blevet skubbet til sub-μM, hvilket muliggør Raman-detektion af interessante molekylære markører såsom specifikke proteiner og organeller inde i celler13,16. Ved anvendelse af Raman-farvestofkonjugerede antistoffer blev epr-SRS-billeddannelse af specifikke proteiner i celler og væv (kaldet immuno-eprSRS) især demonstreret med sammenlignelig følsomhed over for standard immunofluorescens (figur 1B) 13,17. Ved at indstille pumpens bølgelængde med kun 2 nm vil epr-SRS-signalet være helt slukket (figur 1B), som viser høj vibrationskontrast.
På sondesiden er der udviklet et sæt regnbuelignende Raman-sonder kaldet Manhattan Raman scattering (MARS) farvestoffer til antistofkonjugering 13,18,19,20. Denne unikke Raman-palet består af nye farvestoffer med π-konjugerede tredobbelte bindinger (supplerende materiale), der hver viser en enkelt og smal epr-SRS-top i det bioortogonale Raman-spektralområde (figur 1C). Ved at ændre strukturen af kernekromoforen og isotopisk redigere begge atomer af den tredobbelte binding (supplerende materiale) er der udviklet spektralt adskilte Raman-sonder. Ved at udnytte den skalerbare multiplexitet tilbyder epr-SRS-mikroskopi kombineret med MARS-farvepaletten en optisk strategi til one-shot multiplex-proteinbilleddannelse i celler og væv.
Immuno-eprSRS giver en alternativ strategi til de nuværende multiplex proteinbilleddannelsesmetoder med unikke styrker. Sammenlignet med fluorescenstilgange med cyklisk farvning, billeddannelse og signalfjernelse sikrer denne Raman-baserede platform enkeltrunde farvning og billeddannelse. Derfor omgår det den praktiske kompleksitet i cykliske procedurer og forenkler i vid udstrækning protokollen og åbner dermed nye territorier for multiplexeret proteinbilleddannelse. Ved at udnytte en Raman-farvestof-skræddersyet vævsclearingsprotokol er immuno-eprSRS f.eks. blevet udvidet til tre dimensioner til stærkt multiplexeret proteinkortlægning i tykt intakt væv17. Over 10 proteinmål blev visualiseret langs millimetertykt musehjernevæv17. For nylig er kobling af immuno-eprSRS med en optimeret biomolekyle-retentionsekspansionsmikroskopi (ExM) protokol21, one-shot nanoskala billeddannelse af flere mål også blevet demonstreret22. Sammenlignet med billeddannelse af massespektroskopi 4,9 er epr-SRS ikke-destruktiv og har iboende optisk sektionsevne. Desuden er epr-SRS mere tidseffektiv på vævsscanning. Typisk tager et vævsområde på 0,25 mm2 med en pixelstørrelse på 0,5 μm kun et par minutter at afbilde for en enkelt epr-SRS-kanal. For eksempel er den samlede billedbehandlingstid for fire SRS-kanaler plus fire fluorescenskanaler i figur 4 ca. 10 minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev udført i overensstemmelse med dyreforsøgsprotokollen (AC-AABD1552) godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Columbia University.
1. Fremstilling af Raman-farvestof-konjugerede antistoffer
- Konjugationsbufferen forberedes som ~0,1 M NaHCO3 i PBS-buffer, pH = 8,3, opbevares ved 4 °C.
- N-hydroxysuccinimidy (NHS) esterfunktioneret MARS-sonde (supplerende materiale) opløsning fremstilles som 3 mM i vandfri DMSO. Syntese af MARS-sonder kan henvises til tidligere rapporter 13,17,18.
BEMÆRK: Til opbevaringsformål skal farvestoffet NHS-esteropløsning beskyttes mod lys og opbevares ved -20 °C. - Antistoffaste stoffer opløses i konjugeringsbufferen til en koncentration på 2 mg/ml. For antistoffer, der opløses i andre buffere, udveksles de i konjugationsbufferen til en koncentration på 1-2 mg/ml med centrifugalfiltre.
