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Bioengineering

रमन रंजक के साथ अत्यधिक मल्टीप्लेक्स ऊतक इमेजिंग

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63547
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

Summary

इलेक्ट्रॉनिक पूर्व अनुनाद उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (epr-SRS) इंद्रधनुष की तरह रमन रंजक की इमेजिंग अत्यधिक multiplexed एपिटोप आधारित प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक नया मंच है. यहां, हम एंटीबॉडी तैयारी, ऊतक नमूना धुंधला, एसआरएस माइक्रोस्कोप असेंबली और ईपीआर-एसआरएस ऊतक इमेजिंग सहित एक व्यावहारिक मार्गदर्शिका प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

ऊतकों में विशिष्ट बायोमाकर्स के विशाल दायरे की कल्पना करना जटिल जैविक प्रणालियों के जटिल संगठनों की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसलिए, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की तेजी से सराहना की गई है। यहां, हम इलेक्ट्रॉनिक पूर्व-अनुनाद उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (ईपीआर-एसआरएस) इंद्रधनुष जैसे रमन रंजक के इमेजिंग के माध्यम से मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तुलनीय संवेदनशीलता के साथ विशिष्ट प्रोटीन के अत्यधिक-मल्टीप्लेक्स कंपन इमेजिंग के एक उभरते हुए मंच का वर्णन करते हैं। यह विधि पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस में वर्णक्रमीय-समाधान योग्य चैनलों की सीमा को दरकिनार करती है और उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ ऊतकों में कई मार्करों से पूछताछ करने के लिए एक-शॉट ऑप्टिकल दृष्टिकोण प्रदान करती है। यह आम तौर पर मानक ऊतक तैयारी के साथ संगत है, जिसमें पैराफॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड ऊतक, जमे हुए ऊतक, और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) मानव ऊतक शामिल हैं। हम इस मंच की परिकल्पना जैविक नमूनों के प्रोटीन इंटरैक्शन की एक और अधिक व्यापक तस्वीर प्रदान करेगा, विशेष रूप से मोटी बरकरार ऊतकों के लिए। यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी की तैयारी से ऊतक नमूना धुंधला करने के लिए, एसआरएस माइक्रोस्कोप असेंबली के लिए, ईपीआर-एसआरएस ऊतक इमेजिंग के लिए वर्कफ़्लो प्रदान करता है।

Introduction

जटिल ऊतक प्रणालियां अलग-अलग सेलुलर उप-आबादी से बनी होती हैं जिनके स्थानिक स्थान और इंटरैक्शन नेटवर्क उनके कार्यों औरशिथिलताओं 1,2 के साथ गहराई से जुड़े होते हैं। ऊतक वास्तुकला को प्रकट करने और इसकी जटिलता से पूछताछ करने के लिए, एकल-कोशिका संकल्प पर प्रोटीन के स्थानिक स्थानों का ज्ञान आवश्यक है। इसलिए, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन-इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की तेजी से सराहना की गई है और ऊतक जीव विज्ञान 3,4,5 का अध्ययन करने के लिए एक आधारशिला बन सकती है। वर्तमान आम मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग विधियों को दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। एक सीरियल इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग ऊतक धुंधला और इमेजिंग के कई दौर पर निर्भर करता है, और दूसरा इमेजिंग मास साइटोमेट्री है जो भारी धातु टैग किए गए एंटीबॉडी 6,7,8,9,10,11,12 के साथ युग्मित है।

यहां, मल्टीप्लेक्स्ड एंटीबॉडी-आधारित प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक रणनीति पेश की गई है। प्रचलित प्रतिदीप्ति इमेजिंग रूपरेखा के विपरीत, जो केवल व्यापक उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (आधे अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) ~ 500 सेमी -1 पर पूर्ण चौड़ाई) के कारण एक साथ 4-5 चैनलों की कल्पना कर सकता है, रमन माइक्रोस्कोपी बहुत संकीर्ण वर्णक्रमीय लाइनचौड़ाई (एफडब्ल्यूएचएम ~ 10 सेमी -1) प्रदर्शित करता है और इसलिए स्केलेबल मल्टीप्लेक्सिटी प्रदान करता है। हाल ही में, संकीर्ण स्पेक्ट्रम का उपयोग करके, रमन माइक्रोस्कोपी की एक उपन्यास योजना जिसका नाम इलेक्ट्रॉनिक प्री-रेजोनेंस प्रेरित रमन स्कैटरिंग (ईपीआर-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी है, जो मल्टीप्लेक्स इमेजिंग13 के लिए एक शक्तिशाली रणनीति प्रदान करता है। रमन रंजक के इलेक्ट्रॉनिक रूप से युग्मित कंपन मोड की जांच करके, ईपीआर-एसआरएस रमन क्रॉस-सेक्शन पर 1013-गुना का एक कठोर वृद्धि प्रभाव प्राप्त करता है और पारंपरिक रमन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) 13,14,15 की संवेदनशीलता बाधा को दूर करता है। नतीजतन, ईपीआर-एसआरएस की पहचान सीमा को उप-μM पर धकेल दिया गया है, जो रमन को13,16 कोशिकाओं के अंदर विशिष्ट प्रोटीन और ऑर्गेनेल जैसे दिलचस्प आणविक मार्करों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से, रमन डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं और ऊतकों में विशिष्ट प्रोटीन की ईपीआर-एसआरएस इमेजिंग (जिसे इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस कहा जाता है) को मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 1 बी) 13,17 के लिए तुलनीय संवेदनशीलता के साथ प्रदर्शित किया गया था। केवल 2 एनएम द्वारा पंप तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग करके, ईपीआर-एसआरएस सिग्नल पूरी तरह से बंद हो जाएगा (चित्रा 1 बी), जो उच्च कंपन विपरीत दिखाता है।

