Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المشاركة في زراعة الأعضاء الظهارية في الأمعاء الدقيقة الفئرانية مع الخلايا اللمفاوية الفطرية

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1 من الأمعاء الدقيقة الفئرانية الصفيحة propria، وإنشاء مزارع مشتركة ثلاثية الأبعاد (3D) بين كلا النوعين من الخلايا لدراسة التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا الظهارية المعوية والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1.

Abstract

توفر الثقافات المشتركة المعقدة للعضويات مع الخلايا المناعية أداة متعددة الاستخدامات لاستجواب التفاعلات ثنائية الاتجاه التي تدعم التوازن الدقيق للتوازن المخاطي. تقدم هذه الأنظمة متعددة الخلايا 3D نموذجا اختزاليا لمعالجة الأمراض متعددة العوامل وحل الصعوبات التقنية التي تنشأ عند دراسة أنواع الخلايا النادرة مثل الخلايا اللمفاوية الفطرية المقيمة في الأنسجة (ILCs). تصف هذه المقالة نظام الفئران الذي يجمع بين عضويات الأمعاء الدقيقة والأمعاء الدقيقة الصفيحة البروبريا المشتقة من النوع 1 من النوع 1 (ILC1s) ، والتي يمكن توسيعها بسهولة لتشمل مجموعات ILC أو مجموعات المناعة الأخرى. والمجتمعات الأصلية والمحلية هي مجموعة سكانية مقيمة في الأنسجة يتم إثراؤها بشكل خاص في الغشاء المخاطي، حيث تعزز التوازن وتستجيب بسرعة للضرر أو العدوى. وقد بدأت بالفعل الثقافات العضوية المشتركة مع المجتمعات الأصلية والمحلية في تسليط الضوء على وحدات الإشارات الظهارية المناعية الجديدة في الأمعاء، مما يكشف عن كيفية تأثير المجموعات الفرعية المختلفة ل ILC على سلامة الحاجز الظهاري المعوي وتجديده. سيمكن هذا البروتوكول من إجراء مزيد من التحقيقات في التفاعلات المتبادلة بين الخلايا الظهارية والمناعية ، والتي لديها القدرة على توفير رؤى جديدة حول آليات التوازن المخاطي والالتهاب.

Introduction

التواصل بين الظهارة المعوية والجهاز المناعي المقيم في الأمعاء أمر أساسي للحفاظ على التوازن المعوي1. ترتبط اضطرابات هذه التفاعلات بكل من الأمراض المحلية والجهازية ، بما في ذلك مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطانات الجهاز الهضمي2. مثال بارز على أحد المنظمين الحاسم للتوازن الذي تم وصفه مؤخرا يأتي من دراسة الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILCs) ، والتي برزت كلاعبين رئيسيين في المشهد المناعي المعوي3. ILCs هي مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية غير المتجانسة التي تنظم التوازن المعوي وتنظم الالتهاب إلى حد كبير من خلال إشارات بوساطة السيتوكين4.

تنقسم ILCs Murine على نطاق واسع إلى أنواع فرعية تستند إلى عامل النسخ والمستقبل وملامح التعبير عن السيتوكين5. يتم تعريف ILCs من النوع 1 ، والتي تشمل الخلايا القاتلة الطبيعية السامة للخلايا (NK) و ILCs الشبيهة بالنوع 1 الشبيهة بالمساعدة (ILC1s) ، من خلال التعبير عن عامل النسخ (eomesodermin) Eomes وبروتين T-box المعبر عنه في الخلايا التائية (T-bet)6 ، على التوالي ، والسيتوكينات المفرزة المرتبطة بمناعة T helper type-1 (TH1): الإنترفيرون γ (IFNγ) وعامل نخر الورم (TNF) ، استجابة للإنترلوكين (IL)-12 ، IL-15 و IL-187. أثناء التوازن ، تفرز ILC1s المقيمة في الأنسجة β عامل النمو التحويلي (TGF-β) لدفع الانتشار الظهاري وإعادة تشكيل المصفوفة8. تستجيب ILCs من النوع 2 (ILC2s) في المقام الأول لعدوى الديدان الطفيلية عن طريق إفراز السيتوكينات المرتبطة بمساعد T من النوع 2 (TH2): IL-4 و IL-5 و IL-13 ، وتتميز بالتعبير عن مستقبلات يتيمة مرتبطة بحمض الريتينويك (ROR) α (ROR-α)9 وبروتين GATA الملزم 3 (GATA-3)10,11,12 . في الفئران ، تتميز ILC2s المعوية "الالتهابية" بالتعبير عن مستقبلات تشبه الليكتين في الخلايا القاتلة (الفصيلة الفرعية G member 1 ، KLRG)13 حيث تستجيب للخلية الظهارية المشتقة IL-2514,15. وأخيرا، تعتمد ILCs من النوع 3، والتي تشمل الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية و ILCs الشبيهة بالنوع 3 (ILC3s)، على عامل النسخ ROR-γt16، وتتجمع في مجموعات تفرز إما عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة (GM-CSF) ، IL-17 ، أو IL-22 استجابة لإشارات IL-1β و IL-23 المحلية17. تتجمع الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية في بقع باير وهي ضرورية لتطوير هذه الأعضاء اللمفاوية الثانوية أثناء التطور18 ، في حين أن ILC3s هي النوع الفرعي ILC الأكثر وفرة في الأمعاء الدقيقة الفئران البالغة الصفيحة propria. تم تسخير أحد أقدم أنظمة الزراعة العضوية المعوية الفئرانية المشتركة مع ILC3s لفصل تأثير السيتوكين IL-22 على محول الإشارة ومنشط النسخ 3 (STAT-3) بوساطة تكرار الليوسين الغني بالضوء الذي يحتوي على G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + تكاثر الخلايا الجذعية المعوية19 ، وهو مثال قوي على التفاعل الظهاري ILC التجديدي. تظهر ILCs عدم تجانس البصمة بين الأعضاء 20,21 وتظهر اللدونة بين المجموعات الفرعية استجابة للسيتوكينات المستقطبة22. ما الذي يدفع هذه البصمات الخاصة بالأنسجة والاختلافات في اللدونة ، وما هو الدور الذي تلعبه في الأمراض المزمنة مثل IBD23 ، تظل موضوعات مثيرة يمكن معالجتها باستخدام الثقافات العضوية المشتركة.

ظهرت المواد العضوية المعوية كنموذج ناجح وموثوق به لدراسة الظهارة المعوية24,25. يتم إنشاؤها عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الظهارية المعوية Lgr5 + ، أو الخبايا المعزولة بأكملها ، والتي تشمل خلايا Paneth كمصدر داخلي لعضو عائلة Wnt 3A (Wnt3a). يتم الحفاظ على هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد إما في الهيدروجيل الاصطناعي26 أو في المواد الحيوية التي تحاكي الصفيحة القاعدية propria، على سبيل المثال، مصفوفة القاعدية خارج الخلية (TBEM) المتشابكة حراريا (TBEM)، ويتم استكمالها بشكل أكبر بعوامل النمو التي تحاكي المكانة المحيطة، وأبرزها عامل النمو الظهاري (EGF)، ومثبط البروتين المورفوجيني العظمي (BMP) Noggin، و Lgr5-ligand و Wnt-ناهض R-Spondin127 . في ظل هذه الظروف ، تحافظ المواد العضوية على القطبية الظهارية القاعدية وتلخص بنية الزغابات المشفرة للظهارة المعوية مع سراديب الخلايا الجذعية الناشئة التي تتمايز نهائيا إلى خلايا امتزازية وإفرازية في وسط العضوية ، والتي تسقط بعد ذلك في الزائفة الداخلية بواسطة anoikis28. على الرغم من أن المواد العضوية المعوية وحدها كانت مفيدة للغاية كنماذج اختزالية للتطور الظهاري وديناميكياته بمعزل عن 29,30 ، إلا أنها تحمل إمكانات مستقبلية هائلة لفهم كيفية تنظيم هذه السلوكيات أو التأثير عليها أو حتى تعطيلها بواسطة المقصورة المناعية.

