Summary
Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.
Abstract
Het visualiseren van een breed scala aan specifieke biomarkers in weefsels speelt een vitale rol bij het verkennen van de ingewikkelde organisaties van complexe biologische systemen. Vandaar dat sterk gemultiplexte beeldvormingstechnologieën steeds meer worden gewaardeerd. Hier beschrijven we een opkomend platform van sterk gemultiplexte vibrationele beeldvorming van specifieke eiwitten met vergelijkbare gevoeligheid voor standaard immunofluorescentie via elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen. Deze methode omzeilt de limiet van spectraal oplosbare kanalen in conventionele immunofluorescentie en biedt een one-shot optische benadering om meerdere markers in weefsels met subcellulaire resolutie te ondervragen. Het is over het algemeen compatibel met standaard weefselpreparaten, waaronder paraformaldehyde-gefixeerde weefsels, bevroren weefsels en formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) menselijke weefsels. We verwachten dat dit platform een uitgebreider beeld zal geven van eiwitinteracties van biologische specimens, met name voor dikke intacte weefsels. Dit protocol biedt de workflow van antilichaamvoorbereiding tot weefselmonsterkleuring, tot SRS-microscoopassemblage, tot epr-SRS-weefselbeeldvorming.
Introduction
Complexe weefselsystemen zijn samengesteld uit verschillende cellulaire subpopulaties waarvan de ruimtelijke locaties en interactienetwerken diep verweven zijn met hun functies en disfuncties 1,2. Om de weefselarchitectuur te onthullen en de complexiteit ervan te ondervragen, is kennis van de ruimtelijke locaties van eiwitten met eencellige resolutie essentieel. Vandaar dat sterk gemultiplexte eiwitbeeldvormingstechnologieën steeds meer worden gewaardeerd en een hoeksteen kunnen worden voor het bestuderen van weefselbiologie 3,4,5. De huidige gangbare multiplexed eiwitbeeldvormingsmethoden kunnen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën. De ene is seriële immunofluorescentie beeldvorming die afhankelijk is van meerdere rondes van weefselkleuring en beeldvorming, en de andere is beeldvorming van massacytometrie in combinatie met zware metalen gelabelde antilichamen 6,7,8,9,10,11,12.
Hier wordt een alternatieve strategie voor op multiplexantilichamen gebaseerde eiwitbeeldvorming geïntroduceerd. In tegenstelling tot de gangbare fluorescentiebeeldvormingsmodaliteit, die slechts 4-5 kanalen tegelijkertijd kan visualiseren vanwege de brede excitatie- en emissiespectra (volledige breedte bij half maximum (FWHM) ~ 500 cm-1), vertoont Raman-microscopie veel smallere spectrale lijnbreedte (FWHM ~ 10 cm-1) en biedt daarom schaalbare multiplexiteit. Onlangs is, door gebruik te maken van het smalle spectrum, een nieuw schema van Raman-microscopie genaamd elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) microscopie ontwikkeld, wat een krachtige strategie biedt voor multiplexed beeldvorming13. Door de elektronisch gekoppelde trillingsmodi van Raman-kleurstoffen te onderzoeken, bereikt epr-SRS een drastisch verbeteringseffect van 1013-voudig op Raman-doorsneden en overwint het gevoeligheidsknelpunt van conventionele Raman-microscopie (Figuur 1A) 13,14,15. Als gevolg hiervan is de detectiegrens van epr-SRS verlegd naar sub-μM, waardoor Raman interessante moleculaire markers zoals specifieke eiwitten en organellen in cellen kan detecteren13,16. Met name met behulp van Raman-kleurstof-geconjugeerde antilichamen werd epr-SRS-beeldvorming van specifieke eiwitten in cellen en weefsels (immuno-eprSRS genoemd) aangetoond met een vergelijkbare gevoeligheid voor standaard immunofluorescentie (figuur 1B)13,17. Door de pompgolflengte met slechts 2 nm af te stemmen, zal het epr-SRS-signaal volledig uitgeschakeld zijn (figuur 1B), wat een hoog trillingscontrast laat zien.