जांच पक्ष पर, इंद्रधनुष की तरह रमन जांच का एक सेट मैनहट्टन रमन प्रकीर्णन (MARS) रंग कहा जाता है एंटीबॉडी संयुग्मन13,18,19,20 के लिए विकसित किया गया है। इस अद्वितीय रमन पैलेट में π-संयुग्मित ट्रिपल बॉन्ड (पूरक सामग्री) वाले उपन्यास रंजक होते हैं, जिनमें से प्रत्येक बायोऑर्थोगोनल रमन वर्णक्रमीय रेंज (चित्रा 1 सी) में एक एकल और संकीर्ण ईपीआर-एसआरएस चोटी प्रदर्शित करता है। कोर क्रोमोफोर की संरचना को संशोधित करके और आइसोटोपिक रूप से ट्रिपल बॉन्ड (पूरक सामग्री) के दोनों परमाणुओं को संपादित करके, वर्णक्रमीय रूप से अलग किए गए रमन जांच विकसित किए गए हैं। स्केलेबल मल्टीप्लेक्सिटी का लाभ उठाते हुए, ईपीआर-एसआरएस माइक्रोस्कोपी मार्स डाई पैलेट के साथ मिलकर कोशिकाओं और ऊतकों में एक शॉट मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग के लिए एक ऑप्टिकल रणनीति प्रदान करता है।

Immuno-eprSRS अद्वितीय शक्तियों के साथ वर्तमान मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग विधियों के लिए एक वैकल्पिक रणनीति प्रदान करता है। चक्रीय धुंधला, इमेजिंग और सिग्नल हटाने के साथ प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण की तुलना में, यह रमन-आधारित प्लेटफ़ॉर्म एकल-दौर धुंधला और इमेजिंग सुनिश्चित करता है। इसलिए, यह चक्रीय प्रक्रियाओं में व्यावहारिक जटिलता को दरकिनार करता है और काफी हद तक प्रोटोकॉल को सरल बनाता है, इसलिए मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग के नए क्षेत्रों को खोलता है। उदाहरण के लिए, एक रमन-डाई-सिलवाया ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, इम्यूनो-eprSRS को मोटे बरकरार ऊतकों में अत्यधिक मल्टीप्लेक्स प्रोटीन मैपिंग के लिए तीन आयामों तक बढ़ाया गयाहै। मिलीमीटर-मोटी माउस मस्तिष्क के ऊतकों के साथ 10 से अधिक प्रोटीनलक्ष्यों की कल्पना की गई थी। हाल ही में, एक अनुकूलित बायोमोलेक्यूल-प्रतिधारण विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM) प्रोटोकॉल21 के साथ इम्युनो-eprSRS युग्मन, कई लक्ष्यों के एक-शॉट नैनोस्केल इमेजिंग को भी प्रदर्शित किया गया है। इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोस्कोपी 4,9 की तुलना में, ईपीआर-एसआरएस गैर-विनाशकारी है और इसमें आंतरिक रूप से ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता है। इसके अलावा, ईपीआर-एसआरएस ऊतक स्कैनिंग पर अधिक समय-कुशल है। आमतौर पर, 0.5 μm के पिक्सेल आकार के साथ0.25 मिमी 2 का एक ऊतक क्षेत्र एक एकल epr-SRS चैनल के लिए छवि के लिए केवल कुछ मिनट लेता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 में चार एसआरएस चैनलों के साथ-साथ चार प्रतिदीप्ति चैनलों का कुल इमेजिंग समय लगभग 10 मिनट है।

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Protocol

प्रोटोकॉल कोलंबिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल (एसी-एएबीडी 1552) के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. रमन-डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी की तैयारी

  1. पीबीएस बफर में ~ 0.1 M NaHCO3 के रूप में संयुग्मन बफर तैयार करें, pH = 8.3, 4 °C पर स्टोर करें।
  2. एन-हाइड्रॉक्सीसुसिनिमिडी (एनएचएस) एस्टर-फंक्टेड मार्स प्रोब (पूरक सामग्री) समाधान को निर्जल डीएमएसओ में 3 एमएम के रूप में तैयार करें। MARS जांच के संश्लेषण को13,17,18 पूर्व रिपोर्टों के लिए संदर्भित किया जा सकता है।
    नोट: भंडारण प्रयोजनों के लिए, डाई एनएचएस एस्टर समाधान को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए।
  3. संयुग्मन बफर में एंटीबॉडी ठोस पदार्थों को 2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में भंग करें। एंटीबॉडी के लिए जो अन्य बफर में भंग हो जाते हैं, उन्हें संयुग्मन बफर में केंद्रापसारक फिल्टर के साथ 1-2 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए विनिमय करें।
    नोट: अत्यधिक क्रॉस-अधिशोषित द्वितीयक एंटीबॉडी को क्रॉस-प्रजाति प्रतिक्रियाशीलता को कम करने के लिए मल्टीप्लेक्स स्टेनिंग के लिए पसंद किया जाता है। उपयोग किए जाने वाले द्वितीयक एंटीबॉडी तालिका 1 और सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
  4. संयुग्मन प्रतिक्रिया निष्पादित करें।
    1. माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, एक ग्लास शीशी में धीरे-धीरे सरगर्मी के साथ एंटीबॉडी समाधान में डाई समाधान की 15 गुना दाढ़ अतिरिक्त जोड़ें। उदाहरण के लिए, 0.5 mL 2 mg/mL एंटीबॉडी समाधान में, 35 μL 3 mM डाई समाधान जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें। प्रतिक्रिया को प्रकाश से बचाएं।
  5. शोधन।
    1. पीबीएस बफर में जेल निस्पंदन राल (सामग्री की तालिका) के घोल तैयार करें, 1.5.2-1.5.4 चरणों का पालन करते हुए।
    2. एक 50-एमएल ट्यूब के अंदर पीबीएस बफर के 40 मिलीलीटर में जेल निस्पंदन राल पाउडर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. समाधान को 1 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    4. Supernatant decant और फिर से 40 mL करने के लिए PBS जोड़ें. घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. 10-15 सेमी की ऊंचाई के लिए घोल समाधान के साथ आकार बहिष्करण स्तंभ (1-सेमी व्यास, गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह कॉलम) पैक करें।
    6. कुल्ला और आगे राल पैक करने के लिए PBS बफर के ~ 10 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धोना।
    7. संयुग्मन प्रतिक्रिया मिश्रण (~ 0.5 mL) स्तंभ के लिए pipet. सभी प्रतिक्रिया मिश्रण लोड किया जाता है जब तुरंत क्षालन बफर के रूप में PBS बफर के 1 mL जोड़ें। लगातार स्तंभ के लिए क्षालन बफर (PBS) फिर से भरना.
    8. स्तंभ पर रंग को देखकर संयुग्मी समाधान के eluate ले लीजिए (MARS रंगों में नीले रंग के लिए हल्के हरे रंग होते हैं) या 280 एनएम (A280) पर अवशोषण को मापने के लिए।
  6. एक केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ 1-2 मिलीग्राम / एमएल के लिए एकत्र समाधान को केंद्रित करें।
  7. नैनो प्लेट रीडर के साथ संयुग्मित समाधान के पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विज़) स्पेक्ट्रम को मापकर एकाग्रता और लेबलिंग की औसत डिग्री (डीओएल, डाई-टू-प्रोटीन अनुपात) निर्धारित करें।
    नोट: अनुपूरक सामग्री गणना के लिए मार्स-डाई एनएचएस-एस्टर के गुण प्रदान करती है। द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए सामान्य डीओएल लगभग 3 है।