في البروتوكول التالي ، يتم وصف طريقة للزراعة المشتركة بين الفئران العضوية المعوية الصغيرة والصفيحة المشتقة من ILC1s ، والتي تم استخدامها مؤخرا لتحديد كيف يقلل هذا السكان بشكل غير متوقع من البصمات المعوية للالتهاب ويساهم بدلا من ذلك في زيادة الانتشار الظهاري عبر TGF-β في هذا النظام8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب إكمال جميع التجارب وفقا لجميع المبادئ التوجيهية التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة للاستخدام الحيواني والامتثال لها. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية للدراسة الموضحة في المقالة والفيديو التاليين وفقا لجميع الإرشادات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة للاستخدام الحيواني والامتثال لها.

تم إعدام جميع الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للإجراء الأخلاقي القياسي ، الذي أجراه أفراد مدربون. قبل حصاد الأعضاء والأنسجة، تم إجراء تقطيع الشريان الفخذي أو قطع الرأس (حسب الاقتضاء للبروتوكول المعني) كتقييمات تأكيدية للوفاة. تم إيواء الحيوانات في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (ما لم ينص على خلاف ذلك) في وحدة تجارية معتمدة ووحدة كينغز كوليدج لندن وفقا لقانون الحيوانات في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) لعام 1986 (ترخيص مشروع وزارة الداخلية البريطانية (PPL:70/7869 إلى سبتمبر 2018; P9720273E من سبتمبر 2018).

1. إنشاء الفئران العضوية المعوية الصغيرة

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول توليد المواد العضوية المعوية من الأمعاء الدقيقة الفئرانية. يتم عزل الخبايا أولا من الأنسجة ، وإعادة تعليقها في TBEM ، ثم يتم احتضانها بوسائط تحتوي على EGF و Noggin و R-Spondin (ENR). كما تم وصف إنشاء الفئران العضوية المعوية الصغيرة بشكل جيد في أماكن أخرى 24،25،27.

  1. ضع TBEM على الجليد لإذابة (40 ميكرولتر / بئر) ووضع طبقة قياسية من زراعة الأنسجة المعالجة (تشير إلى الألواح ذات السطح المحب للماء والمشحون سلبا) 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية لتسخينها مسبقا.
    ملاحظة: 500 ميكرولتر من TBEM سوف تذوب في حوالي 2-4 ساعات ؛ لا تتركه في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير ~ 4 مل أو 550 مل لكل بئر من وسط ENR عن طريق إضافة EGF و Noggin و R-Spondin إلى الوسط القاعدي (الجدول 1) ووضعه في حاضنة 37 درجة مئوية.
  3. قم بإعدام يبلغ من العمر 6-12 أسبوعا وتشريح الأمعاء الدقيقة باستخدام الملقط ومقص التشريح المجهري. ضعه في 15 مل من محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) على الجليد.
  4. باستخدام المعدة والكاكوم كنقاط للاتجاه ، اعزل المنطقة المطلوبة من الأمعاء الدقيقة (الاثني عشر أو الصائم أو الدقاق). في هذا البروتوكول ، يتم عزل الدقاقي.
  5. غمر الأمعاء في PBS على طبق بتري 10 سم2 على الجليد. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الدهون بلطف ، ولكن تماما ، من الأمعاء.
  6. قطع الأنسجة طوليا باستخدام مقص التشريح المجهري (يفضل مع نصائح مستديرة لتجنب ثقب). الحفاظ على الأمعاء مغمورة في PBS ، وهز لإزالة المادة البرازية ، والحفاظ على الجانب المخاطي لأعلى لتتبع اتجاه الأنسجة.
  7. انقل الأنسجة إلى الغطاء الجاف لطبق بتري على الجليد ، مع وضع جانب الأمعاء المخاطي / الزغابات لأعلى. عقد أحد طرفي الأمعاء مع ملقط ، وكشط بلطف بعيدا عن المخاط باستخدام حافة زاوية من شريحة زجاجية نظيفة.
  8. املأ الطبق ب PBS البارد وشطف الأنسجة.
  9. قم بتغطية أنبوب سعة 50 مل مسبقا باستخدام PBS2 (PBS + 2٪ FCS ؛ انظر الجدول 1) لمنع التصاق الأنسجة بالبلاستيك وإضافة 10 مل من PBS البارد إلى هذا الأنبوب. قطع الأمعاء إلى شرائح صغيرة (~ 2 مم) ونقلها إلى أنبوب 50 مل المغلفة مسبقا مع PBS2.
  10. باستخدام ماصة سعة 25 مل مغلفة مسبقا ب PBS2 ، قم بماصة الأجزاء لأعلى ولأسفل 5-10 مرات لتنظيف شظايا الأنسجة.
  11. اسمح للشرائح بالاستقرار لمدة 15-30 ثانية ، وقم بإزالة جهاز PBS الفائق وتجاهله ، وكرر الخطوتين 1.10 و 1.11 حتى يصبح الحل واضحا (حوالي 3-4 مرات).
  12. اسمح للشرائح بالاستقرار وتجاهل PBS supernatant. أضف 30 مل من المخزن المؤقت لعزل السرداب البارد (الجدول 1).
  13. ضع الأنابيب على بكرة أفقية أو هزاز عند 30-60 دورة في الدقيقة (أو لطيفة) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. لا تحضن بسرعات أعلى أو درجات حرارة أعلى أو مدة أطول لأن الخبايا ستنزاح قبل الأوان وتصبح خلايا مفردة ذات جدوى وعائد أقل.
    ملاحظة: من هذه المرحلة فصاعدا ، يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.
  14. اسمح للأجزاء المعوية بالاستقرار عند قاعدة أنبوب 50 مل. قم بإزالة المخزن المؤقت لعزل السرداب دون تعطيل الأجزاء المستقرة ونقله إلى أنبوب سعة 50 مل على الجليد.
    ملاحظة: إذا كانت عملية عزل السرداب صارمة للغاية، فقد تظهر الخبايا في هذا الكسر. لذلك يمكن الاحتفاظ بها كاحتياطي ولكن سيتم التخلص منها على النحو الأمثل في نهاية البروتوكول.
  15. أضف 20 مل من PBS البارد إلى الأجزاء المعوية. باستخدام ماصة 25 مل مغلفة مسبقا مع PBS2 ، شرائح معوية ماصة صعودا وهبوطا 5-8 مرات.
  16. دع الشرائح تستقر لمدة 30 ثانية. قم بتغطية أنبوب سعة 50 مل وماصة سعة 25 مل مع PBS2. باستخدام هذه الماصة ، اجمع supernatant (الكسر 1) في أنبوب 50 مل المطلي مسبقا وضع الأنبوب على الجليد.
    ملاحظة: يعمل هذا الجزء على شطف المخزن المؤقت المتبقي لعزل السرداب. ومع ذلك ، فإنه يعمل أيضا كخطوة إضافية لمراقبة الجودة. إذا كان السحب قويا للغاية ، فستكون الخبايا وفيرة في جزء الشطف هذا ، وإذا كان لطيفا جدا ، فسيكون هناك القليل جدا من الحطام في هذا الجزء. على النحو الأمثل ، يتم التخلص من الكسر 1 في نهاية البروتوكول ، ولكن يمكن استخدامه لصنع المواد العضوية إذا نشأت مشكلات مع الكسور 2-4 التي تم الحصول عليها أدناه.
  17. كرر الخطوتين 1.15 و1.16 ولكن أضف 10 مل من PBS المثلج بدلا من 20 مل وضع الفائق في أنبوب جديد سعة 50 مل مطلي مسبقا ب PBS2 (الكسر 2).
  18. كرر الخطوة 1.17 مرتين أخريين ولكن قم بتجميع السوبرناتانت الناتج مع الكسر 2 (في نفس الأنبوب 50 مل من الخطوة 1.17) للحصول على الكسور 2-4. يجب أن يحتوي هذا الأنبوب الفردي سعة 50 مل على الخبايا التي تم إزاحتها في 30 مل من PBS البارد المثلج.
  19. قم بإزالة أليكوت 50 ميكرولتر من الكسور 2-4 المجمعة وضعها على غطاء. تقييم وجود الخبايا الظهارية باستخدام المجهر الضوئي المقلوب.
    ملاحظة: في حالة عدم وجود الخباياب، كرر الخطوتين 1.17 و1.18 باستخدام المزيد من القوة أثناء السحب حتى يتم تحرير الخباياب. تأكد من عدم إزاحة الخبايا قبل الأوان في المخزن المؤقت لعزل السرداب من الخطوة 1.14 أو في الكسر 1 من الخطوة 1.16.
  20. قم بتغطية مصفاة 100 ميكرومتر مسبقا وأنبوب 50 مل مع PBS2. مرر كسور السرداب المجمعة عبر هذه المصفاة وإلى أنبوب 50 مل المطلي مسبقا.
  21. قم بتدوير أجزاء السرداب المتوترة عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  22. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الخبايا في 10 مل من DMEM/F12 المتقدم البارد على الجليد. انقل الخبايا إلى أنبوب 15 مل.
  23. قم بتدوير الخبايا عند 210 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا المفردة والخلايا الليمفاوية.
  24. أعد تعليق الخبايا في 1 مل من DMEM/F12 المتقدم البارد على الجليد.
  25. قم بإزالة أليكوت 10 ميكرولتر وضعه على غطاء. باستخدام مجهر ضوئي مقلوب، احسب عدد الخبايا لتحديد تركيز السرداب.
  26. احسب الحجم المطلوب ل ~ 400 و ~ 1500 سراديب. قم بتغطية طرف p1000 مسبقا باستخدام PBS2 واستخدم هذا الطرف لماصة وحدات التخزين المطلوبة (التي تحتوي على ~ 400 و ~ 1500 سرد) في أنابيب منفصلة 1.5 مل.
  27. قم بتدوير الخبايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  28. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الفائقة ، ثم أعد تعليق الخبايا في 80 ميكرولتر من TBEM الموضوعة على الجليد (أطراف ماصة ما قبل التبريد عند 4 درجات مئوية لمنع هلام المصفوفة ، والذي يحدث عند 12 درجة مئوية).
  29. قم بإزالة اللوحة المكونة من 24 بئرا ، الموضوعة في الخطوة 1.1 ، من الحاضنة. قم بسحب 40 ميكرولتر من الخبايا بلطف إلى وسط البئر في حركة دائرية بطيئة لتشكيل هيكل قبة مسطحة ولكن 3D ، أو في ثلاث قباب صغيرة منفصلة.
    ملاحظة: صلاحية المواد العضوية هي الأدنى في وسط القبة حيث تتخلل العناصر الغذائية والغازات بشكل أقل فعالية31 ؛ وبالتالي ، فإن تعظيم مساحة السطح المعرضة للوسائط مع الحفاظ على هياكل 3D واضحة أمر بالغ الأهمية.
  30. كرر الخطوة 1.29 لإنشاء ما مجموعه بئرين بكثافة ~ 200 سرداب لكل بئر وبئرين آخرين بكثافة ~ 750 سكراب لكل بئر. ضع اللوحة مباشرة في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 15-20 دقيقة ، مع الحرص على عدم تعطيل قباب المصفوفة اللزجة ولكن التي لا تزال سائلة.
  31. أضف 550 ميكرولتر من وسائط ENR المسخنة مسبقا لكل بئر (من الخطوة 1.2) واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في هذه المرحلة ، يقترح استكمال وسيط ENR ب 5 ميكرومتر من ناهض Wnt (CHIR 99021) و 5 ميكرومتر من مثبطات Rho Kinase (Y-27632) لأول 24 ساعة من الثقافة بعد العزل لتحسين إنتاجية وكفاءة توليد الخبايا العضوية المعزولة حديثا من الأنسجة.
    ملاحظة: يجب أن تغلق الخبايا لتشكيل هياكل مستديرة في غضون 24 ساعة ، ويجب أن تظهر براعم السرداب في غضون 2-4 أيام (الشكل 1A).
  32. استبدل بوسيط ENR طازج في نهاية الحضانة في الخطوة 1.31 ، ثم كل 2 ~ 2 أيام أو عندما يتحول مؤشر الأس الهيدروجيني للفينول في وسط الثقافة إلى اللون البرتقالي الشاحب ولكن قبل أن يتحول إلى اللون الأصفر.