Aan de sondezijde is een reeks regenboogachtige Raman-sondes genaamd Manhattan Raman-verstrooiingskleurstoffen (MARS) ontwikkeld voor antilichaamconjugatie 13,18,19,20. Dit unieke Raman-palet bestaat uit nieuwe kleurstoffen met π-geconjugeerde drievoudige bindingen (aanvullend materiaal), die elk een enkele en smalle epr-SRS-piek in het bioorthogonale Raman-spectraalbereik vertonen (figuur 1C). Door de structuur van de kernchromofoor te wijzigen en beide atomen van de drievoudige binding isotopisch te bewerken (Aanvullend Materiaal), zijn spectraal gescheiden Raman-sondes ontwikkeld. Door gebruik te maken van de schaalbare multiplexiteit, biedt epr-SRS-microscopie in combinatie met het MARS-kleurpalet een optische strategie voor one-shot multiplex-eiwitbeeldvorming in cellen en weefsels.
Immuno-eprSRS biedt een alternatieve strategie voor de huidige multiplex eiwitbeeldvormingsmethoden met unieke sterke punten. Vergeleken met fluorescentiebenaderingen met cyclische kleuring, beeldvorming en signaalverwijdering, zorgt dit op Raman gebaseerde platform voor single-round kleuring en beeldvorming. Daarom omzeilt het praktische complexiteit in cyclische procedures en vereenvoudigt het het protocol grotendeels, waardoor nieuwe gebieden van multiplexed eiwitbeeldvorming worden geopend. Bijvoorbeeld, met behulp van een Raman-dye-op maat gemaakt weefselverwijderingsprotocol, is immuno-eprSRS uitgebreid tot drie dimensies voor sterk gemultiplexte eiwitmapping in dikke intacte weefsels17. Meer dan 10 eiwitdoelen werden gevisualiseerd langs millimeterdikke muizenhersenweefsels17. Meer recent, koppeling van immuno-eprSRS met een geoptimaliseerd biomolecuul-retentie expansie microscopie (ExM) protocol21, one-shot nanoschaal beeldvorming van meerdere doelen is ook aangetoond22. Vergeleken met beeldvorming van massaspectroscopie 4,9 is epr-SRS niet-destructief en heeft het intrinsiek optische sectioning vermogen. Bovendien is epr-SRS tijdefficiënter op weefselscanning. Doorgaans duurt het slechts enkele minuten voordat een weefselgebied van0,25 mm 2 met een pixelgrootte van 0,5 μm een afbeelding heeft voor een enkel epr-SRS-kanaal. De totale beeldtijd van vier SRS-kanalen plus vier fluorescentiekanalen in figuur 4 is bijvoorbeeld ongeveer 10 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met het dierexperimentele protocol (AC-AABD1552) goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Columbia University.
1. Bereiding van Raman-kleurstof-geconjugeerde antilichamen
- Bereid de conjugatiebuffer voor als ~0,1 M NaHCO3 in PBS-buffer, pH = 8,3, bewaren bij 4 °C.
- Bereid N-hydroxysuccinimidy (NHS) ester-gefunctioneerde MARS-sonde (aanvullend materiaal) oplossing voor als 3 mM in watervrije DMSO. Synthese van MARS-sondes kan worden verwezen naar eerdere rapporten 13,17,18.
OPMERKING: Voor opslagdoeleinden moet de kleurstof NHS-esteroplossing worden beschermd tegen licht en op -20 °C worden gehouden. - Los antilichaambestanddelen op in de conjugatiebuffer tot een concentratie van 2 mg/ml. Voor antilichamen die zijn opgelost in andere buffers, wissel ze in de conjugatiebuffer tot een concentratie van 1-2 mg / ml met centrifugaalfilters.
OPMERKING: Sterk geconvecteerde secundaire antilichamen hebben de voorkeur voor multiplexkleuring om reactiviteit tussen soorten te minimaliseren. De gebruikte secundaire antilichamen zijn vermeld in tabel 1 en tabel met materialen. - Voer de conjugatiereactie uit.
- Voeg voor secundaire antilichamen 15-voudig molair overschot aan kleurstofoplossing langzaam onder roeren toe aan de antilichaamoplossing in een glazen injectieflacon. Voeg bijvoorbeeld in 0,5 ml 2 mg / ml antilichaamoplossing 35 μl 3 mM kleurstofoplossing toe.
- Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur (RT) met roeren gedurende 1 uur. Bescherm de reactie tegen licht.
- Zuivering.