2. ऊतक नमूना तैयारी

  1. पैराफॉर्मेल्डिहाइड माउस मस्तिष्क के ऊतकों को तय करता है।
    1. Isoflurane के साथ चूहों (C57BL / 6J, महिला, 25 डी प्रसवोत्तर) को एनेस्थेटिक करें। एक पैर की अंगुली चुटकी परीक्षण के साथ उचित anesthetization का आकलन करें।
    2. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा चूहों को मार डालो। पीबीएस ट्रांसकार्डियल में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ चूहों को तुरंत परफ्यूज करें।
    3. माउस मस्तिष्क ले लीजिए, 2.1.4-2.1.5 चरणों का पालन करते हुए
    4. मस्तिष्क के तने से ऊपर की ओर काटें और सैगिटल सीवन के साथ। खोपड़ी के दो हिस्सों को साइड में दूर छील लें और चिमटी के साथ मस्तिष्क को स्कूप करें।
    5. पीबीएस में 4% पीएफए में एकत्र मस्तिष्क को 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें। फिर, अतिरिक्त पीएफए को हटाने के लिए 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस बफर में मस्तिष्क को धोएं।
    6. एक ढीले ढक्कन के साथ, एक बीकर में 7% (डब्ल्यू / वी) की अंतिम एकाग्रता के लिए पानी में ठोस एगारोज़ रखें। एक ग्लास सरगर्मी रॉड के साथ समाधान हिलाओ। घोल को माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए।
    7. agarose को 45-55 °C तक ठंडा करने की अनुमति दें।
    8. तरल agarose एक छोटे से कक्ष में डालो, तो पीबीएस से तरल agarose करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण और मस्तिष्क एम्बेड करने के लिए एक spatula के साथ यह उन्मुख. ऊतक-agarose ब्लॉक के सख्त होने की प्रतीक्षा करें।
    9. एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके ऊतक-एग्रोज को 40-μm-मोटी कोरोनल स्लाइस में अनुभाग करें।
    10. निम्नलिखित धुंधला के लिए ऊतक को 4-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें। एक चिमटी के साथ agarose निकालें. पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ ऊतक को धोएं, तीन बार।
  2. फिक्स्ड जमे हुए माउस अग्न्याशय ऊतकों.
    1. 16-20 घंटे के लिए रॉकिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 4% पीएफए में माउस अग्नाशय को ठीक करें।
    2. पीएफए को हटाने के लिए पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 1 मिलीलीटर में नमूने को तीन बार धोएं।
    3. इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक ब्लॉकों में नमूना (~ 0.3-0.5 सेमी आकार में) एम्बेड करें। एक प्लास्टिक क्रायोमोल्ड में OCT की 2 बूँदें रखो। ऊतक को सही अभिविन्यास में रखें और ऊतकों के शीर्ष पर ओसीटी डालें जब तक कि ऊतक में से कोई भी उजागर न हो जाए।
    4. अग्नाशय को 8-μm-मोटी स्लाइस पर अनुभाग करें और उन्हें ऊतक बाध्यकारी ग्लास स्लाइड पर स्थिर करें, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
    5. धुंधला करने से पहले, नमूने को आरटी में संतुलित करें। OCT ब्लॉकों को हटाने के लिए PBS के साथ ऊतक को धोएं।
  3. एफएफपीई नमूने।
    1. 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर FFPE ऊतक स्लाइड सेंकना।
    2. Deparaffinization और rehydration: हल्के झटकों के साथ हर बार 3 मिनट के लिए आरटी में एक 50-mL ट्यूब में निम्नलिखित समाधानों में अनुक्रमिक रूप से नमूनों को रखें:
      जाइलीन दो बार,
      इथेनॉल दो बार,
      विआयनीकृत पानी में 95% (vol / vol) इथेनॉल दो बार,
      विआयनीकृत पानी में 70% (vol / vol) इथेनॉल दो बार,
      50% (vol / vol) एक बार विआयनीकृत पानी में इथेनॉल,
      विआयनीकृत पानी एक बार।
    3. एक ग्लास जार में 100 डिग्री सेल्सियस पर 20 mM सोडियम साइट्रेट (pH 8.0) में नमूने को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक समाधान में डूबे हुए हैं।
    4. जार को 45 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    5. 5 मिनट के लिए आरटी पर विआयनीकृत पानी के साथ नमूने को धोएं।