2. صيانة الفئران العضوية المعوية الصغيرة

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول صيانة وتمرير المواد العضوية المعوية الصغيرة الفئران. يتم حصاد المواد العضوية أولا ، ثم تعطيلها ميكانيكيا باستخدام طرف p1000 عازم. تقوم هذه العملية بتقسيم المواد العضوية الكبيرة التي تتكون من العديد من الخبايا إلى أجزاء أصغر متعددة للتوسع وتطلق الخلايا الميتة التي تراكمت في الزائفة. كما تم وصف صيانة المورين العضوية المعوية الصغيرة بشكل جيد في أماكن أخرى 24،25،27. يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة. مرور أو توسيع المواد العضوية مرة واحدة كل 4-5 أيام ، قبل انفجار المواد العضوية يحدث من تراكم كبير من الحطام في التجويف العضوي. يمكن تمرير المواد العضوية بنسبة 1: 2-1: 3 اعتمادا على كثافة العضوية ، والتي ستكون على النحو الأمثل بين 100-200 عضوي لكل بئر.

  1. كما هو الحال في الخطوتين 1.1 و 1.2 ، قم بإذابة TBEM على الجليد (40 ميكرولتر / بئر) وإعداد وسط ENR (550 ميكرولتر لكل بئر). ضع مزرعة الأنسجة المتوسطة والقياسية المعالجة بصفيحة 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على المواد العضوية من الحاضنة. تخلص من وسائل الإعلام من البئر المراد مرورها.
  3. أضف 500 ميكرولتر من DMEM / F12 المتقدم البارد إلى البئر. باستخدام طرف p1000 (مغلف مسبقا بالوسائط لتجنب الالتصاق العضوي بالطرف الداخلي) ، قم بحصاد المواد العضوية في أنبوب 15 مل.
  4. شطف الجزء السفلي من البئر مع 250-300 ميكرولتر من الثلج البارد المتقدم DMEM / F12 لضمان عدم بقاء المواد العضوية في البئر ، وتجمع في أنبوب 15 مل يحتوي على المواد العضوية المحصودة من الخطوة 2.3. كرر الخطوتين 2.3 و 2.4 عند تمرير آبار متعددة وتجميع المواد العضوية من آبار متعددة في نفس الأنبوب سعة 15 مل.
  5. قم بتدوير المواد العضوية عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. عند الطرد المركزي ، تأكد من وجود أربعة أجزاء مرئية: جزء أساسي مع عضويات صحية ، وجزء مصفوفة مركزي وواضح ، وجزء مصفوفة يحتوي على خلايا مفردة وميتة ، وطبقة فوقية عليا تحتوي على خلايا مفردة وميتة. قم بإزالة السوبرناتانت ، وجزء الحطام ، وأكبر قدر ممكن من جزء المصفوفة الواضحة دون تعطيل حبيبات المواد العضوية.
  7. ثني طرف ماصة p1000 برفق (انحناء 2-5 مم تقريبا). قم بتغطية هذه النصيحة مسبقا في PBS2 أو DMEM / F12 المتقدم. باستخدام هذه النصيحة ، ماصة المواد العضوية صعودا وهبوطا 10-20 مرة لتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا والمصفوفة المتبقية.
  8. تدور لأسفل عند 210 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. كما هو الحال في الخطوة 2.6 ، قم بإزالة السوبرناتان ، وجزء الحطام ، وأكبر قدر ممكن من جزء المصفوفة الواضحة دون تعطيل حبيبات الخبايا المنفصلة. إذا لم تشكل الخبايا الصحية أو المواد العضوية الصغيرة كريات واضحة ، فقم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. احسب الحجم المطلوب من TBEM (80-120 ميكرولتر لكل بئر من المواد العضوية المحصودة اعتمادا على ما إذا كان يتم استخدام نسبة مرور 1: 2 أو 1: 3).
  11. أعد تعليق الكريات في الحجم المحسوب ل TBEM وتطبيق 40 ميكرولتر لكل بئر على الصفيحة ذات ال 24 بئرا التي تم تسخينها مسبقا لتشكيل قبة. ضع اللوحة مباشرة في الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ CO2) لمدة 15-20 دقيقة.
  12. أضف 550 ميكرولتر من ENR المتوسطة لكل بئر واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تحقق من الثقافات لتشكيل العضوية بعد 24 ساعة. استبدل بوسيط ENR جديد كل 2-3 أيام بعد المرور.

3. عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية الصفيحة المعوية الصغيرة

ملاحظة: يصف هذا القسم من البروتوكول عزل ILC1 عن صفيحة الأمعاء الدقيقة الفئرانية لفئران مراسل RORγtGFP. وهذا ينطوي على إزالة الخلايا الظهارية ، وهضم الأنسجة ، وفصل تدرج الكثافة للخلايا الليمفاوية ، وعزل ILC1 عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS). يتطلب عزل FACS باتباع استراتيجية البوابات في الشكل 2 المزيج الرئيسي للتلطيخ خارج الخلية (الجدول 4) ، مع إعداد عناصر التحكم الإضافية في التلطيخ الموضحة في الجدول 2 والجدول 3 للآلة (الجدول 2) والبوابات (الجدول 3). تستخدم فئران مراسل RORγt GFP لعزل ILC1 الحية والنقية وبوابة RORγtGFP + ILC3. كما تم وصف معالجة الأنسجة لعزل الخلايا الليمفاوية الصفيحية بشكل جيد في مكان آخر32.

  1. معالجة الأنسجة
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالأنسجة من النسخ المتماثلة الحيوانية البيولوجية الفردية منفصلة في هذا البروتوكول. يجب وضع علامات مناسبة على هذه العينات والاحتفاظ بها على الجليد كلما أمكن ذلك. يجب السماح لجميع الكواشف باستثناء إنزيمات الهضم بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة لضمان هضم الأنسجة بسرعة.
    1. ضع TBEM على الجليد لتذوب (40 ميكرولتر / بئر). احتفظ بلوحة قياسية من 24 بئرا معالجة بزراعة الأنسجة في حاضنة 37 درجة مئوية لتسخينها مسبقا.
    2. قم بإعداد مخزن مؤقت لإزالة الظهارة الطازجة ومخزن مؤقت للهضم (انظر الجدول 1). تحضير وسط تدرج منخفض اللزوجة متساوي التوتر منخفض اللزوجة (LVDGM) (90٪ LVDGM و 10٪ 10x PBS) ، و 40٪ LVDGM متساوي التوتر ، و 80٪ LVDGM متساوي التوتر في المخزن المؤقت المحايد (الجدول 1).
    3. قم بإعدام يبلغ من العمر 6-12 أسبوعا ، وتشريح الأمعاء الدقيقة باستخدام الملقط ومقص التشريح المجهري ، ووضع الأمعاء في 15 مل من PBS على الجليد.
    4. غمر الأمعاء في PBS على طبق بتري 10 سم2 على الجليد واستخدام ملقط لإزالة الدهون بلطف ولكن تماما من الأمعاء.
    5. قم بإزالة بقع باير (~ 5-10 ؛ الجري في خط مقابل خط الأنسجة الدهنية) باستخدام مقص التشريح المجهري لاستنفاد الخلايا المحفزة للأنسجة اللمفاوية والخلايا البائية.
      ملاحظة: بقع باير غائبة في Rag-/- وغيرها من الحيوانات المستنفدة للنسب. على عكس فقاعات الهواء ، ستبقى بقع باير في مكانها إذا تم دفعها.
    6. قطع الأنسجة طوليا باستخدام مقص التشريح المجهري (يفضل مع نصائح مستديرة لتجنب ثقب). الحفاظ على الأمعاء مغمورة في PBS ، يهز لإزالة المواد البرازية.
    7. قطع الأنسجة إلى قطع طولها 2-4 سم ونقلها إلى أنبوب 50 مل.
    8. أضف ما يقرب من 20-40 مل من PBS البارد المثلج ورجه بقوة لمدة 5-15 ثانية لإزالة المخاط والحطام.
    9. تخلص من محتويات الأنبوب في طبق بتري طازج واستبدل الشظايا المعوية في نفس الأنبوب الذي تبلغ سعته 50 مل باستخدام الملقط.
    10. كرر الخطوتين 3.1.8 و3.1.9 3-4 مرات، أو حتى يصبح PBS واضحا.
  2. إزالة الظهارة
    1. ضع شظايا الأمعاء في طبق بتري طازج على الجليد. باستخدام الملقط ، التقط الأجزاء المعوية وأزل السائل الزائد عن طريق النقر على سطح جاف.
    2. قطع الأنسجة إلى ~ 0.75-1 سم قطع ونقلها إلى أنبوب جديد 50 مل. أضف 5-7 مل من المخزن المؤقت لإزالة الظهارة (الجدول 1). دوامة الأنبوب والتأكد من أن جميع الأجزاء المعوية مغمورة في المخزن المؤقت.
    3. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية مع هزاز (100-150 دورة في الدقيقة) لمدة 12-15 دقيقة. دوامة الأنبوب لمدة 20-30 ثانية.
    4. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.3 مرة أخرى ، مع التخلص من supernatant الغائم (يحتوي الكسر على الخلايا الظهارية وداخل الظهارة) واستبداله بمخزن مؤقت جديد لإزالة الظهارة.
  3. هضم الأنسجة
    1. ضعي المحتويات على طبق بتري طازج. باستخدام الملقط ، التقط الأجزاء المعوية واضغط على سطح جاف للتخلص من السائل الزائد. ضع الشرائح في طبق بتري طازج على الثلج.
    2. قم بتجميع الأجزاء في وسط طبق بتري في كتلة كثيفة. باستخدام مشرطين أو مقص حاد ، قم بتمزيق الأنسجة بدقة حتى تصل إلى اتساق لزج يمكن أن يمر عبر طرف ماصة p1000.
    3. باستخدام ملاقط ، ضع الأنسجة المفرومة في أنبوب نظيف سعة 50 مل. شطف طبق بتري مع 1-2 مل من مخزن الهضم العازل (الجدول 1) لجمع أي أنسجة متبقية وتجميعها في أنبوب 50 مل مع الأنسجة الممزقة.
    4. أضف 5-7 مل من مخزن الهضم العازل إلى الأنسجة الممزقة وتأكد من جمع جميع الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، مع هزاز متوسط (~ 100-150 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة. دوامة الأنبوب لمدة 20-30 ثانية كل 5 دقائق للمساعدة في الهضم.
    6. أثناء احتضان العينات، ضع مصفاة خلايا 40 ميكرومتر فوق أنبوب جديد سعة 50 مل لكل عينة. قم بتغطية المرشحات ب 1-2 مل من المخزن المؤقت المحايد (الجدول 1).
    7. دوامة العينات لمدة 20-30 ثانية بعد انتهاء الحضانة.
    8. قم بتصفية الأنسجة المهضومة جزئيا من خلال مرشح 40 ميكرومتر المطلي في أنبوب 50 مل الذي يحتوي على مخزن مؤقت محايد.
    9. استخدم الملقط لجمع الأنسجة غير المهضومة من مرشح 40 ميكرومتر ووضعها مرة أخرى في أنبوب 50 مل الذي تم إجراء الهضم فيه ، للجولة الثانية من الهضم. قم بإزالة المرشحات وشطفها باستخدام مخزن الهضم العازل لإزاحة أي أنسجة غير مهضومة تلتصق بالفلتر.
    10. بمجرد إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة غير المهضومة من المرشح ووضعها مرة أخرى في أنبوب 50 مل الذي تم إجراء الهضم فيه ، اشطف المرشح باستخدام مخزن مؤقت محايد 1-2 مل فوق أنبوب 50 مل يحتوي على supernatant المفلترة.
    11. أضف 20-25 مل من المخزن المؤقت المحايد إلى السوبرناتانت المصفى وضعه على الجليد للحفاظ على صلاحية الخلايا المعزولة خلال الجولة الثانية من هضم الأنسجة.
    12. أضف 5-10 مل أخرى من المخزن المؤقت للهضم إلى الأنسجة غير المهضومة وكرر الخطوات 3.3.5-3.3.10 ، مما يضمن تصفية الأنسجة المهضومة في نفس الأنبوب كما هو مستخدم في الخطوة 3.3.8 (يمكن أيضا إعادة استخدام نفس المرشح). شطف الفلتر مع المخزن المؤقت المحايد حتى يتم الوصول إلى خط 50 مل ، ثم تخلص من أي أنسجة متبقية غير مهضومة.
  4. عزل الخلايا الليمفاوية عن طريق تدرج الكثافة
    1. قم بتدوير المواد الفائقة التي تم جمعها لكل نسخة بيولوجية في 500 × g لمدة 10 دقائق.
    2. خلال الخطوة 3.4.1 ، أضف 5 مل من 80٪ LVDGM متساوي التوتر إلى أنبوب 15 مل لكل نسخة بيولوجية.
    3. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة من الأنسجة المهضومة المصفاة. أعد تعليق الكريات في 10 مل من 40٪ LVDGM متساوي التوتر ، مما يضمن أن الكريات متجانسة بشكل جيد ، ولا تبقى أي قطع كبيرة.
    4. قم بضبط مساعد الماصة على أبطأ إعداد له ، وقم بإمالة الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على 80٪ LVDGM متساوي التوتر ، وتراكب 10 مل من تعليق الخلية بلطف شديد في 40٪ متساوي التوتر LVDGM لضمان عدم اختلاط تعليق الخلية مع جزء 80٪.
      ملاحظة: إذا اختلطت الكسور عن طريق الخطأ، فقم بتوزيع الخلايا الليمفاوية بسرعة والتي وصلت إلى الكسر 80٪ بين أنبوبين سعة 50 مل مملوءين ب PBS، وأجهزة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم. ثم تجاهل supernatant ثم كرر الخطوات 3.4.3-3.4.4.
    5. قم بتدوير الأنابيب عند 900 × g و 20 °C ، مع ضبط التسارع وإلغاء التسارع على أدنى إعداد لضمان عدم تعطل الكسور. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة (لا يشمل وقت الاستراحة).
      ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات من هذه الخطوة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة المعقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.
    6. قم بتغطية أنبوب سعة 50 مل مسبقا لكل عينة باستخدام PBS2 وأضف 45 مل من PBS المثلج البارد.
    7. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة طبقة الحطام العلوية برفق من أنبوب 15 مل. قم بتغطية طرف p1000 ب PBS2 واستخدمه لجمع الطور البيني المحمل بالخلايا الليمفاوية بين التدرجات 40٪ -80٪ في أنبوب 50 مل يحتوي على 45 مل من PBS البارد المثلج.
    8. قم بتدوير الأنابيب عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS و 2٪ FCS و 0.5 mM EDTA و 10 mM HEPES ؛ انظر الجدول 1). قم بتغطية مرشح 40 ميكرومتر مسبقا بمخزن مؤقت FACS واستخدمه لتصفية تعليق الخلية في أنبوب تدفق. شطف أنبوب 50 مل مع 500 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت FACS وتصفية في نفس أنبوب التدفق.
    10. قم بإزالة أليكوت 10 ميكرولتر من 1 مل الناتج من تعليق الخلية. عد محصول الخلايا الليمفاوية باستخدام عداد الخلايا أو مقياس الدم وحساب تركيز الخلية لكل عينة.
  5. إعداد عينة للفرز - تلطيخ خارج الخلية
    ملاحظة: تستخدم الأجسام المضادة المستخدمة في المزيج الرئيسي للتلطيخ خارج الخلية ، وكذلك الكواشف لإعداد صبغة قابلة للإصلاح ومحلول كتلة Fc ، بتركيزات كافية لمدة تصل إلى 5 × 106 الخلايا لكل 100 ميكرولتر. للحصول على تعويض آلة FACS لفرز ILC1 ، يلزم وجود عناصر تحكم أحادية اللون لكل من الفلوروفورات في المزيج الرئيسي للتلطيخ خارج الخلية. بالنسبة للأجسام المضادة ، يمكن استخدام حبات التعويض التي تحتوي على مجموعة خرزات إيجابية مرتبطة بالأجسام المضادة ومجموعة خرزات سلبية غير ملزمة للأجسام المضادة. بالنسبة للتحكم في لون واحد في صبغة البقاء القابلة للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية (UV) ، يمكن استخدام حبات التعويض التي تحتوي على مجموعات تفاعلية أمينية (للإشارة الإيجابية) وغير تفاعلية (للإشارة السلبية). لا ينصح باستخدام الخلايا من RORγtGFPالفئران مراسل للأشعة فوق البنفسجية قابلة للإصلاح صبغة قابلة للإصلاح لون واحد التحكم، لأن هذه الخلايا سوف تحتوي على GFP+ إشارة.
    1. قم بإزالة أليكوت صغير من ~ 10 ميكرولتر من كل عينة وقم بتجميعها في أنبوب تدفق منفصل يحتوي على 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. ضع الأنبوب على الثلج. سيتم استخدام هذا للتحكم غير الملطخ.
    2. أضف 1 مل من PBS إلى الحجم المتبقي في أنابيب العينة. جهاز طرد مركزي في 300-400 × غرام لمدة 3-5 دقائق.
    3. تحضير 200 ميكرولتر من محلول صبغة الجدوى القابل للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية لكل عينة. صبغة قابلة للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية المخففة (أعيد تعليقها في DMSO باتباع تعليمات الشركة المصنعة) 1:500 في PBS (أو باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
    4. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من محلول صبغة الجدوى القابلة للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية. دوامة الأنابيب وحضانتها في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
    5. أضف 2 مل من المخزن المؤقت FACS إلى الأنابيب لإخماد صبغة الجدوى القابلة للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية ، والدوامة لمدة 10 ثوان ، وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 300-400 × g لمدة 3-5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة من أنابيب الطرد المركزي.
    6. قم بإعداد 200 ميكرولتر من محلول كتلة Fc لكل عينة (0.25 مجم / مل من كتلة Fc في المخزن المؤقت FACS).
    7. أضف 200 ميكرولتر من محلول كتلة Fc إلى كل عينة من العينات من الخطوة 3.5.5 ، دوامة لمدة 10 ثوان ، واحتضنها في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    8. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى أنبوب تدفق جديد. قم بإزالة أليكوت 2-5 ميكرولتر من كل عينة وقم بتجميعها في الأنبوب للحصول على عناصر تحكم التألق ناقص واحد (FMO).
    9. دوامة أنبوب FMO لمدة 10 ثانية وتوزيعها بالتساوي (100 ميكرولتر لكل أنبوب) في أنابيب تدفق جديدة تحمل علامة لكل عنصر من عناصر تحكم FMO (كوكتيل النسب FMO ، CD127 FMO ، KLRG1 FMO ، NKp46 FMO ، و NK1.1 FMO ؛ انظر الجدول 3). أضف جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الذي يهم كل أنبوب (كما هو موضح في الجدول 3) والدوامة لمدة 10 ثوان. ضع عناصر تحكم FMO جانبا في الظلام عند 4 درجات مئوية.
    10. الطرد المركزي للعينات (وليس ضوابط FMO) في 300-400 × غرام لمدة 3-5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    11. تحضير ماسترميكس تلطيخ خارج الخلية (200 ميكرولتر لكل عينة) مع تخفيفات الأجسام المضادة النهائية كما هو موضح في الجدول 4. اضبط حجم التلطيخ لتركيز الخلية المناسب (حتى 5 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر) اعتمادا على عدد الخلايا من الخطوة 3.4.10.
    12. أضف ماسترميكس تلطيخ خارج الخلية إلى العينات ، دوامة لمدة 10 ثوان ، وضعها جانبا في الظلام عند 4 درجات مئوية.
    13. قم بإعداد عنصر تحكم جديد بلون واحد لكل جسم مضاد مخصص للاستخدام في استراتيجية البوابات (الشكل 2). دوامة تعويض الأجسام المضادة الخرز لمدة 20 ثانية ، إضافة قطرة واحدة من الخرز إلى أنبوب التدفق ، وصمة عار مع 0.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة (كما هو موضح في الجدول 2 ، أو باتباع تعليمات الشركة المصنعة) ، ودوامة لمدة 10 ثانية.
    14. قم بإعداد قرص قابل للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية للتحكم في لون واحد باستخدام مجموعة خرزة تعويض رد فعل أمين. دوامة حبات التعويض التفاعلية الأمينية لمدة 20 ثانية ، أضف 1 ميكرولتر من صبغة الأشعة فوق البنفسجية الحية / الميتة (كما هو موضح في الجدول 2 ، أو باتباع تعليمات الشركة المصنعة) ودوامة لمدة 10 ثوان.
    15. احتضن العينات والكائنات الحية المحورية وعناصر التحكم أحادية اللون في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    16. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد أنابيب لجمع الخلايا المفروزة. أضف 400-500 ميكرولتر من 10٪ FBS في أنابيب DMEM / F12 المتقدمة إلى 1.5 مل لكل عينة.
    17. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من PBS2 إلى كل عينة من العينات وعناصر تحكم FMO وعناصر التحكم أحادية اللون.
    18. قم بالطرد المركزي للعينات وعناصر التحكم في FMO وعناصر التحكم أحادية اللون عند 300-400 × g لمدة 3-5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    19. تخلص من السوبرناتانت من جميع أنابيب الطرد المركزي. أعد تعليق العينات وعناصر التحكم في FMO في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت ودوامة FACS لمدة 10 ثوان.
    20. أعد تعليق عناصر التحكم أحادية اللون في 250 ميكرولتر من PBS2. أضف 1 قطرة من حبات الأمين غير التفاعلية إلى صبغة قابلة للإصلاح بالأشعة فوق البنفسجية للتحكم بلون واحد فقط. دوامة جميع الضوابط لمدة 10 ثانية.
    21. الخلايا جاهزة الآن للفرز. احتفظ بالعينات وعناصر التحكم في FMO وعناصر التحكم أحادية اللون على الجليد في الظلام كلما أمكن ذلك لتحسين صلاحية الخلية ومنع فقدان الإشارة من التبييض الضوئي.