- Bereid de slurry van gelfiltratiehars (tabel met materialen) in PBS-buffer, volg stappen 1.5.2-1.5.4.
- Voeg 10 ml gelfiltratieharspoeder toe aan 40 ml PBS-buffer in een buis van 50 ml.
- Bewaar de oplossing gedurende 1 uur in een waterbad van 90 °C.
- Decanteer het supernatant en voeg PBS opnieuw toe tot 40 ml. Bewaar de drijfmest bij 4 °C.
- Verpak de maatuitsluitingskolom (1 cm diameter, zwaartekrachtstroomkolommen) met de slurry-oplossing tot een hoogte van 10-15 cm.
- Spoel en was de kolom met ~ 10 ml PBS-buffer om de hars verder te verpakken.
- Pipetteer het conjugatiereactiemengsel (~ 0,5 ml) naar de kolom. Voeg onmiddellijk 1 ml PBS-buffer toe als elutiebuffer wanneer alle reactiemengsels zijn geladen. Vul de elutiebuffer (PBS) voortdurend bij aan de kolom.
- Verzamel het eluaat van de geconjugeerde oplossing door naar de kleur op de kolom te kijken (MARS-kleurstoffen hebben lichtgroene tot blauwe kleuren) of de absorptie te meten bij 280 nm (A280).
- Concentreer de verzamelde oplossing tot 1-2 mg/ml met een centrifugaalfilter.
- Bepaal de concentratie en de gemiddelde mate van etikettering (DOL, kleurstof-eiwitverhouding) door het ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectrum van de geconjugeerde oplossing te meten met een nanoplaatlezer.
OPMERKING: Aanvullend materiaal biedt eigenschappen van MARS-kleurstof NHS-esters voor berekening. De normale DOL voor het secundaire antilichaam is ongeveer 3.
2. Voorbereiding van weefselmonsters
- Paraformaldehyde vaste hersenweefsels van muizen.
- Verdoof de muizen (C57BL/6J, Vrouwtje, 25 d postnataal) met isofluraan. Beoordeel de juiste verdoving met een teenknijptest.
- Dood de muizen door cervicale verplaatsing. Perfuseer de muizen onmiddellijk met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS transcardiaal.
- Verzamel het muizenbrein volgens stap 2.1.4-2.1.5
- Omhoog gesneden van de hersenstam langs de sagittale hechting. Pel de twee schedelhelften naar de zijkant en schep de hersenen eruit met een pincet.
- Fixeer de verzamelde hersenen in 4% PFA in PBS bij 4 °C gedurende 24 uur. Was vervolgens de hersenen in PBS-buffer bij 4 °C gedurende 24 uur om overtollige PFA te verwijderen.
- Breng vaste agarose in water tot een eindconcentratie van 7% (w/v) in een bekerglas, met een los deksel. Roer de oplossing met een glazen roerstaaf. Verwarm de drijfmest in de magnetron tot de oplossing helder is.
- Laat de agarose afkoelen tot 45-55 °C.
- Giet de vloeibare agarose in een kleine kamer, breng vervolgens de hersenen over van PBS naar vloeibare agarose en oriënteer het met een spatel om de hersenen in te bedden. Wacht tot het weefsel-agarose blok is uitgehard.
- Snijd het weefsel-agrose in 40-μm dikke coronale plakjes met behulp van een vibratome.
- Breng het weefsel over op een 4-well plaat voor de volgende kleuring. Verwijder de agarose met een pincet. Was het weefsel met 1 ml PBS, drie keer.
- Vaste bevroren muizen pancreas weefsels.
- Bevestig de muispancreata in 4% PFA in PBS bij 4 °C met schommelen gedurende 16-20 uur.
- Was het monster driemaal in 1 ml PBS (4 °C) om PFA te verwijderen.
- Sluit het monster (~ 0,3-0,5 cm groot) in optimale snijtemperatuur (OCT) samengestelde blokken. Doe 2 druppels OCT in een plastic cryomold. Plaats het weefsel in de juiste richting en giet OCT op weefsels totdat geen van het weefsel blootgesteld blijft.
- Snijd de pancreata tot plakken van 8 μm dik en immobiliseer ze op een weefselbindende glasplaat, bewaar ze in -80 °C.
- Breng het monster voor het kleuren in evenwicht met RT. Was het weefsel met PBS om OCT-blokken te verwijderen.