3. ऊतक immuno-eprSRS धुंधला

  1. स्लाइड पर ऊतक वर्गों के चारों ओर एक सीमा खींचने के लिए एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें।
    नोट:: स्लाइड स्टेनिंग जार स्लाइड पर ऊतक के निम्नलिखित इनक्यूबेशन चरणों के लिए उपयोग किया जाता है। फ्लोटिंग ऊतक (40-μm-मोटी माउस मस्तिष्क वर्गों) अच्छी तरह से प्लेटों में दाग रहे हैं।
  2. 10 मिनट के लिए 0.3-0.5% PBST (पीबीएस में Triton X-100) के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
  3. 30 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने वाले (5% गधा सीरम, पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स -100) के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
  4. प्राथमिक धुंधला समाधान तैयार करें: वांछित सांद्रता पर धुंधला बफर (2% गधा सीरम, पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स -100) के 200-500 μL में सभी प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 5 मिनट के लिए 13,000 x g पर प्राथमिक धुंधला समाधान सेंट्रीफ्यूज। केवल supernatant का उपयोग करें यदि अवक्षेप रूप।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में ऊतक को 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: स्लाइड पर ऊतक वर्गों को धुंधला करने के लिए, नमी बनाए रखने के लिए एक गीले पोंछे के साथ एक धुंधला बॉक्स में नमूना डालें।
  6. 5 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी पर 0.3-0.5% PBST के साथ स्लाइड तीन बार धोएं। फ्लोटिंग ऊतकों के लिए 1 एमएल पीबीएसटी का उपयोग करें। स्लाइड पर ऊतकों के लिए, स्लाइड को स्लाइड स्टेनिंग जार में धोएं और सुनिश्चित करें कि ऊतक सभी समाधान में डूबे हुए हैं।
  7. 30 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 200-500 μL में ऊतक को इनक्यूबेट करें।
  8. द्वितीयक धुंधला समाधान तैयार करें: वांछित सांद्रता (आमतौर पर 10 μg / mL) के साथ धुंधला बफर के 200-500 μL में सभी माध्यमिक एंटीबॉडी (और लेक्टिन यदि आवश्यक हो) जोड़ें। 5 मिनट के लिए 13,000 x g पर द्वितीयक धुंधला समाधान सेंट्रीफ्यूज। केवल supernatant का उपयोग करें यदि अवक्षेप रूप।
  9. 1-2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 200-500 μL में ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
  10. प्रत्येक 5 मिनट के लिए आरटी पर 0.3-0.5% PBST के साथ स्लाइड को दो बार धोएं।
  11. 30 मिनट के लिए DAPI समाधान के 200-500 μL के साथ इनक्यूबेट करें।
  12. 5 मिनट प्रत्येक के लिए आरटी पर पीबीएस के साथ स्लाइड को तीन बार धोएं।
  13. फ्लोटिंग ऊतक वर्गों के लिए, उन्हें ग्लास-ड्रॉपिंग पिपेट के साथ ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें। एक ऊतक ब्रश के साथ ऊतक को फैलाएं और यदि आवश्यक हो तो पोंछे के साथ आसपास की सफाई करें।
  14. एक ग्लास कवरस्लिप के साथ एंटीफेड अभिकर्मकों की एक बूंद में ऊतक माउंट करें और इसे नेल पॉलिश के साथ सुरक्षित करें।

4. एसआरएस माइक्रोस्कोप असेंबली

नोट: एक वाणिज्यिक confocal प्रतिदीप्ति प्रणाली अग्रानुक्रम SRS-प्रतिदीप्ति इमेजिंग में प्रयोग किया जाता है। अधिक विवरण एक पूर्व रिपोर्ट17 में पाया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल संकीर्णबैंड उत्तेजना का उपयोग करके एसआरएस इमेजिंग पक्ष पर ध्यान केंद्रित करेगा।

  1. तापमान नियंत्रण के साथ एक कमरे में एक कंपन-पृथक ऑप्टिकल टेबल तैयार करें।
  2. ऑप्टिकल टेबल (चित्रा 2 ए) पर एक सिंक्रनाइज़ डुअल-लेजर सिस्टम (पंप और स्टोक्स) को एक चिलर से जुड़े के साथ रखें।
    नोट: दोहरी लेजर प्रणाली में मौलिक लेजर 6-ps पल्स चौड़ाई और 80-मेगाहर्ट्ज पुनरावृत्ति दर के साथ 1064 एनएम पर एक आउटपुट पल्स ट्रेन प्रदान करता है। स्टोक्स बीम मौलिक लेजर से है। स्टोक्स बीम की तीव्रता को 90% से अधिक की मॉडुलन गहराई के साथ 8 मेगाहर्ट्ज पर एक अंतर्निहित इलेक्ट्रो-ऑप्टिक आयाम मॉड्यूलेटर (ईओएम) द्वारा साइनसोइड रूप से संशोधित किया गया था। मौलिक लेजर का दूसरा हिस्सा आवृत्ति-दोगुना 532 एनएम तक है, जिसका उपयोग 5-6 पीएस पल्स चौड़ाई के साथ एक मोड-लॉक पल्स ट्रेन का उत्पादन करने के लिए एक पिकोसेकंड ऑप्टिकल पैरामीट्रिक ऑसिलेटर (ओपीओ) को तुल्यकालिक रूप से बीज करने के लिए किया जाता है (ओपीओ के आइडलर बीम को इंटरफेरोमेट्रिक फिल्टर के साथ अवरुद्ध किया जाता है)। OPO का आउटपुट तरंग दैर्ध्य 720-950 एनएम से अक्षम है, जो पंप बीम के रूप में कार्य करता है।
  3. दर्पण (तरंग दैर्ध्य रेंज: 750-1100 एनएम), डिक्रोइक बीम स्प्लिटर्स (डीबीएस, 980 एनएम लंबे समय तक पास फिल्टर, आयताकार), और लेंस (एक्रोमैटिक, 650-1050 एनएम के लिए एआर कोटिंग) को अपने संबंधित माउंट पर माउंट करें। दर्पण और dichroic बीम splitters के लिए बहुत stablekinematic दर्पण mounts का उपयोग करें।
  4. लेजर आउटपुट की ऊंचाई और पंप और स्टोक्स बीम के बीम आकार को मापें। दर्पण और लेंस की ऊंचाई को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रकाश सभी ऑप्टिकल तत्वों के केंद्र को हिट करेगा।
  5. ऑप्टिकल टेबल पर दर्पण M1 रखें और इसे लेजर आउटपुट (चित्रा 2B) के लिए ~ 45 ° बनाएं। टिप और झुकाव समायोजन करने के लिए कीनेमेटिक माउंट पर knobs का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रकाश मेज की लंबाई और मेज के संबंध में एक सीधी रेखा के साथ एक ही ऊंचाई पर यात्रा करता है।
  6. रखें और dichroic बीम splitters (980 एनएम लंबे पास फिल्टर) और दर्पण पंप और स्टोक्स बीम (चित्रा 2A-B) को विभाजित करने के लिए संरेखित करें।
  7. बीम पथों में से प्रत्येक पर लेंस जोड़े (L1, L2, और L3, L4) को रखें और संरेखित करें ताकि बीम को कॉलिमेट किया जा सके और उद्देश्य के पीछे के पुतली से मेल खाने के लिए बीम व्यास का विस्तार किया जा सके (चित्रा 2A-B)।
  8. माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 सी) में संयुक्त लेजर बीम को संरेखित करने के लिए एम 7 और एम 8 दर्पण का उपयोग करें। पहले माइक्रोस्कोप में एक बीम को संरेखित करें और दो बीम के स्थानिक ओवरलैप को सुनिश्चित करने के लिए दूसरे बीम पर दर्पण जोड़े का उपयोग करें।
  9. डिटेक्शन भाग सेट करें.
    1. नमूनों (चित्रा 2 सी) के माध्यम से गुजरने के बाद आगे जाने वाले पंप और स्टोक्स बीम को इकट्ठा करने के लिए एक अवरक्त-लेपित तेल कंडेनसर (1.4-एनए) पर रखें।
    2. BNC connectors (चित्रा 2E) के साथ एक परिरक्षित बॉक्स पर एक बड़े क्षेत्र Si photodiode माउंट करें। इसकी संतृप्ति थ्रेशोल्ड और प्रतिक्रिया बैंडविड्थ को बढ़ाने के लिए घुड़सवार फोटोडायोड में 64-V डीसी बिजली की आपूर्ति जोड़ें।
    3. 2-इंच के दर्पण के साथ आगे की ओर जाने वाले प्रकाश को प्रतिबिंबित करें। मॉड्यूलेटिंग स्टोक्स बीम (चित्रा 2 डी) को अवरुद्ध करने के लिए एक ऑप्टिकल फ़िल्टर के बाद फोटोडायोड पर प्रकाश को फिर से केंद्रित करें।
    4. संकेत demodulation के लिए 50 के साथ समाप्त एक तेजी से लॉक-इन एम्पलीफायर के लिए photodiode के आउटपुट वर्तमान भेजें। संदर्भ संकेत के रूप में लॉक-इन एम्पलीफायर को 8-मेगाहर्ट्ज ट्रिगर भेजें।
    5. माइक्रोस्कोप के एनालॉग इंटरफ़ेस बॉक्स में लॉक-इन एम्पलीफायर के इन-फेज एक्स-घटक को भेजें।
  10. माइक्रोस्कोप पर शुद्ध डी2ओ तरल के एसआरएस सिग्नल को मापने के द्वारा अंतर्निहित मोटरचालित देरी चरण के साथ अस्थायी ओवरलैप को अनुकूलित करें।

5. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. अनुक्रमिक पंप तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग के साथ बहु-चैनल epr-SRS इमेजिंग प्रदर्शन करें।
    1. लेजर नियंत्रण कक्ष पर पीपंप = 10-40 mW और Pस्टोक्स = 40-80 mW पर लेजर शक्ति सेट करें।
    2. पिक्सेल रहने का समय 2-4 μs पर सेट करें और माइक्रोस्कोपी सॉफ़्टवेयर पर आमतौर पर 10-20 फ़्रेम औसत से एकाधिक फ़्रेम का उपयोग करें.
      नोट: उच्च लेजर शक्ति (पीपंप> 40 mW, पीस्टोक्स> 80 mW) और छोटे पिक्सेल आकार (<0.2 μm) के एक संयुक्त उपयोग से बचें, जो संभवतः मल्टीफोटन उत्तेजना के कारण रमन रंजक के 'ब्लीचिंग प्रभाव' का कारण बनता है।
    3. लॉक-इन एम्पलीफायर के समय स्थिरांक को पिक्सेल रहने के समय के आधे हिस्से पर सेट करें।
  2. रैखिक वर्णक्रमीय unmixing.
    नोट: epr-SRS पूरे एकाग्रता सीमा पर एक सख्त रैखिक संकेत-से-एकाग्रता निर्भरता का पालन करता है; इस प्रकार, रैखिक वर्णक्रमीय unmixing चैनलों के बीच किसी भी संभावित क्रॉस-वार्ता को हटाने के लिए प्रभावी है। एन मार्स जांच के साथ एन-चैनल ईपीआर-एसआरएस माप के लिए, मापा गया संकेत (एस) को एस = एमसी के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, जहां सी मार्स प्रोब सांद्रता है, और एम एक एन एक्स एन मैट्रिक्स है जो मार्स जांच के रमन क्रॉस-सेक्शन द्वारा निर्धारित किया जाता है।
    1. विभिन्न MARS जांच के साथ लेबल किए गए एकल-रंग immuno-eprSRS नमूनों पर मैट्रिक्स एम को मापें।
    2. समीकरण C = M−1· का प्रयोग करें एस मल्टीप्लेक्स नमूना संकेत माप एस के साथ MARS जांच की एकाग्रता मैट्रिक्स निर्धारित करने के लिए एस।

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Representative Results

चित्रा 3 निश्चित कोशिकाओं (चित्रा 3 ए), पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) -निश्चित माउस ऊतकों (चित्रा 3 बी), और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) मानव नमूनों (चित्रा 3 सी) सहित विभिन्न नमूनों में ईपीआर-एसआरएस की उदाहरण छवियों को दर्शाता है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन विवर्तन-सीमित है, विशिष्ट पार्श्व रिज़ॉल्यूशन ~ 300 एनएम है, और अक्षीय रिज़ॉल्यूशन उत्तेजना के लिए निकट-अवरक्त प्रकाश का उपयोग करके 1-2 μm है। नतीजतन, हेला कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिकाएं जैसी ठीक उपकोशिकीय संरचनाओं को α-ट्यूबुलिन (चित्रा 3 ए) के इम्यूनो-ईपीआरएस इमेजिंग के साथ ईमानदारी से प्रकट किया गया था। इसके अलावा, ईपीआर-एसआरएस आम तौर पर एफएफपीई ऊतकों (चित्रा 3 सी) के साथ संगत है, जो नैदानिक निदान और पैथोलॉजी अनुसंधान के लिए बायोप्सी नमूनों का एक सामान्य रूप है। दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के समान, एक nonlinear प्रक्रिया के रूप में, epr-SRS में उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 3D-E) के साथ तीन-आयामी पैटर्न की कल्पना करने के लिए ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता है।

हमने पहली बार अग्न्याशय में लैंगरहैंस के माउस आइलेट्स के निश्चित जमे हुए ऊतक नमूनों पर ईपीआर-एसआरएस की मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग उपयोगिता का प्रदर्शन किया। सेल-प्रकार के वर्गीकरण (β-कोशिकाओं और गैर-β-कोशिकाओं (α-, δ-कोशिकाओं)) के लिए हार्मोन अभिव्यक्ति (जैसे, इंसुलिन, ग्लूकोज एगोनिस्ट (ग्लूकागन), अग्नाशयी पॉलीपेप्टाइड (पीपी), और सोमाटोस्टैटिन) और प्रतिलेखन कारकों सहित कई इच्छुक लक्ष्यों का चयन किया जाता है, जो β-सेल विषमता23 से संबंधित होने के लिए जाने जाते हैं। ध्यान दें, चूंकि प्रतिदीप्ति का पता लगाना एसआरएस का पता लगाने के लिए ओर्थोगोनल है, इसलिए ईपीआर-एसआरएस पूरी तरह से कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति और दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति के साथ संगत है। एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट के रूप में, एक एकल आइलेट पर 7-रंग एसआरएस-प्रतिदीप्ति अग्रानुक्रम इमेजिंग को अच्छे विपरीत और सही पैटर्न के साथ आसानी से प्राप्त किया गया था (चित्रा 4)। प्रतिलेखन कारक Pdx1 जैसे कम अभिव्यक्ति लक्ष्यों को पर्याप्त विपरीत के साथ चित्रित किया गया था।

हमने पीएफए-फिक्स्ड माउस सेरिबैलम ऊतकों (चित्रा 5) में आठ-रंग एसआरएस-प्रतिदीप्ति अग्रानुक्रम इमेजिंग का भी प्रदर्शन किया। स्थापित बायोमार्कर के माध्यम से, विभिन्न सेल प्रकारों, जैसे कि सेरेबेलर ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (न्यूएन), पुरकिंजे न्यूरॉन्स (कैलबिंदिन), एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी), ओलिगोडेंड्रोसाइट्स (एमबीपी), और जीएबीएर्जिक न्यूरॉन्स (गाबा बी2 रिसेप्टर) की पहचान की जा सकती है।