4. الزراعة المشتركة للعضويات المعوية الصغيرة مع الخلايا اللمفاوية الفطرية

ملاحظة: يصف هذا القسم الزراعة المشتركة للفئران المعوية الصغيرة ILC1 (المعزولة وفقا للبروتوكول في القسم 3) مع الفئران العضوية المعوية الصغيرة (الموضحة في القسمين 1 و 2). يجب استخدام المواد العضوية على النحو الأمثل بعد 1-2 أيام من المرور. تتضمن الزراعة المشتركة حصاد المواد العضوية ، وإضافة العدد المناسب من ILC1 ، والطرد المركزي إلى الحبيبات العضوية و ILC1 معا ، وإعادة التعليق في TBEM. أكمل هذا القسم في أقرب وقت ممكن بمجرد عزل ILC1. يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.

  1. تأكد من إذابة TBEM من الخطوة 3.1.1.
  2. حصاد المواد العضوية التي يبلغ عمرها 1-2 يوم كما هو موضح في الخطوتين 2.3 و 2.4.
  3. أعد تعليق الكريات العضوية في 1 مل من الثلج البارد البارد المتقدم DMEM/F12. لا تقم بثني طرف p1000 كما هو الحال عند تمرير المواد العضوية ، لأن القصد هنا هو الحفاظ على البنية العضوية للثقافة المشتركة. إذا لزم الأمر ، ضع المواد العضوية في أنابيب منفصلة PBS2 مغلفة بسعة 1.5 مل على الجليد لفترة قصيرة ليتم توزيعها بين ظروف الزراعة المشتركة المختلفة.
    ملاحظة: لا تبدأ في إعداد المواد العضوية إلا عندما تصبح عينات ILC جاهزة للزراعة المشتركة؛ العمل على الجليد وبسرعة بمجرد حصاد المواد العضوية لتقليل موت الخلايا الظهارية.
  4. قبل معطف أنبوب واحد 1.5 مل مع PBS2 لكل عينة ILC النسخ المتماثل. توزيع ~ 100-200 العضوية (حوالي 1 بئر من لوحة 24 بئر) في كل أنبوب.
  5. قم بتغطية طرف p1000 مسبقا في PBS2 واستخدمه لتقييم حجم ILC1s بعد تنقية FACS (250-300 ميكرولتر + حجم فرز). تحديد تركيز ILC1 لكل مل باستخدام عدد الخلايا المسجلة من الفرز وتحديد الحجم المطلوب.
  6. باستخدام نفس طرف p1000 المطلي PBS2 ، أضف ما لا يقل عن 500 ILC1s إلى أنبوب PBS2 المطلي 1.5 مل الذي يحتوي على المواد العضوية. إذا كان عدد ILC1s الناتج عن الفرز أقل من 500 ، أضف العضوي مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على النوع الأصلي لتقليل فقدان الخلايا من النقل.
  7. قم بتدوير ILC1 والمواد العضوية عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إذا كان ذلك ممكنا ، تجنب أجهزة الطرد المركزي ذات القطر الصغير على الطاولة ، لأنها ستجمع الخلايا على طول حافة الأنبوب الداخلي بدلا من إنشاء حبيبة عند طرف الأنبوب. نظرا لأن أعداد الخلايا منخفضة جدا ، فمن الضروري تقليل فقدان الخلايا أثناء هذه الخطوات.
  8. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوبرناتانت ببطء ولطف دون إزعاج الكريات (التي قد لا تكون مرئية بالعين ، خاصة في عناصر التحكم غير العضوية ILC فقط). ضع العينة على الجليد.
  9. أعد تعليق الكريات الباردة في 30 ميكرولتر لكل بئر من TBEM. أثناء حمل الأنبوب على سطح بارد (على سبيل المثال ، صندوق صغير من الثلج يوضع في غطاء محرك الأنسجة) ، امزج المواد العضوية و ILC على الأقل 10-15 مرة لضمان التوزيع المتساوي. Triturate في كثير من الأحيان ولكن بلطف ، لتجنب إتلاف المواد العضوية وتشكيل الفقاعات.
  10. ضع 30 ميكرولتر لكل بئر من ILC-organoids في TBEM على صفيحة 24 أو 48 بئرا تم تسخينها مسبقا لتشكيل قبة واحدة. ضع اللوحة مباشرة في الحاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) لمدة 10-20 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى بشدة بإعداد عناصر التحكم الخاصة ب ILC فقط وعناصر التحكم العضوية فقط للتحليل النهائي. ILC1 نادرة، ولكن يمكن استبدال GFP- ILC2 بالتألق المناعي أو ضوابط قياس التدفق الخلوي FSC/SSC عند الاقتضاء علميا.
  11. أضف 550 ميكرولتر (لكل بئر) من وسط ILC1 الكامل (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol ؛ انظر الجدول 1) مع أي سيتوكينات تجريبية مرغوبة أو أجسام مضادة مانعة وتحضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  12. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة اللوحة بلطف من الحاضنة واسمح للصفيحة بالجلوس في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 1 دقيقة لضمان استقرار الخلايا الليمفاوية.
  13. قم بإزالة 200-250 ميكرولتر من الوسائط وضعها في بئر فارغ من لوحة 24 بئرا. تحقق من هذا الفائق باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من عدم إزالة الخلايا الليمفاوية.
    1. إذا كان السوبرناتانت واضحا، أضف 300 ميكرولتر من وسيط ILC1 الطازج إلى الثقافة المشتركة في البئر الأصلي. إذا كانت الخلايا الليمفاوية موجودة في السوبرناتانت ، فإن أجهزة الطرد المركزي عند 300-400 × g لمدة 3-5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإعادة التعليق في 300 ميكرولتر من وسط ILC1 الطازج وإضافة هذا إلى 200-250 ميكرولتر المتبقية من الوسائط في البئر الأصلي. تأكد من تجديد الوسائط كل 1-2 أيام أو عندما تصبح الوسائط برتقالية شاحبة / صفراء.
      ملاحظة: لا تسمح للوسائط بالتبخر بشكل كاف بحيث يكسر طرف قبة المصفوفة سطح الوسائط. تأكد دائما من أن المصفوفة مغمورة بالكامل. يمكن تجنب التبخر الزائد باستخدام الآبار المركزية في ألواح زراعة الأنسجة وإضافة ~ 600 ميكرولتر من PBS إلى الآبار المحيطة. الثقافات المشتركة مع ILC البالغين مستقرة لمدة 1-4 أيام ، وبعد ذلك النقطة سوف تتمزق المواد العضوية التي تم زرعها دون انقطاع كبير وتعيد زرعها كسراديب جديدة. عند تحليل الظهارة ، يوصى بتحليل الثقافات في غضون 1-4 أيام من إنشاء ثقافات مشتركة.
    2. قم بإجراء تحليل المصب باستخدام التألق المناعي أو قياس التدفق الخلوي أو تنقية FACS للسكان المستهدفين في مخزن مؤقت للتحلل لتحليل التعبير الجيني بواسطة خلية واحدة أو الحمض النووي الريبي السائب أو RT-qPCR ، كما هو موضح في المرجع8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عند اكتمالها بنجاح ، يجب أن تشكل الخبايا المعزولة حديثا هياكل سرداب ناشئة في غضون 2-4 أيام (الشكل 1A). يجب أن تنمو الثقافات العضوية الصحية والقوية بنشاط ويمكن تمريرها وتوسيعها كما هو مفصل في البروتوكول.