- FFPE-monsters.
- Bak de FFPE-weefselglaasjes gedurende 10 minuten op 60 °C.
- Deparaffinisatie en rehydratatie: Plaats monsters achtereenvolgens in de volgende oplossingen in een buis van 50 ml bij RT gedurende 3 minuten telkens met licht schudden:
xyleen twee keer,
ethanol twee keer,
95% (vol/vol) ethanol in gedeïoniseerd water tweemaal,
70% (vol/vol) ethanol in gedeïoniseerd water tweemaal,
50% (vol/vol) ethanol in gedeïoniseerd water eenmalig,
één keer gedeïoniseerd water. - Breng het monster over in een glazen pot in een glazen pot in een glazen pot in een natriumcitraat van 20 mM (pH 8,0). Zorg ervoor dat de weefsels in de oplossing zijn ondergedompeld.
- Zet de pot 45 min in een waterbad van 60 °C.
- Was het monster met gedeïoniseerd water bij RT gedurende 5 minuten.
3. Weefsel immuno-eprSRS kleuring
- Gebruik een hydrofobe pen om een grens te trekken rond de weefselsecties op de dia.
OPMERKING: Een diakleurpot wordt gebruikt voor het volgen van incubatiestappen van weefsel op de dia. Zwevende weefsels (40-μm dikke muizenhersensecties) zijn gekleurd in putplaten. - Incubeer de weefsels met 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 in PBS) gedurende 10 minuten.
- Incubeer de weefsels met blokkerende buffer (5% ezelsserum, 0,5% Triton X-100 in PBS) gedurende 30 minuten.
- Bereid de primaire kleuringsoplossing voor: voeg alle primaire antilichamen toe aan 200-500 μL kleuringsbuffer (2% ezelserum, 0,5% Triton X-100 in PBS) in de gewenste concentraties. Centrifugeer de primaire kleuringsoplossing bij 13.000 x g gedurende 5 minuten. Gebruik het supernatant alleen als er neerslag ontstaat.
- Incubeer het weefsel in de primaire antilichaamoplossing bij 4 °C gedurende 1-2 dagen.
OPMERKING: Voor het kleuren van weefselsecties op de dia, plaatst u het monster in een kleuringsdoos met een nat doekje om de luchtvochtigheid te behouden. - Was de dia's driemaal met 0,3-0,5% PBST bij RT gedurende 5 minuten elk. Gebruik 1 ml PBST voor zwevende weefsels. Voor tissues op de dia wast u de dia's in een vlekkenpot en zorgt u ervoor dat de weefsels allemaal in de oplossing zijn ondergedompeld.
- Incubeer het weefsel in 200-500 μL blokkerende buffer gedurende 30 minuten.
- Bereid de secundaire kleuringsoplossing voor: voeg alle secundaire antilichamen (en lectines indien nodig) toe aan 200-500 μL kleuringsbuffer met de gewenste concentraties (normaal 10 μg / ml). Centrifugeer de secundaire kleuringsoplossing bij 13.000 x g gedurende 5 minuten. Gebruik het supernatant alleen als er neerslag ontstaat.
- Incubeer de weefsels in 200-500 μL secundaire antilichaamoplossing bij 4 °C gedurende 1-2 dagen.
- Was de dia's tweemaal met 0,3-0,5% PBST bij RT gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer met 200-500 μL DAPI-oplossing gedurende 30 minuten.
- Was de dia's drie keer met PBS bij RT gedurende 5 minuten elk.
- Voor zwevende weefselsecties breng je ze over op glazen dia's met een pipet met glasdruppels. Verspreid het weefsel met een tissueborstel en reinig de omgeving indien nodig met doekjes.
- Monteer het weefsel in een druppel antifade-reagentia met een glazen dekplaat en zet het vast met nagellak.
4. SRS microscoop assemblage
OPMERKING: Een commercieel confocaal fluorescentiesysteem wordt gebruikt in tandem SRS-fluorescentie beeldvorming. Meer beschrijvingen zijn te vinden in een eerder rapport17. Dit protocol zal zich richten op de SRS-beeldvormingskant met behulp van smalbandige excitatie.
- Bereid een trillingsgeïsoleerde optische tafel voor in een kamer met temperatuurregeling.
- Plaats een gesynchroniseerd dubbellasersysteem (pomp en Stokes) op de optische tafel (figuur 2A) met een aangesloten koelmachine.
OPMERKING: De fundamentele laser in het dual-lasersysteem biedt een uitgangspulstrein op 1064 nm met een pulsbreedte van 6 pk en een herhalingsfrequentie van 80 MHz. De Stokes-straal is van de fundamentele laser. De intensiteit van de Stokes-bundel werd sinusoïdaal gemoduleerd door een ingebouwde elektro-optische amplitudemodulator (EOM) op 8 MHz met een modulatiediepte van meer dan 90%. Het andere deel van de fundamentele laser wordt verdubbeld tot 532 nm, wat verder wordt gebruikt om synchroon een picoseconde optische parametrische oscillator (OPO) te zaaien om een modus-vergrendelde pulstrein met 5-6 ps pulsbreedte te produceren (de idlerbundel van de OPO wordt geblokkeerd met een interferometrisch filter). De uitgangsgolflengte van de OPO is afstembaar van 720-950 nm, die dient als de pompbundel. - Monteer de spiegels (golflengtebereik: 750-1100 nm), dichroïsche bundelsplitters (DBS, 980 nm long-pass filter, rechthoekig) en lens (achromatisch, AR-coating voor 650-1050 nm) op hun respectieve vattingen. Gebruik zeer stabielekinematische spiegelbevestigingen voor de spiegels en dichroïsche bundelsplitters.
- Meet de hoogte van de laseruitgang en de straalgroottes van de pomp en de Stokes-stralen. Pas de hoogte van spiegels en lenzen aan om ervoor te zorgen dat het licht het midden van alle optische elementen raakt.
- Plaats spiegel M1 op de optische tafel en maak deze ~45° op de laseruitgang (figuur 2B). Gebruik de knoppen op de kinematische houder om de tip- en kantelaanpassingen te maken. Zorg ervoor dat het licht op dezelfde hoogte over de lengte van de tafel en een rechte lijn ten opzichte van de tafel reist.
- Plaats en lijn de dichroïsche bundelsplitters (980 nm langdoorlaatfilters) en spiegels uit om de pomp en Stokes-balken te splitsen (figuur 2A-B).
- Plaats lensparen (L1, L2 en L3, L4) op elk van de bundelpaden om de bundels te collimeren en de straaldiameters uit te breiden zodat deze overeenkomen met de achterste pupil van het objectief (figuur 2A-B).
- Gebruik M7- en M8-spiegels om gecombineerde laserstralen in de microscoop uit te lijnen (figuur 2C). Lijn eerst één straal uit in de microscoop en gebruik de spiegelparen op de andere bundel om de ruimtelijke overlap van de twee stralen te garanderen.
- Stel het detectiegedeelte in.
- Zet een infraroodgecoate oliecondensor (1,4-NA) op om de voorwaartse pomp en Stokes-balken te verzamelen na het passeren van de monsters (figuur 2C).
- Monteer een Si-fotodiode met groot oppervlak op een afgeschermde doos met BNC-connectoren (figuur 2E). Voeg een 64-V DC-voeding toe aan de gemonteerde fotodiode om de verzadigingsdrempel en responsbandbreedte te verhogen.
- Reflecteer het voorwaartse licht met een 2-inch spiegel. Richt het licht opnieuw op de fotodiode na een optisch filter om de modulerende Stokes-bundel te blokkeren (figuur 2D).
- Stuur de uitgangsstroom van de fotodiode naar een snelle lock-in versterker afgesloten met 50 voor signaaldemodulatie. Stuur een 8-MHz trigger naar de lock-in versterker als referentiesignaal.
- Stuur de in-fase X-component van de lock-in versterker naar de analoge interface box van de microscoop.
- Optimaliseer de tijdelijke overlap met de ingebouwde gemotoriseerde vertragingsfase door het SRS-signaal van zuivere D2O-vloeistof onder de microscoop te meten.
5. Beeldverwerving en -analyse
- Voer meerkanaals epr-SRS-beeldvorming uit met sequentiële pompgolflengteafstemming.
- Stel het laservermogen in op de P-pomp = 10-40 mW en PStokes = 40-80 mW op het laserbedieningspaneel.
- Stel de pixelverblijftijd in op 2-4 μs en gebruik meerdere frames met een gemiddelde van meestal 10-20 frames op de microscopiesoftware.