Figure 1
चित्र1: अत्यधिक बहुसंकेतित प्रोटीन इमेजिंग के लिए Epr-SRS माइक्रोस्कोपी. (A) सहज रमन, गैर-अनुनादी SRS, और इलेक्ट्रॉनिक पूर्व-अनुनादी SRS (epr-SRS) के लिए ऊर्जा आरेख। क्रोमोफोर की कंपन संक्रमण दर को ईपीआर-एसआरएस में 1013 गुना तक बढ़ाया जाएगा। (बी) α-ट्यूबुलिन के एपिटोप-आधारित इम्यूनो-इमेजिंग को ईपीआर-एसआरएस द्वारा उच्च कंपन कंट्रास्ट के साथ एटीटीओ 740 द्वारा दागी गई सीओएस -7 कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया था। ईपीआर-एसआरएस सिग्नल पूरी तरह से गायब हो जाता है जब पंप लेजर तरंग दैर्ध्य केवल 2 एनएम (दाएं) द्वारा ऑफ-अनुनाद होता है। स्केल सलाखों, 20 μm. (C) पूरक सामग्री में सूचीबद्ध के रूप में NHS एस्टर संयुग्मित MARS जांच के Epr-SRS स्पेक्ट्रा. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: SRS माइक्रोस्कोप सेट-अप का डिज़ाइन. (A) SRS सेट-अप का योजनाबद्ध आरेख. EOM = इलेक्ट्रो-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर, M = दर्पण, L = लेंस, DBS = dichroic बीम विभाजक, DM = dichroic दर्पण, OB = उद्देश्य लेंस, CO = संघनित्र, F = फ़िल्टर, PD = photodiode. (बी) यह पैनल लेजर उत्तेजना भाग को दर्शाता है। लेजर आउटपुट से दोहरे रंग की बीम को पहले प्रत्येक बीम के साथ अलग किया जाता है और विस्तारित किया जाता है और बाद में संयुक्त और माइक्रोस्कोप बॉडी में निर्देशित किया जाता है। (C) यह पैनल एक संघनित्र के साथ संचरित संग्रह को दर्शाता है। (डी) यह पैनल एसआरएस डिटेक्शन भाग को दर्शाता है। फोटोडायोड और फ़िल्टर दो बीएनसी महिला कनेक्टर्स के साथ परिरक्षित बॉक्स में लगाए जाते हैं। लोअर BNC कनेक्टर रिवर्स बायस वोल्टेज के लिए है, और उच्च BNC कनेक्टर वर्तमान सिग्नल आउटपुट के लिए 50 Ω के साथ समाप्त एम्पलीफायर लॉक-इन करने के लिए है। (E) यह पैनल दिखाता है कि Si photodiode को परिरक्षित बॉक्स के अंदर कैसे रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इम्युनोलेबलिंग के माध्यम से अलग-अलग प्रोटीन मार्करों की रमन डाई इमेजिंग( ए) हेला कोशिकाओं में α-ट्यूबुलिन की इम्युनो-ईपीआरएसआरएस इमेजिंग। (बी) पीएफए-फिक्स्ड माउस मस्तिष्क प्रांतस्था में न्यूएन की इम्यूनो-ईपीआरएसआर इमेजिंग। (सी) मानव गुर्दे एफएफपीई ऊतक में विमेंटिन की इम्यूनो-ईपीआरएस इमेजिंग। (डी) 100-μm मोटी माउस मस्तिष्क ऊतक मेंMARS2145 दाग GFAP की मात्रा-रेंडर छवि। z में चरण का आकार 2 μm था। (E) 40-μm मोटे माउस मस्तिष्क ऊतक मेंMARS2228 सना हुआ NeuN की वॉल्यूम-रेंडर छवि। z में चरण का आकार 1 μm था। स्केल सलाखों, (ए) में 20 μm, (B-C) में 50 μm, (D-E) में 30 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जमे हुए माउस आइलेट ऊतक पर हार्मोन और प्रतिलेखन कारकों के 7-रंग अग्रानुक्रम इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम। Epr-SRS: इंसुलिन (Cy5, β-सेल मार्कर, हरे रंग द्वारा पता लगाया गया), Pdx1 (MARS2228, प्रतिलेखन कारक, लाल द्वारा पता लगाया गया), ग्लूकागन (MARS2216, α-सेल मार्कर, पीला द्वारा पता लगाया गया), पीपी (MARS2147, पीपी-सेल मार्कर, नीले द्वारा पता लगाया गया)। प्रतिदीप्ति: Somatostatin (Alexa488, δ सेल मार्कर, नारंगी), Nkx2.2 (Cy3, प्रतिलेखन कारक, मैजेंटा), DAPI (नाभिक, गहरा नीला). स्केल बार, 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पीएफए-फिक्स्ड माउस मस्तिष्क अनुभाग पर सेल प्रकार मार्करों के 8-रंग अग्रानुक्रम इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम। प्रतिदीप्ति: डीएनए (DAPI), GABA (γ-aminobutyric एसिड) बी रिसेप्टर 2 (GABaergic न्यूरॉन्स, एलेक्सा Fluor 488), न्यूरोनल नाभिक (NeuN; न्यूरॉन्स, एलेक्सा फ्लोर 568) और Calbindin (Purkinje न्यूरॉन्स, एलेक्सा फ्लोर 647); epr-SRS: गेहूं रोगाणु agglutinin (WGA; MARS2228), Vimentin (MARS2200), माइलिन मूल प्रोटीन (MBP; oligodendrocytes, MARS2176) और GFAP (एस्ट्रोसाइट्स और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, MARS2145)। स्केल बार, 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: immuno-eprSRS के लिए मान्य एंटीबॉडी। अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक सामग्री: 8 के गुण एनएचएस-एस्टर-कार्यात्मक मार्स जांच का उपयोग करते हैं। MARS रंजक केabs और उत्तेजना गुणांक को कंटेनर के रूप में 1-सेमी ग्लास क्यूवेट का उपयोग करके यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोमीटर पर DMSO समाधान में मापा गया था। MARS रंजक के निरपेक्ष रमन क्रॉस-सेक्शन को मेथनॉल के मानक C-O खिंचाव मोड (1030 सेमी-1) के साथ MARS रंजक के epr-SRS संकेत की तुलना करके DMSO में निर्धारित किया गया था। मेथनॉल के मानक सी-ओ खिंचाव मोड (1030 सेमी-1) के लिए पूर्ण रमन क्रॉस-सेक्शन को 785 एनएम पर 2.1 x 10-30 सेमी2 के रूप में रिपोर्ट किया गया था। एक्सट्रपोलेशन द्वारा 860-एनएम पंप तरंग दैर्ध्य के तहत 0.9 x 10-30 सेमी2 के क्रॉस-सेक्शन का अनुमान लगाया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मोटे तौर पर सामान्य ऊतक प्रकारों पर लागू होता है, जिसमें ताजा संरक्षित माउस ऊतक, एफएफपीई मानव ऊतक और जमे हुए माउस ऊतक शामिल हैं। इम्यूनो-eprSRS को कोशिकाओं और ऊतकों में एपिटोप के एक पैनल के लिए मान्य किया गया है, जैसा कि तालिका 1 में सूचीबद्ध है। यह एक-शॉट प्लेटफ़ॉर्म उन अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जहां चक्रीय रणनीतियां अच्छी तरह से काम नहीं करती हैं। उदाहरण के लिए, चक्रीय प्रतिदीप्ति मोटी ऊतकों के लिए मांग कर रही है क्योंकि 3 डी इम्युनोलेबलिंग के कई दौर अव्यावहारिक लंबे17 हैं। यह nonlinear 3D हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन11,17 के कारण पंजीकरण त्रुटियों को पेश करने की भी बहुत संभावना है। Immuno-eprSRS ऐसे परिदृश्य में चक्रीय प्रतिदीप्ति की व्यावहारिक बाधाओं को दूर करता है और एक बड़ी मात्रा17 में प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क को प्रकट करने के अवसर लाता है।

वर्तमान मल्टीप्लेक्सिटी मुख्य रूप से द्वितीयक एंटीबॉडी की उपलब्धता से प्रतिबंधित है। जबकि इस प्रोटोकॉल में, हमने अप्रत्यक्ष इम्युनोलेबलिंग पर ध्यान केंद्रित किया, जिसमें MARS जांच को माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित किया जाता है, प्रत्यक्ष इम्यूनोलेबलिंग और लेक्टिन स्टेनिंग संभव हैं। रमन रंजक के साथ अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी सत्यापन के बाद, वर्तमान में विकसित रमनरंगों 13,18,24 के साथ 20 चैनलों की उम्मीद है। इसके अलावा, इमेजिंग बहुत कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य ों को confocal प्रतिदीप्ति प्रणाली की तुलना में अपनी थोड़ी समझौता संवेदनशीलता के कारण epr-SRS के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस संबंध में, हम प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए उज्ज्वल MARS रंगों और कम-अभिव्यक्ति लक्ष्यों के लिए अपेक्षाकृत कम-प्रचुर मात्रा में लक्ष्य निर्दिष्ट करने की सलाह देते हैं।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू उपकरणों और जांच की पहुंच है। इंस्ट्रूमेंटेशन-वार, एक एसआरएस माइक्रोस्कोप आमतौर पर एक ऑप्टिकल मॉड्यूलेटर, एक माइक्रोस्कोप, एक फोटोडायोड डिटेक्टर और डेमोडुलेशन25 के लिए एक लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ एक दोहरे रंग के लेजर स्रोत से बना होता है। प्रत्येक घटक व्यावसायिक रूप से दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की तुलना में थोड़ा अधिक कुल लागत के साथ उपलब्ध है। एक पूरी तरह से एकीकृत मल्टीमॉडल एसआरएस / प्रतिदीप्ति अनुसंधान माइक्रोस्कोप को एक समान पिकोसेकंड लेजर का उपयोग करके26 का व्यावसायीकरण किया गया है, जैसा कि एसआरएस उत्तेजना और प्रतिदीप्ति के लिए निरंतर-तरंग (सीडब्ल्यू) लेजर सेट के लिए यहां है। यह प्रणाली रोजमर्रा के जैविक अनुसंधान में मल्टीप्लेक्स कंपन इमेजिंग के लिए आसानी से लागू होती है। जांच-वार, मार्स जांच को अभी तक व्यावसायीकरण नहीं किया गया है और कुछ संश्लेषण क्षमताओं की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, कई वाणिज्यिक दूर-लाल फ्लोरोफोरस (एल वेई एट अल में विस्तारित डेटा तालिका 1 देखें प्रकृति 201713) का उपयोग ईपीआर-एसआरएस के लिए किया जा सकता है। फिर भी, मल्टीप्लेक्सिटी से समझौता किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि प्रकृति द्वारा मार्स जांच छोटे कार्बनिक अणु हैं, इसलिए इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस ऊतक धुंधला होने के मामले में इम्यूनोफ्लोरेसेंस के समान है। इसलिए, इम्युनोफ्लोरेसेंस में एंटीबॉडी जैसे मान्य आत्मीयता अभिकर्मकों के संग्रह को आसानी से इम्यूनो-ईपीआरएसआरएस अनुप्रयोगों में स्थानांतरित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम रूथ ए सिंगर और रिचर्ड के.पी. बेनिंगर को माउस अग्न्याशय ऊतक प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। W.M. NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) और अमेरिकी सेना (W911NF-19-1-0214) से समर्थन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
α-tubulin Abcam ab18251 Primary antibodies
α-tubulin BioLegend 625902 Primary antibodies
β-III-tubulin BioLegend 657402 Primary antibodies
β-III-tubulin Abcam ab41489 Primary antibodies
β-tubulin Abcam ab131205 Primary antibodies
Agarose, low gellling temperature Sigma Aldrich A9414 For brain embedding
Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) Abcam ab52866 Primary antibodies
Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) Abcam ab82812 Primary antibodies
Anti-GABA B receptor R2  antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) Millipore Sigma AB2255 Primary antibodies
Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) Thermo Scientific PA5-18598 Primary antibodies
Anti-Glucagon  antibody produced in mouse (Glucagon) Santa Cruz Biotechnology sc-514592 Primary antibodies
Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) DAKO IR00261-2 Primary antibodies
Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) Abcam ab7349 Primary antibodies
Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) Thermo Scientific PA5-78639 Primary antibodies
Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) Sigma Aldrich SAB2500747 Primary antibodies
Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) Milipore 06-1379 Primary antibodies
Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) Abcam ab30788 Primary antibodies
Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) Abcam ab24525 Primary antibodies
Band-pass filter KR Electronics KR2724 8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator Mini Circuits STRM-50
BNC cable Thorlabs 2249-C Coaxial Cable, BNC Male / Male
Broadband dielectric mirror Thorlabs BB1-E03 750 - 1100 nm
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
Centrifuge
Condenser Olympus oil immersion, 1.4 N.A.
Cytokeratin 18 Abcam ab7797 Primary antibodies
Cytokeratin 18 Abcam ab24561 Primary antibodies
DC power supply TopWard 6302D Bias voltage is 64 V
Dichroic mount Thorlabs KM100CL Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed
Donkey anti-Chicken IgY (H+L) Jackson ImmunoResearch 703-005-155 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-005-147 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 706-005-148 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-005-151 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-005-152 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-005-153 Secondary antibodies for MARS conjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 713-005-147 Secondary antibodies for MARS conjugation
DPBS Fisher Scientific 14-190-250
EpCAM Abcam ab71916 Primary antibodies
Ethanol Sigma Aldrich 443611
Fast-speed look-in amplifier Zurich Instruments HF2LI DC - 50 MHz
FFPE Kidney Sample USBiomax HuFPT072
Fibrillarin Abcam ab5821 Primary antibodies
Giantin Abcam ab24586 Primary antibodies
Glucagon Santa Cruz Biotechnology sc-514592 Primary antibodies
H2B Abcam ab1790 Primary antibodies
HeLa ATCC ATCC CCL-2
High O.D. bandpass filter Chroma Technology ET890/220m Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
Hydrophobic pen Fisher Scientific NC1384846
Insulin ThermoFisher 701265 Primary antibodies
Integrated SRS laser system Applied Physics & Electronics, Inc. picoEMERALD picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted laser-scanning microscope Olympus FV1200MPE
Kinematic mirror mount Thorlabs POLARIS-K1-2AH 2 Low-Profile Hex Adjusters
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) Sigma Aldrich L0636-5 mg
Long-pass dichroic beam splitter Semrock Di02-R980-25x36 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MAP2 BioLegend 801810 Primary antibodies
Microscopy imaging software Olympus FluoView
NanoQuant Plate Tecan For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader.
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) Thermo Scientific R37606
Nunc 4-Well Dishes Fisher Scientific 12-566-300
Objective lens Olympus XLPlan N x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm
Paint brush
Periscope assembly Thorlabs RS99 includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
pH meter
Plate reader Tecan Infinite 200 PRO An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm.
ProLong Gold antifade reagent Thermo Scientific P36930
PSD95 Invitrogen 51-6900 Primary antibodies
Sephadex G-25 Medium GE Life Sciences 17-0033-01 gel filtration resin for desalting and buffer exchange
Shielded box with BNC connectors Pomona Electronics 2902 Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female
Si photodiode Thorlabs FDS1010 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area
Synapsin 2 ThermoFisher OSS00073G Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides Fisher Scientific 22-035813 Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Vibratome Leica VT1000
Vimentin Abcam ab8069 Primary antibodies
Xylenes Sigma Aldrich 214736

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References

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Bioengineering अंक 182 रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉनिक पूर्व अनुनाद अत्यधिक मल्टीप्लेक्स प्रोटीन इमेजिंग रमन रंजक immunohistochemistry प्रेरित
रमन रंजक के साथ अत्यधिक मल्टीप्लेक्स ऊतक इमेजिंग
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Shi, L., Wei, M., Min, W.… More

Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes. J. Vis. Exp. (182), e63547, doi:10.3791/63547 (2022).

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