يصف هذا البروتوكول عزل ILC1 المعوي الصغير عن خط المراسل المعدل وراثيا RORγtGFP ، والذي يسمح بعزل ILC1 الحي بواسطة FACS (الشكل 2). باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، فإن نطاق عدد ILC1 المتوقع هو 350-3500 خلية معزولة.

بعد أن يتم زرعها بالمواد العضوية ، يمكن تصور الثقافات المشتركة بواسطة الكيمياء المناعية (الشكل 3A-B). ويمكن أيضا تحليل ال ILCs والخلايا الظهارية عن طريق قياس التدفق الخلوي، كما هو موضح في الشكل 3C. ILC1 تنظيم CD44 الظهارية ، كما تتميز بقياس التدفق الخلوي (الشكل 4A-B) والكيمياء المناعية (الشكل 4C). وعلى وجه التحديد، يحفز ILC1 التعبير عن متغير الوصلة CD44 v6 في المواد العضوية، كما هو موضح في RT-qPCR (الشكل 4D).

الجدول 1: تركيبات الوسائط والمخزن المؤقت. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: عناصر التحكم أحادية اللون. تكوين ضوابط أحادية اللون لعزل صفيحة الأمعاء الدقيقة ILC1 باستخدام استراتيجية البوابات المحددة في الشكل 2. يمكن العثور على تفاصيل الأجسام المضادة المستخدمة في جدول المواد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: التألق ناقص واحد (FMO) ماسترميكس. تكوين FMO mastermixes لكوكتيل النسب FMO ، CD127 FMO ، KLRG1 FMO ، NKp46 FMO ، و NK1.1 FMO. تحتوي FMO mastermixes على جميع الأجسام المضادة المستخدمة باستثناء الأجسام المضادة ذات الأهمية وتستخدم لتلطيخ عينة aliquot. يتم تعريف كوكتيل النسب على أنه CD19 و CD3e و CD5 و Ly-6G / Ly-6C. يمكن العثور على تفاصيل الأجسام المضادة المستخدمة في جدول المواد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: ماسترميكس تلطيخ خارج الخلية. يتم ضبط التركيزات لتلطيخ ما يصل إلى 5 × 106 خلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. يمكن العثور على تفاصيل الأجسام المضادة المستخدمة في جدول المواد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Figure 1
الشكل 1: مورين العضوية المعوية الصغيرة. صورة تمثيلية ل (أ) ولدت بنجاح المواد العضوية المعوية الصغيرة 2-3 أيام بعد المرور و (ب) ثقافة غير ناجحة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: استراتيجية البوابات لعزل ILC1s عن صفيحة الأمعاء الدقيقة للفئران المراسلة RORγtGFP المعدلة وراثيا. مخطط التدفق الخلوي التمثيلي لعزل ILC1 من الأمعاء الدقيقة الصفيحة propria لفئران مراسل RORγtGFP المعدلة وراثيا بواسطة FACS. يتم تعريف ILC1s على أنها حية ، CD45 + ، Lin- (CD3 ، CD5 ، CD19 ، Ly6C) ، CD127 + ، KLRG1-، RORγt-، NKp46 + ، و NK1.1 +. ممثل من N = >50 الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الثقافات المشتركة بين العضوية و ILC1. صور المجال الساطع (A) ، وصور المجهر البؤري (B) ، ومخططات FACS (C) للعضويات المعوية الصغيرة (SIO) المستزرعة وحدها (أعلى) أو مع ILC1s (أسفل) (تمثل التجارب مع ILC1s من N = 3 فئران). (ب) يوضح التلطيخ باستخدام CD45 ILC1s و Zonula occludens protein 1 (ZO-1) علامات الخلايا الظهارية في المواد العضوية. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر (C) كانت مسورة سابقا على خلايا حية مفردة. يشير جزيء الالتصاق الخلوي الظهاري (EpCAM) إلى الخلايا الظهارية المعوية (IEC) في المواد العضوية وعلامات CD45 ILC1s. وهذا الشكل مقتبس من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ILC1s في الزراعة المشتركة مع المواد العضوية المعوية الصغيرة تدفع إلى تنظيم CD44 في الخلايا الظهارية المعوية. (أ) مخطط خلوي تمثيلي لتعبير CD44 في جزيء الالتصاق الخلوي الظهاري (EpCAM) الخلايا الظهارية الإيجابية (الحية ، CD45-، EpCAM +) من المواد العضوية المعوية الصغيرة (SIO) المستزرعة بمفردها (يسار) أو مع ILC1s لمدة 4 أيام (يمين). (ب) تحديد كمية التدفق لتعبير CD44 في الخلايا الظهارية المعوية (IEC) (ILC1s من N = 5 فئران). (ج) صورة مجهرية تمثيلية متحدة البؤرة لتوطين CD44 في d4 SIO وحده (يسار) أو مستزرعة مع ILC1s (يمين) (ممثلة N = 3 فئران). أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر (D) RT-qPCR مع الاشعال الخاصة بالإكسون لمتغيرات لصق CD44 v4 و v6 (N = 3). وهذا الرقم مقتبس من المرجع8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طرق إنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل ILC1 النادر عن طريق تقليل فقدان الخلايا الليمفاوية أثناء بروتوكول التفكك المعوي ، وإنشاء ثقافات مشتركة بين هاتين المقصورتين. هناك العديد من الخطوات لهذا البروتوكول ، وفي حين أن بعضها خاص ب ILC1s ، يمكن تطبيق هذا النهج على أنواع الخلايا المناعية المعوية الأخرى ، ويمكن تكييف إعدادات الزراعة المشتركة بشكل معياري لتناسب أسئلة البحث الفردية. يتم تسليط الضوء هنا على العديد من الخطوات الحاسمة (التي يوصى بعدم الانحراف عنها) ، بالإضافة إلى إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها للعناصر الأكثر تحديا تقنيا في هذا البروتوكول.

أصبح استخدام الفئران العضوية المعوية الصغيرة من الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 + -eGFP الواحدة راسخا بشكل متزايد33,34 ؛ ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، يقترح عزل سراديب Lieberkuehn الكاملة سليمة عن CD45.1. لا تتعافى الخبايا السليمة بسرعة أكبر من خلايا Lgr5+ المفردة فحسب ، بل إن استخدام CD45.1 بدون مراسل GFP يضمن عدم تحليل CD45.2 + ILC الملوث من الثقافات العضوية المشتركة وهو متوافق مع استخدام الخلايا المناعية التي تحتوي على مراسل يستند إلى GFP. في تجربة المؤلفين ، لا توجد خلايا وسيطة أو مناعية تنتقل بعد 1-3 مقاطع من المواد العضوية. وبالتالي فإن استخدام CD45.2 أو الحيوانات الأخرى لإنشاء المواد العضوية مقبول تماما. أثناء إنشاء العضوية ، إذا لم تكن الخبايا موجودة في الخطوة 1.1.19 ، فقد يكون من الضروري إجراء اهتزاز يدوي أكثر صرامة لإزاحة الخبايا السليمة. قد تضيف العوامل البيئية مثل درجة حرارة الغرفة المحيطة (على سبيل المثال ، ما إذا كان الإجراء يتم تنفيذه في الصيف أو الشتاء) بعض التباين إلى أوقات الحضانة أثناء الانفصال. ستؤثر كثافة البذر للسراديب على عائد التكوين العضوي الأولي ؛ لذلك يوصى بزرع ما لا يقل عن كثافتين مختلفتين لضمان النجاح (على سبيل المثال ، 200-750 المقترحة هنا ، ولكن يمكن تكييف هذا النطاق بناء على الاحتياجات الفردية).

بمجرد تأسيسها ، تكون الثقافات العضوية المعوية غير متجانسة بين الخطوط التي تم إنشاؤها من نفس سلالة الفأر ، على طول الجهاز الهضمي (على سبيل المثال ، الاثني عشر مقابل الدقاق) ، وحتى داخل نفس البئر من الثقافات العضوية35,36. على الرغم من أن هذا البروتوكول وجد أنه قوي على العديد من الدفعات المختلفة من المواد العضوية ، إلا أن عدم التجانس هذا يمكن أن يساهم في تباين البيانات. من الممارسات الجيدة أن تكون متسقة مع الصيانة العضوية (المرور وتغييرات الوسائط) لتقليل الضوضاء التقنية من البيانات غير ذات الصلة ظاهريا. ويشمل ذلك أن تكون متسقة مع الجدول الزمني لمرور ما قبل البذر ومع القوة المستخدمة لفصل المواد العضوية. ويوصى أيضا باستخدام نفس المصفوفة القاعدية للتجارب التي تجري مقارنتها، ولإجراء التجارب باستخدام النسخ البيولوجية المتماثلة للعضويات المشتقة من مختلفة (عندما يكون ذلك ممكنا ماليا وتقنيا) لضمان أن تكون النتائج قابلة للتكرار بقوة.