OPMERKING: Vermijd een combinatorisch gebruik van een hoog laservermogen (P-pomp> 40 mW, PStokes> 80 mW) en een kleine pixelgrootte (<0,2 μm), die waarschijnlijk een 'bleekeffect' van Raman-kleurstoffen veroorzaken als gevolg van multifoton-excitatie. - Stel de tijdconstanten van de lock-in versterker in op de helft van de pixelverblijftijd.
- Lineaire spectrale ontmenging.
OPMERKING: epr-SRS volgt een strikte lineaire signaal-naar-concentratie afhankelijkheid over het gehele concentratiebereik; lineaire spectrale ontmenging is dus effectief om eventuele kruisbesprekingen tussen kanalen te verwijderen. Voor N-kanaal epr-SRS-metingen met N MARS-sondes kunnen gemeten signalen (S) worden uitgedrukt als S = MC, waarbij C de MARS-sondeconcentraties zijn en M een N x N-matrix is die wordt bepaald door Raman-doorsneden van MARS-sondes.- Meet matrix M op eenkleurige immuno-eprSRS-monsters gelabeld met verschillende MARS-sondes.
- Gebruik vergelijking C = M−1· S om de concentratiematrix van de MARS-sonde te bepalen met multiplexmonstersignaalmeting S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont voorbeeldbeelden van epr-SRS in verschillende monsters, waaronder vaste cellen (figuur 3A), paraformaldehyde (PFA)-gefixeerde muizenweefsels (figuur 3B) en formaline-gefixeerde paraffine-embedded (FFPE) menselijke monsters (figuur 3C). De ruimtelijke resolutie van SRS-microscopie is diffractie-beperkt, de typische laterale resolutie is ~ 300 nm en de axiale resolutie is 1-2 μm met behulp van nabij-infrarood licht voor excitatie. Als gevolg hiervan werden fijne subcellulaire structuren zoals microtubuli in HeLa-cellen getrouw onthuld met immuno-eprSRS-beeldvorming van α-tubuline (figuur 3A). Bovendien is epr-SRS over het algemeen compatibel met FFPE-weefsels (figuur 3C), een veel voorkomende vorm van biopsiemonsters voor klinische diagnose en pathologisch onderzoek. Vergelijkbaar met twee-foton fluorescentiemicroscopie, als een niet-lineair proces, heeft epr-SRS optische sectioning-mogelijkheden voor het visualiseren van driedimensionale patronen met subcellulaire resolutie (figuur 3D-E).
We toonden voor het eerst het multiplex eiwitbeeldvormings nut van epr-SRS op vaste bevroren weefselmonsters van muizeneilandjes van Langerhans in de alvleesklier. Verschillende geïnteresseerde doelen worden geselecteerd, waaronder hormoonexpressie (bijv. Insuline, glucose-agonist (glucagon), pancreaspolypeptide (PP) en somatostatine) voor celtypeclassificatie (β-cellen en niet-β-cellen (α-, δ-cellen)) en transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze verband houden met β-cel heterogeniteit23. Aangezien fluorescentiedetectie orthogonaal is voor SRS-detectie, is epr-SRS volledig compatibel met confocale fluorescentie en fluorescentie met twee fotonen. Als proof-of-concept werd 7-kleuren SRS-fluorescentie tandembeeldvorming op een enkel eilandje gemakkelijk bereikt (figuur 4) met een goed contrast en correcte patronen. Doelen met een lage expressie, zoals de transcriptiefactor Pdx1, werden met voldoende contrast in beeld gebracht.
We toonden ook een achtkleurige SRS-fluorescentie tandembeeldvorming in PFA-gefixeerde muizen cerebellumweefsels (figuur 5). Via gevestigde biomarkers kunnen verschillende celtypen, zoals cerebellaire korrelneuronen (NeuN), Purkinje-neuronen (Calbindin), astrocyten (GFAP), oligodendrocyten (MBP) en GABAerge neuronen (GABA B2-receptor ) worden geïdentificeerd.
Figuur 1: Epr-SRS-microscopie voor sterk gemultiplexte eiwitbeeldvorming. (A) Energiediagram voor spontane Raman, niet-resonante SRS en elektronische pre-resonantie SRS (epr-SRS). De trillingsovergangssnelheid van chromoforen wordt in epr-SRS met maximaal 1013-voudig verhoogd. (B) Epitoop-gebaseerde immunobeeldvorming van α-tubuline werd aangetoond in COS-7-cellen gekleurd door ATTO740 met een hoog trillingscontrast door epr-SRS. Het epr-SRS-signaal verdwijnt volledig wanneer de golflengte van de pomplaser slechts 2 nm (rechts) uit-resonantie is. Schaalstaven, 20 μm. (C) Epr-SRS spectra van NHS ester-geconjugeerde MARS probes zoals vermeld in Aanvullend Materiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het ontwerp van de opstelling van de SRS-microscoop. (A) Schematisch diagram van de SRS-opstelling. EOM = elektro-optische modulator, M = spiegel, L = lens, DBS = dichroïsche bundelsplitser, DM = dichroïsche spiegel, OB = objectieflens, CO = condensor, F = filter, PD = fotodiode. (B) Dit paneel toont het laserexcitatiegedeelte. Tweekleurige straal van laseruitvoer wordt eerst gescheiden waarbij elke straal wordt gecollimeerd en uitgebreid en later gecombineerd en gericht in het microscooplichaam. (C) Dit paneel toont de verzonden verzameling met een condensor. (D) Dit paneel toont het SRS-detectiegedeelte. Fotodiode en filter zijn gemonteerd op afgeschermde doos met twee BNC vrouwelijke connectoren. Lagere BNC-connector is voor omgekeerde biasspanning en de hogere BNC-connector is voor stroomsignaaluitgang naar lock-in versterker beëindigd met 50 Ω. (E) Dit paneel laat zien hoe de Si-fotodiode in de afgeschermde doos is gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Raman dye imaging van verschillende eiwitmarkers via immunolabeling. (A) Immuno-eprSRS beeldvorming van α-tubuline in HeLa cellen. (B) Immuno-eprSRS beeldvorming van NeuN in PFA-gefixeerde hersenschors van muizen. (C) Immuno-eprSRS beeldvorming van Vimentin in menselijk nier FFPE weefsel. (D) Volume-gerenderde afbeelding vanMARS2145 gekleurd GFAP in 100-μm dik muizenhersenweefsel. De stapgrootte in z was 2 μm. (E) Volume-gerenderde afbeelding vanMARS2228 gekleurd NeuN in 40-μm dik muizenhersenweefsel. De stapgrootte in z was 1 μm. Schaalstaven, 20 μm in (A), 50 μm in (B-C), 30 μm in (D-E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van 7-kleuren tandem beeldvorming van hormonen en transcriptiefactoren op bevroren muizeneilandjesweefsel. Epr-SRS: Insuline (gedetecteerd door Cy5, β-cel marker, groen), Pdx1 (gedetecteerd door MARS2228, transcriptiefactor, rood), Glucagon (gedetecteerd door MARS2216, α-cel marker, geel), PP (gedetecteerd door MARS2147, PP-cel marker, blauw). Fluorescentie: Somatostatine (Alexa488, δ-cel marker, oranje), Nkx2.2 (Cy3, transcriptiefactor, magenta), DAPI (nucleus, donkerblauw). Schaalbalk, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van 8-kleuren tandem beeldvorming van celtype markers op PFA-vaste muis hersensectie. Fluorescentie: DNA (DAPI), GABA (γ-aminoboterzuur) B-receptor 2 (GABAerge neuronen, Alexa Fluor 488), neuronale kernen (NeuN; neuronen, Alexa Fluor 568) en Calbindin (Purkinje-neuronen, Alexa Fluor 647); epr-SRS: tarwekiem agglutinine (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), myeline basiseiwit (MBP; oligodendrocyten, MARS2176) en GFAP (astrocyten en neurale stamcellen, MARS2145). Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Gevalideerde antilichamen voor immuno-eprSRS. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend materiaal: Eigenschappen van 8 gebruikte NHS-ester-gefunctionaliseerde MARS-sondes. λabs en excitatiecoëfficiënten van MARS-kleurstoffen werden gemeten in DMSO-oplossing op UV-Vis spectrometer met behulp van 1-cm glazen cuvette als container. De absolute Raman-doorsneden van MARS-kleurstoffen werden bepaald in DMSO door het epr-SRS-signaal van MARS-kleurstoffen te vergelijken met de standaard C-O-stretchmodus (1030 cm-1) methanol. De absolute Raman-doorsnede voor de standaard C−O-stretchmodus (1030 cm-1) van methanol werd gerapporteerd als 2,1 x 10-30 cm2 bij 785 nm. Een doorsnede van 0,9 x 10-30 cm2 werd geschat onder 860-nm pompgolflengte door extrapolatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we het immuno-eprSRS-protocol dat breed toepasbaar is op veel voorkomende weefseltypen, waaronder vers geconserveerde muizenweefsels, FFPE menselijke weefsels en bevroren muizenweefsels. Immuno-eprSRS is gevalideerd voor een panel van epitopen in cellen en weefsels, zoals vermeld in tabel 1. Dit one-shot platform is met name geschikt voor toepassingen waar cyclische strategieën niet goed functioneren. Cyclische fluorescentie is bijvoorbeeld veeleisend voor dikke weefsels, omdat meerdere rondes van 3D-immunolabeling onpraktisch lang zijn17. Het is ook zeer waarschijnlijk dat registratiefouten worden geïntroduceerd als gevolg van niet-lineaire 3D-histologische veranderingen11,17. Immuno-eprSRS overwint praktische barrières van cyclische fluorescentie in een dergelijk scenario en biedt mogelijkheden om eiwitinteractienetwerken over een groot volumete onthullen 17.
De huidige multiplexiteit wordt voornamelijk beperkt door de beschikbaarheid van secundaire antilichamen. Terwijl we ons in dit protocol richtten op indirecte immunolabeling, waarbij MARS-sondes worden geconjugeerd aan secundaire antilichamen, zijn directe immunolabeling en lectinekleuring haalbaar17. Na meer primaire antilichaamvalidatie met Raman-kleurstoffen, worden 20 kanalen verwacht met de momenteel ontwikkelde Raman-kleurstoffen 13,18,24. Bovendien kan het afbeelden van zeer weinig overvloedige doelen een uitdaging zijn voor epr-SRS vanwege de enigszins gecompromitteerde gevoeligheid in vergelijking met het confocale fluorescentiesysteem. In dit opzicht raden we aan om relatief weinig voorkomende doelen toe te wijzen aan helderdere MARS-kleurstoffen en doelen met een lage expressie aan fluorescentiekanalen.
Een cruciaal aspect van het protocol is de toegankelijkheid van instrumenten en sondes. Instrumentatiegewijs is een SRS-microscoop over het algemeen samengesteld uit een tweekleurige laserbron met een optische modulator, een microscoop, een fotodiodedetector en een lock-in versterker voor demodulatie25. Elk onderdeel is commercieel verkrijgbaar met een iets hogere totale kosten dan een fluorescentiemicroscoop met twee fotonen. Een volledig geïntegreerde multimodale SRS/fluorescentie onderzoeksmicroscoop is gecommercialiseerd26 met behulp van een vergelijkbare picoseconde laser als hier voor SRS excitatie en continue golf (CW) laser sets voor fluorescentie. Dit systeem is gemakkelijk toepasbaar voor multiplex vibrationele beeldvorming in dagelijks biologisch onderzoek. Qua sondes zijn MARS-sondes nog niet gecommercialiseerd en vereisen ze enkele synthesemogelijkheden. Als alternatief kunnen veel commerciële verrode fluoroforen (zie Extended Data Table 1 in L. Wei et al. Nature 201713) worden gebruikt voor epr-SRS. Toch kan de multiplexiteit in het gedrang komen. Bovendien, omdat MARS-sondes van nature kleine organische moleculen zijn, is immuno-eprSRS vergelijkbaar met immunofluorescentie in termen van weefselkleuring. Daarom kan het archief van gevalideerde affiniteitsreagentia zoals antilichamen in immunofluorescentie gemakkelijk worden overgebracht naar immuno-eprSRS-toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Ruth A. Singer en Richard K.P. Benninger voor het verstrekken van alvleesklierweefsels van muizen. W.M. erkent steun van NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) en US Army (W911NF-19-1-0214).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
- Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
- Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657 (2018).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851 (2019).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982 (2013).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455 (2020).
- Wei, L., et al.
- Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
- Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
- Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
- Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
- Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518 (2021).
- Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003 (2019).
- Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115 (2022).
- Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
- Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
- Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537 (2018).
- Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).