BEMÆRK: Meget krydsadsorberede sekundære antistoffer foretrækkes til multipleksfarvning for at minimere reaktivitet på tværs af arter. De anvendte sekundære antistoffer er anført i tabel 1 og materialetabel. - Udfør bøjningsreaktionen.
- For sekundære antistoffer tilsættes 15 gange molært overskud af farvestofopløsning til antistofopløsningen i et glashætteglas langsomt under omrøring. For eksempel tilsættes 35 μL 3 ml 3 mM farvestofopløsning i 0,5 ml 2 mg/ml antistofopløsning.
- Inkuber reaktionsblandingen ved stuetemperatur (RT) under omrøring i 1 time. Beskyt reaktionen mod lys.
- Rensning.
- Opslæmningen af gelfiltreringsharpiks (materialetabel) forberedes i PBS-bufferen ved at følge trin 1.5.2-1.5.4.
- Tilsæt 10 ml gelfiltreringsharpikspulver i 40 ml PBS-buffer inde i et 50 ml rør.
- Opløsningen opbevares i et vandbad på 90 °C i 1 time.
- Dekanter supernatanten, og tilføj PBS igen til 40 ml. Opbevar gyllen ved 4 °C.
- Pak størrelsesudelukkelseskolonnen (1 cm diameter, tyngdekraftsstrømningskolonner) med gylleopløsningen i en højde på 10-15 cm.
- Skyl og vask søjlen med ~10 ml PBS-buffer for yderligere at pakke harpiksen.
- Pipet konjugeringsreaktionsblandingen (~ 0,5 ml) til søjlen. Der tilsættes straks 1 ml PBS-buffer som elueringsbuffer, når al reaktionsblanding er indlæst. Genopfyld konstant elueringsbufferen (PBS) til kolonnen.
- Saml eluatet af den konjugerede opløsning ved at se på farven på søjlen (MARS-farvestoffer har lysegrønne til blå farver) eller måle absorbansen ved 280 nm (A280).
- Den opsamlede opløsning koncentreres til 1-2 mg/ml med et centrifugalfilter.
- Bestem koncentrationen og den gennemsnitlige grad af mærkning (DOL, farvestof-til-protein-forholdet) ved at måle det ultraviolet-synlige (UV-Vis) spektrum af den konjugerede opløsning med en nanopladelæser.
BEMÆRK: Supplerende materiale giver egenskaber af MARS-farvestof NHS-estere til beregning. Den normale DOL for det sekundære antistof er omkring 3.
2. Forberedelse af vævsprøve
- Paraformaldehyd fikserede musehjernevæv.
- Anæstesi musene (C57BL/6J, Hun, 25 d postnatal) med isofluran. Vurder den korrekte bedest med en tåklemmetest.
- Dræb musene ved cervikal forskydning. Perfuser musene straks med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS transkardialt.
- Saml musehjernen ved at følge trin 2.1.4-2.1.5
- Skær opad fra hjernestammen langs sagittal suturen. Skræl de to halvdele af kraniet væk til siden og øs hjernen ud med en pincet.
- Fastgør den indsamlede hjerne i 4% PFA i PBS ved 4 °C i 24 timer. Vask derefter hjernen i PBS-buffer ved 4 °C i 24 timer for at fjerne overskydende PFA.
- Fast agarose anbringes i vand til en endelig koncentration på 7 % (w/v) i et bægerglas med et løst låg. Rør opløsningen med en glasrørestang. Opvarm opslæmningen i mikrobølgeovnen, indtil opløsningen er klar.
- Lad agarose afkøle til 45-55 °C.
- Hæld den flydende agarose i et lille kammer, overfør derefter hjernen fra PBS til flydende agarose og orienter den med en spatel for at indlejre hjernen. Vent på, at vævs-agaroseblokken hærder.
- Sektion vævs-agrose i 40-μm tykke koronale skiver ved hjælp af et vibratom.
- Overfør vævet til en 4-brønds plade til følgende farvning. Fjern agarose med en pincet. Vask vævet med 1 ml PBS tre gange.
- Fast frosset mus bugspytkirtlen væv.
- Fastgør musens bugspytkirtel i 4% PFA i PBS ved 4 °C med gyngen i 16-20 timer.
- Prøven vaskes i 1 ml PBS (4 °C) tre gange for at fjerne PFA.
- Integrer prøven (~ 0,3-0,5 cm i størrelse) i optimale skæretemperatur (OCT) sammensatte blokke. Sæt 2 dråber OCT i en plastik cryomold. Placer vævet i korrekt orientering og hæld OCT oven på væv, indtil intet af vævet forbliver udsat.
- Træk bugspytkirtlen til 8 μm tykke skiver og immobiliser dem på et vævsbindende glasglasglas, opbevar dem i -80 °C.
- Før farvning skal prøven udlignes til RT. Vask vævet med PBS for at fjerne OCT-blokke.
- FFPE-prøver.
- Bag FFPE-vævsglideren ved 60 °C i 10 minutter.
- Deparaffinisering og rehydrering: Anbring prøverne sekventielt i følgende opløsninger i et 50 ml rør ved RT i 3 minutter hver gang med mild omrystning:
xylen to gange,
ethanol to gange,
95% (vol/vol) ethanol i deioniseret vand to gange,
70% (vol/vol) ethanol i deioniseret vand to gange,
50% (vol/vol) ethanol i deioniseret vand én gang,
deioniseret vand en gang. - Prøven overføres til 20 mM natriumcitrat (pH 8,0) ved 100 °C i en glasbeholder. Sørg for, at vævene er nedsænket i opløsningen.
- Sæt krukken i et 60 °C vandbad i 45 min.
- Prøven vaskes med deioniseret vand ved RT i 5 minutter.
3. Vævsimmun-eprSRS-farvning
- Brug en hydrofob pen til at tegne en grænse omkring vævssektionerne på diaset.
BEMÆRK: En glidefarvningsbeholder bruges til at følge inkubationstrin af væv på diaset. Flydende væv (40 μm tykke musehjernesektioner) farves i brøndplader. - Inkuber vævene med 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 i PBS) i 10 minutter.
- Inkuber vævene med blokerende buffer (5% æselserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) i 30 minutter.
- Forbered den primære farvningsopløsning: Tilsæt alle primære antistoffer til 200-500 μL farvningsbuffer (2% æselserum, 0,5% Triton X-100 i PBS) i ønskede koncentrationer. Centrifugering af den primære farvningsopløsning ved 13.000 x g i 5 minutter. Brug kun supernatanten, hvis bundfald dannes.
- Inkubere vævet i den primære antistofopløsning ved 4 °C i 1-2 dage.
BEMÆRK: Ved farvning af vævssektioner på diaset skal prøven lægges i en farvningsboks med en vådserviet for at opretholde fugtigheden. - Vask diasene tre gange med 0,3-0,5% PBST ved RT i 5 minutter hver. Brug 1 ml PBST til flydende væv. For væv på diaset skal du vaske diasene i en diasfarvningsbeholder og sørge for, at væv alle er nedsænket i opløsningen.
- Inkuber vævet i 200-500 μL blokerende buffer i 30 minutter.
- Den sekundære farvningsopløsning forberedes: Der tilsættes alle sekundære antistoffer (og lektiner, hvis det er nødvendigt) til 200-500 μL farvningsbuffer med ønskede koncentrationer (normalt 10 μg/ml). Centrifugering af den sekundære farvningsopløsning ved 13.000 x g i 5 minutter. Brug kun supernatanten, hvis bundfald dannes.
- Inkubere vævene i 200-500 μL sekundær antistofopløsning ved 4 °C i 1-2 dage.
- Vask diasene to gange med 0,3-0,5% PBST ved RT i 5 minutter hver.
- Inkuber med 200-500 μL DAPI-opløsning i 30 minutter.
- Vask lysbillederne tre gange med PBS ved RT i 5 minutter hver.
- For flydende vævssektioner skal du overføre dem til glasrutschebaner med en glasdækkende pipette. Spred vævet med en vævsbørste og rengør omgivelserne med klude, hvis det er nødvendigt.
- Monter vævet i en dråbe antifade reagenser med et glasdæksel og fastgør det med neglelak.
4. SRS-mikroskop samling
BEMÆRK: Et kommercielt konfokalt fluorescenssystem anvendes i tandem SRS-fluorescensbilleddannelse. Flere beskrivelser findes i en tidligere rapport17. Denne protokol vil fokusere på SRS-billeddannelsessiden ved hjælp af smalbåndsexcitation.
- Forbered et vibrationsisoleret optisk bord i et rum med temperaturregulering.
- Anbring et synkroniseret dobbeltlasersystem (pumpe og Stokes) på det optiske bord (figur 2A) med en køler tilsluttet.
BEMÆRK: Den grundlæggende laser i dobbeltlasersystemet giver et udgangspulstog på 1064 nm med 6-ps pulsbredde og 80 MHz gentagelseshastighed. Stokes-strålen er fra den grundlæggende laser. Stokes-strålens intensitet blev moduleret sinusformet af en indbygget elektrooptisk amplitudemodulator (EOM) ved 8 MHz med en moduleringsdybde på mere end 90%. Den anden del af den grundlæggende laser er frekvens-fordoblet til 532 nm, som yderligere bruges til synkront at frø en picosekund optisk parametrisk oscillator (OPO) til at producere et tilstandslåst pulstog med 5-6 ps pulsbredde (OPO'ens tomgangsstråle er blokeret med et interferometrisk filter). OPO'ens udgangsbølgelængde kan indstilles fra 720-950 nm, hvilket fungerer som pumpestrålen. - Monter spejlene (bølgelængdeområde: 750-1100 nm), dikroiske strålesplittere (DBS, 980 nm langpasfilter, rektangulært) og linse (akromatisk, AR-belægning til 650-1050 nm) til deres respektive monteringer. Brug meget stablekinematiske spejlbeslag til spejle og dikroiske strålesplittere.
- Mål højden på laserudgangen og strålestørrelserne på pumpen og Stokes-strålerne. Juster højden på spejle og linser for at sikre, at lyset rammer midten af alle de optiske elementer.
- Placer spejl M1 på det optiske bord, og gør det ~ 45 ° til laserudgangen (figur 2B). Brug knapperne på det kinematiske beslag til at foretage spids- og vippejusteringer. Sørg for, at lyset bevæger sig i samme højde langs bordets længde og en lige linje i forhold til bordet.
- Placer og juster de dikroiske strålesplittere (980 nm langpasfiltre) og spejle for at opdele pumpen og Stokes-bjælkerne (figur 2A-B).
- Placer og juster linsepar (L1, L2 og L3, L4) på hver af strålebanerne for at samle bjælkerne og udvide strålediametrene, så de passer til målets bageste pupil (figur 2A-B).
- Brug M7- og M8-spejle til at justere kombinerede laserstråler ind i mikroskopet (figur 2C). Juster først den ene stråle ind i mikroskopet, og brug spejlparrene på den anden stråle for at sikre den rumlige overlapning af de to bjælker.
- Konfigurer registreringsdelen.
- Sæt en infrarødbelagt oliekondensator på (1,4-NA) for at opsamle den fremadgående pumpe og Stokes-strålerne efter at have passeret prøverne (figur 2C).
- Monter en Si-fotodiode med stort område på en afskærmet kasse med BNC-stik (figur 2E). Føj en 64-V DC-strømforsyning til den monterede fotodiode for at øge dens mætningstærskel og responsbåndbredde.
- Reflekter det fremadgående lys med et 2-tommers spejl. Fokuser lyset på fotodioden igen efter et optisk filter for at blokere den modulerende Stokes-stråle (figur 2D).
- Send fotodiodens udgangsstrøm til en hurtig låseforstærker afsluttet med 50 til signaldemodulering. Send en 8 MHz-udløser til lock-in-forstærkeren som referencesignal.
- Send den infasede X-komponent i lock-in-forstærkeren ind i mikroskopets analoge grænsefladeboks.
- Optimer den tidsmæssige overlapning med det indbyggede motoriserede forsinkelsestrin ved at måle SRS-signalet fra ren D2O-væske ved mikroskopet.
5. Billedoptagelse og analyse
- Udfør flerkanals epr-SRS-billeddannelse med sekventiel pumpebølgelængdeindstilling.
- Indstil lasereffekten til P-pumpe = 10-40 mW og PStokes = 40-80 mW på laserkontrolpanelet.
- Indstil pixelopnøvendetiden til 2-4 μs, og brug flere billeder i gennemsnit typisk 10-20 billeder på mikroskopisoftwaren.
BEMÆRK: Undgå en kombinatorisk brug af høj lasereffekt (P-pumpe> 40 mW, PStokes> 80 mW) og lille pixelstørrelse (<0,2 μm), som sandsynligvis forårsager 'blegningseffekt' af Raman-farvestoffer på grund af multifoton-excitation. - Indstil tidskonstanterne for lock-in-forstærkeren til halvdelen af pixelopfyldetiden.
- Lineær spektral blanding.
BEMÆRK: epr-SRS følger en streng lineær signal-til-koncentration-afhængighed over hele koncentrationsområdet; lineær spektral unmixing er således effektiv til at fjerne eventuelle krydssamtaler mellem kanaler. For N-kanal epr-SRS-måling med N MARS-sonder kan målte signaler (S) udtrykkes som S = MC, hvor C er MARS-sondekoncentrationerne, og M er en N x N-matrix bestemt af Raman-tværsnit af MARS-sonder.- Mål matrix M på enkeltfarvede immun-eprSRS-prøver mærket med forskellige MARS-sonder.
- Brug ligning C = M-1· S til bestemmelse af MARS-sondens koncentrationsmatrix med multiplexprøvesignalmåling S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser eksempler på billeder af epr-SRS i forskellige prøver, herunder faste celler (figur 3A), paraformaldehyd (PFA)-fast musevæv (figur 3B) og formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) humane prøver (figur 3C). Den rumlige opløsning af SRS-mikroskopi er diffraktionsbegrænset, den typiske laterale opløsning er ~ 300 nm, og den aksiale opløsning er 1-2 μm ved hjælp af nær-infrarødt lys til excitation. Som et resultat blev fine subcellulære strukturer såsom mikrotubuli i HeLa-celler trofast afsløret med immuno-eprSRS-billeddannelse af α-tubulin (figur 3A). Desuden er epr-SRS generelt kompatibel med FFPE-væv (figur 3C), som er en almindelig form for biopsiprøver til klinisk diagnose og patologisk forskning. I lighed med to-fotonfluorescensmikroskopi har epr-SRS som en ikke-lineær proces optisk sektioneringsevne til visualisering af tredimensionelle mønstre med subcellulær opløsning (figur 3D-E).
Vi fremviste først multiplexproteinbilleddannelsesværktøjet af epr-SRS på faste frosne vævsprøver af museøer af Langerhans i bugspytkirtlen. Flere interesserede mål er udvalgt, herunder hormonekspression (f.eks. insulin, glukoseagonist (glukagon), pancreaspolypeptid (PP) og somatostatin) til celletypeklassificering (β-celler og ikke-β-celler (α-, δ-celler)) og transkriptionsfaktorer, der vides at være relateret til β-celle heterogenitet23. Bemærk, da fluorescensdetektion er ortogonal til SRS-detektion, er epr-SRS fuldt kompatibel med konfokal fluorescens og to-fotonfluorescens. Som et proof-of-concept blev 7-farvet SRS-fluorescens tandembilleddannelse på en enkelt ø let opnået (figur 4) med god kontrast og korrekte mønstre. Mål med lavt udtryk, såsom transkriptionsfaktoren Pdx1, blev afbildet med tilstrækkelig kontrast.
Vi demonstrerede også en ottefarvet SRS-fluorescens tandembilleddannelse i PFA-fast musehjernevæv (figur 5). Gennem etablerede biomarkører kan forskellige celletyper, såsom cerebellære granulneuroner (NeuN), Purkinje-neuroner (Calbindin), astrocytter (GFAP), oligodendrocytter (MBP) og GABAergiske neuroner (GABAB2-receptor ) identificeres.
Figur 1: Epr-SRS-mikroskopi til stærkt multiplexeret proteinbilleddannelse. (A) Energidiagram for spontan Raman, ikke-resonans SRS og elektronisk præresonans SRS (epr-SRS). Vibrationsovergangshastigheden for kromoforer vil blive forbedret i epr-SRS med op til 1013 gange. (B) Epitopbaseret immunbilleddannelse af α-tubulin blev påvist i COS-7-celler farvet af ATTO740 med høj vibrationskontrast ved epr-SRS. Epr-SRS-signalet forsvinder helt, når pumpens laserbølgelængde kun er off-resonans med 2 nm (højre). Skalastænger, 20 μm. (C) Epr-SRS-spektre af NHS-esterkonjugerede MARS-sonder som anført i supplerende materiale. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udformningen af opsætningen af SRS-mikroskopet. (A) Skematisk diagram over SRS-opsætningen. EOM = elektrooptisk modulator, M = spejl, L = linse, DBS = dikroisk strålesplitter, DM = dikroisk spejl, OB = objektiv linse, CO = kondensator, F = filter, PD = fotodiode. (B) Dette panel viser laserexcitationsdelen. Dobbeltfarvestråle fra laserudgang adskilles først med hver stråle, der kollimeres og udvides og senere kombineres og ledes ind i mikroskoplegemet. (C) Dette panel viser den overførte samling med en kondensator. (D) Dette panel viser SRS-detektionsdelen. Fotodiode og filter er monteret på afskærmet kasse med to BNC hunstik. Lavere BNC-stik er til omvendt biasspænding, og det højere BNC-stik er til strømsignaludgang til låseforstærker afsluttet med 50 Ω. (E) Dette panel viser, hvordan Si-fotodioden er monteret inde i den afskærmede boks. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Raman farvestofbilleddannelse af forskellige proteinmarkører via immunolabeling. (A) Immuno-eprSRS-billeddannelse af α-tubulin i HeLa-celler. (B) Immuno-eprSRS-billeddannelse af NeuN i PFA-fikseret musehjernecortex. (C) Immuno-eprSRS-billeddannelse af Vimentin i FFPE-væv hos human nyre. (D) Volumengengivne billede afMARS2145 farvet GFAP i 100 μm tykt musehjernevæv. Trinstørrelsen i z var 2 μm. (E) Volumen-gengivet billede afMARS2228 farvet NeuN i 40-μm tykt musehjernevæv. Trinstørrelsen i z var 1 μm. Vægtstænger, 20 μm in (A), 50 μm in (B-C), 30 μm in (D-E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af 7-farvet tandembilleddannelse af hormoner og transkriptionsfaktorer på frosset museøvæv. Epr-SRS: Insulin (detekteret af Cy5, β-cellemarkør, grøn), Pdx1 (detekteret af MARS2228, transkriptionsfaktor, rød), Glucagon (detekteret af MARS2216, α-cellemarkør, gul), PP (detekteret af MARS2147, PP-cellemarkør, blå). Fluorescens: Somatostatin (Alexa488, δ-cellemarkør, orange), Nkx2.2 (Cy3, transkriptionsfaktor, magenta), DAPI (kerne, mørkeblå). Skalabjælke, 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af 8-farvet tandembilleddannelse af celletypemarkører på PFA-fast musehjernesektion. Fluorescens: DNA (DAPI), GABA (γ-aminosmørsyre) B-receptor 2 (GABAergiske neuroner, Alexa Fluor 488), neuronale kerner (NeuN; neuroner, Alexa Fluor 568) og Calbindin (Purkinje neuroner, Alexa Fluor 647); epr-SRS: hvedekim agglutinin (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), myelin basisk protein (MBP; oligodendrocytter, MARS2176) og GFAP (astrocytter og neurale stamceller, MARS2145). Vægtstang, 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Validerede antistoffer for immuno-eprSRS. Se tabellen over materialer for at få flere oplysninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende materiale: Egenskaber for 8 anvendte NHS-ester-funktionaliserede MARS-sonder. λabs og excitationskoefficienter for MARS-farvestoffer blev målt i DMSO-opløsning på UV-Vis-spektrometer med 1 cm glaskuvette som beholder. De absolutte Raman-tværsnit af MARS-farvestoffer blev bestemt i DMSO ved at sammenligne epr-SRS-signalet for MARS-farvestoffer med standard C-O-stræktilstanden (1030 cm-1) af methanol. Det absolutte Raman-tværsnit for standard C-O-stræktilstand (1030 cm-1) af methanol blev rapporteret som 2,1 x 10-30 cm2 ved 785 nm. Et tværsnit på 0,9 x 10-30 cm2 blev anslået til under 860 nm pumpebølgelængde ved ekstrapolering. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi immuno-eprSRS-protokollen, som er bredt anvendelig på almindelige vævstyper, herunder friskbevaret musevæv, FFPE humant væv og frosne musevæv. Immuno-eprSRS er blevet valideret for et panel af epitoper i celler og væv, som anført i tabel 1. Denne one-shot platform er især velegnet til applikationer, hvor cykliske strategier ikke fungerer godt. For eksempel kræver cyklisk fluorescens tykt væv, da flere runder af 3D-immunmærkning er upraktiske lange17. Det er også meget sandsynligt, at det vil medføre registreringsfejl på grund af ikke-lineære 3D-histologiske ændringer11,17. Immuno-eprSRS overvinder praktiske barrierer for cyklisk fluorescens i et sådant scenario og giver mulighed for at afsløre proteininteraktionsnetværk på tværs af et stort volumen17.
Nuværende multiplexitet er hovedsageligt begrænset af tilgængeligheden af sekundære antistoffer. Mens vi i denne protokol fokuserede på indirekte immunmærkning, hvor MARS-sonder konjugeres til sekundære antistoffer, er direkte immunmærkning og lectinfarvning mulig17. Efter mere primær antistofvalidering med Raman-farvestoffer forventes 20 kanaler med aktuelt udviklede Raman-farvestoffer 13,18,24. Desuden kan billeddannelse af meget lave rigelige mål være udfordrende for epr-SRS på grund af dets let kompromitterede følsomhed sammenlignet med det konfokale fluorescenssystem. I den forbindelse anbefaler vi, at fluorescenskanaler tildeles relativt lave rigelige mål til lysere MARS-farvestoffer og mål med lav ekspression.
Et kritisk aspekt af protokollen er tilgængeligheden af instrumenter og sonder. Instrumentationsmæssigt består et SRS-mikroskop generelt af en dobbeltfarvet laserkilde med en optisk modulator, et mikroskop, en fotodiodedetektor og en lock-in-forstærker til demodulering25. Hver komponent er kommercielt tilgængelig med en lidt højere samlet pris end et to-foton laser scanning fluorescens mikroskop. Et fuldt integreret multimodalt SRS / fluorescensforskningsmikroskop er blevet kommercialiseret26 ved hjælp af en lignende picosekundlaser som her til SRS-excitation og kontinuerlig bølge (CW) lasersæt til fluorescens. Dette system er let anvendeligt til multiplex vibrationsbilleddannelse i hverdagens biologiske forskning. Sondemæssigt er MARS-sonder ikke blevet kommercialiseret endnu og kræver nogle syntesefunktioner. Alternativt kan mange kommercielle langtrøde fluoroforer (se Extended Data Table 1 i L. Wei et al. Nature 201713) bruges til epr-SRS. Alligevel kan multipleksiteten blive kompromitteret. Da MARS-sonder af natur er små organiske molekyler, ligner immuno-eprSRS desuden immunofluorescens med hensyn til vævsfarvning. Derfor kan arkivet over validerede affinitetsreagenser såsom antistoffer i immunofluorescens let overføres til immuno-eprSRS-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ruth A. Singer og Richard K.P. Benninger for at have leveret musevæv i bugspytkirtlen. W.M. anerkender støtte fra NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) og US Army (W911NF-19-1-0214).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al.
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).