عند إنشاء ثقافات مشتركة ، تعد نسبة الخلايا المناعية إلى الخلايا الظهارية اعتبارا حاسما يتطلب التحسين بناء على أسئلة البحث. وإذا كان يجري التحقيق في تأثير الخلايا الظهارية على لجنة القانون الدولي، فإن عدد المواد العضوية المزروعة يجب أن يكون كافيا لتشبع جميع هذه الخلايا. وعلى العكس من ذلك، عند تقييم أثر لجنة القانون الدولي على الظهارة، قد تؤدي النسب المختلفة بين لجنة القانون الدولي/الظهارة إلى نواتج مظهرية مختلفة، مما يعكس الحالات التفاضلية لإثراء المجموعة الفرعية للجنة القانون الدولي في الغشاء المخاطي. يتم الحفاظ على صلاحية ILC1 بشكل جيد في الثقافة ، وسيخضع السكان لتوسع طفيف ، مع حوالي 500 ILC1 و 100 من المواد العضوية المعوية الصغيرة (SIO) التي تخضع لتوسع 2-3 أضعاف في المتوسط. ومع ذلك ، سيتأثر هذا العائد بعلاجات إضافية ، مع تحسين تحييد TGF وتثبيط p38 لتقليل العدد المطلق ل ILC1 بعد الزراعة المشتركة8. قد تكون أي خسارة غير متوقعة لأكثر من 50٪ من أرقام ILC1 البذرية ناتجة إما عن نسبة غير متوازنة من ILC1 إلى SIO (زيادة عدد الخبايا المزروعة) ، أو تلوث SIO (ضمان عمل كوكتيل المضادات الحيوية واختبار supernatant للميكوبلازما) ، أو لمشاكل الجودة في مخزونات السيتوكين ، مع حساسية ILC1 بشكل خاص لعدم وجود IL-2 أو IL-15. تم استخدام المواد الفائقة للزراعة المشتركة من لوحات 96 أو 48 بئرا المركزة بنجاح في ELISAs. عند فصل الثقافات المشتركة ، يوصى باحتضان الخلايا باستخدام DNase بعد استبدال التربسين اللطيف لمدة 20 دقيقة أو إجراء التفكك القائم على EDTA إلى خلايا مفردة لمنع تكتل الخلايا من الخلايا الظهارية التالفة.

تكمن قوة هذا البروتوكول في أنه يوازن بين ظروف الثقافة الاختزالية وأنواع الخلايا المعقدة. ومع ذلك، قد تعتمد سلوكيات المجموعات الفرعية الأخرى التابعة للجنة القانون الدولي في هذه الثقافات على عوامل غير موجودة في هذا البروتوكول بالذات. على سبيل المثال، في بروتوكول ليندمانز المستخدم في الثقافات المشتركة ل ILC3، تم استكمال IL-23 بالإضافة إلى ذلك في وسائط الثقافة المشتركة لدعم صيانة ILC3 وتنشيطه8. وتبين أن IL-15 يكتسي أهمية خاصة في الحفاظ على ILC1 في نظام الزراعة المشتركة الموصوف في هذا البروتوكول، والذي كان متوافقا مع التقارير السابقة ل ILC1 التي تتطلب هذا السيتوكين لتحقيق التوازن، وإن لم يكن للتنمية6. لتنشيط ILC ، أو للحفاظ على ILC2s ، قد يتطلب وسيط النمو مزيدا من التحسين. وعلاوة على ذلك، فإن المقصورات الخلوية الأخرى في الأمعاء، إلى جانب الظهارة، تنظم المجتمعات الأصلية والمحلية. على سبيل المثال ، من المعروف أن الخلايا العصبية المعوية تعدل ILC2s جزئيا من خلال نشاط الببتيدات العصبية المفرزة37. تؤثر العوامل الميكروبية أيضا على النمط الظاهريILC 38. ويمكن التغلب على هذا القيد من خلال إضافة هذه العناصر، مثل السيتوكينات أو الببتيدات أو العوامل الميكروبية، إلى نظام الزراعة المشتركة. بل إن هذا يمكن أن يسمح باستجواب التفاعل بين المجتمعات الأصلية والمحلية ومقصورات خلوية متعددة في إطار اختزالي. وفقا لهذا المنطق ، من الأهمية بمكان إضافة كواشف مضادة للمضادات الحيوية / المضادة للفطريات وتجديدها بشكل متكرر إلى الوسائط العضوية قبل إنشاء ثقافات مشتركة. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يتم إجراء جميع الثقافات في بيئات معقمة لأن أي تلوث للاستزراع (مثل النمو الفطري أو الميكوبلازما) من المرجح أن ينشط المستضد غير المحدد للمجتمعات الأصلية والمحلية، مما يخلق أنماطا ظاهرية هامة قد لا تكون موجودة في الثقافات غير الملوثة. ولهذا السبب، لا ينصح بسحب الكواشف المضادة للمضادات الحيوية/الفطريات، حتى في الثقافات المشتركة، حيث لم يتبين أنها تسبب أثرا ضارا على الظهارة أو المجتمعات الأصلية والمحلية.

وتوفر هذه الطريقة طريقة فريدة لتوصيف وحدات التشوير بين المجتمعات الأصلية والمحلية والظهارة المعوية، مما يسمح بالتحقيق في بيولوجيا كلا المقصورتين. بالمقارنة مع الطرق الأخرى في المختبر التي تتكون من نوع خلية واحدة ، فإن النظام المعروض هنا أكثر قابلية للمقارنة مع فسيولوجيا الجسم الحي ويتيح استجواب آليات إشارات محتملة متعددة بين الخلايا الظهارية و ILCs. تعتمد الطرق الأخرى لزراعة ILC في المختبر في الغالب على خطوط خلايا التغذية اللحمية ، مثل OP9 أو OP9-DL139. هذا الخط مشتق من كالفاريا الفأر حديثي الولادة ، والتي لا تمثل البيئة المعوية. وفي حين أن هذه التدابير وفرت المعيار الذهبي للحفاظ على المجتمعات الأصلية والمحلية في المختبر حتى الآن، فإنها تعاني من قيود كبيرة في تطبيقها على فهم أثر هذه الاتفاقية على الظهارة.

بروتوكول الزراعة المشتركة الموصوف هنا بين الفئران العضوية المعوية الصغيرة و الصفيحة بروبريا المشتقة من ILCs له تطبيقات بحثية مهمة. وقد تم بالفعل استخدام هذا النظام من الثقافة المشتركة لتحديد دور ILC1 المشتق من TGF-β في توسيع الخبايا الظهارية CD44 + 8 ، مما يساهم في فهم الديناميكيات الظهارية في مرض التهاب الأمعاء. تساهم هذه الدراسات في مجموعة متزايدة من الأدبيات التي تدعم الأهمية الحاسمة لإشارات ILC الظهارية في التوازن المعوي والالتهاب3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يعترف E.R. بزمالة الدكتوراه من Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). تعترف G.M.J. بزمالة الدكتوراه من Wellcome Trust (203757/Z/16/A). تعترف العاصمة بحصولها على درجة الدكتوراه من المعهد الوطني لحقوق الإنسان GST BRC. تعترف J.F.N. بزمالة Marie Skłodowska-Curie ، وزمالة King's Prize ، وزمالة RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812/1) ، وجائزة البذور في العلوم من Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). كما نشكر الفريق الأساسي لقياس التدفق الخلوي BRC ومقره في مستشفى غاي. كانت الفئران الصحفية Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 هدية سخية من G. Eberl (معهد باستور، باريس، فرنسا). CD45.1 C57BL/6 تم تقديم الفئران من قبل T. Lawrence (King's College London ، لندن) و P. Barral (King's College London ، لندن).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 181،
المشاركة في زراعة الأعضاء الظهارية في الأمعاء الدقيقة الفئرانية مع الخلايا اللمفاوية الفطرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter