Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол предлагает подробные инструкции по созданию органоидов тонкой кишки мышей, выделению врожденных лимфоидных клеток типа 1 из мышиной тонкой кишки lamina propria и созданию 3-мерных (3D) кокультур между обоими типами клеток для изучения двунаправленных взаимодействий между эпителиальными клетками кишечника и врожденными лимфоидными клетками типа 1.

Abstract

Сложные кокультуры органоидов с иммунными клетками обеспечивают универсальный инструмент для опроса о двунаправленных взаимодействиях, которые лежат в основе тонкого баланса гомеостаза слизистой оболочки. Эти 3D, многоклеточные системы предлагают редукционистскую модель для решения многофакторных заболеваний и разрешения технических трудностей, возникающих при изучении редких типов клеток, таких как ткане-резидентные врожденные лимфоидные клетки (ILC). В этой статье описывается мышиная система, которая сочетает в себе органоиды тонкой кишки и lamina propria тонкой кишки, полученные из хелпероподобных ILC типа 1 (ILC1), которые могут быть легко распространены на другие ILC или иммунные популяции. ILC - это популяция, проживающая в тканях, которая особенно обогащена слизистой оболочкой, где они способствуют гомеостазу и быстро реагируют на повреждение или инфекцию. Органоидные кокультуры с ILC уже начали проливать свет на новые эпителиально-иммунные сигнальные модули в кишечнике, показывая, как различные подмножества ILC влияют на целостность и регенерацию кишечного эпителиального барьера. Этот протокол позволит продолжить исследования взаимных взаимодействий между эпителиальными и иммунными клетками, которые могут обеспечить новое понимание механизмов гомеостаза слизистой оболочки и воспаления.

Introduction

Связь между кишечным эпителием и кишечно-резидентной иммунной системой занимает центральное место в поддержании кишечного гомеостаза1. Нарушения этих взаимодействий связаны как с местными, так и с системными заболеваниями, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и рак желудочно-кишечного тракта2. Примечательным примером одного недавно описанного критического регулятора гомеостаза является исследование врожденных лимфоидных клеток (ILC), которые стали ключевыми игроками в кишечном иммунном ландшафте3. ILC представляют собой группу гетерогенных врожденных иммунных клеток, которые регулируют гомеостаз кишечника и организуют воспаление в основном через цитокин-опосредованную сигнализацию4.

Мышиные ILC широко делятся на подтипы на основе транскрипционного фактора, рецептора и профилей экспрессии цитокинов5. ILC типа-1, которые включают цитотоксические естественные киллерные (NK) клетки и хелпероподобные ILC типа 1 (ILC1s), определяются экспрессией транскрипционного фактора (эомезодермина) Эомса и белка Т-бокса, экспрессируемого в Т-клетках (T-bet)6, соответственно, и секретируют цитокины, связанные с иммунитетом Т-хелпера типа 1 (TH1): интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), в ответ на интерлейкин (IL)-12, Ил-15 и Ил-187. Во время гомеостаза тканевые резиденты ILC1 секретируют трансформирующий фактор роста β (TGF-β), чтобы стимулировать пролиферацию эпителия и ремоделированиематрицы 8. ILC типа 2 (ILC2s) в первую очередь реагируют на гельминтную инфекцию через секрецию цитокинов, ассоциированных с T-хелпером типа 2 (TH2): IL-4, IL-5 и IL-13, и характеризуются экспрессией ретиноевой кислоты, связанной с орфанным рецептором (ROR) α (ROR-α)9 и GATA-связывающим белком 3 (GATA-3)10,11,12 . У мышей кишечные «воспалительные» ILC2 дополнительно характеризуются экспрессией лектин-подобного рецептора клеток-киллеров (подсемейство G-член 1, KLRG)13, где они реагируют на эпителиальный пучко-клеточный IL-2514,15. Наконец, ILC типа 3, которые включают клетки индуктора лимфоидной ткани и хелпероподобные ILC типа 3 (ILC3s), зависят от транскрипционного фактора ROR-γt16 и группируются в группы, которые секретируют либо гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IL-17 или IL-22 в ответ на местные сигналы IL-1β и IL-2317. Клетки-индукторы лимфоидной ткани группируются в пятнах Пейера и имеют решающее значение для развития этих вторичных лимфоидных органов во время развития18, тогда как ILC3s являются наиболее распространенным подтипом ILC во взрослой мочевой тонкой кишке lamina propria. Одна из самых ранних мышиных кишечных органоидных кокультурных систем с ILC3s была использована для того, чтобы отделить влияние цитокина IL-22 на сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3 (STAT-3), опосредованный лейцин-богатым повторением, содержащим рецептор, связанный с G-белком, 5 (Lgr5) + пролиферацию кишечных стволовых клеток19, мощный пример регенеративного ILC-эпителиального взаимодействия. ILC проявляют импринт-гетерогенность между органами 20,21 и проявляют пластичность между подмножествами в ответ на поляризующие цитокины22. То, что движет этими тканеспецифическими отпечатками и различиями в пластичности, и какую роль они играют в хронических заболеваниях, таких как ВЗК23, остаются захватывающими темами, которые могут быть решены с использованием органоидных кокультур.

Кишечные органоиды стали успешной и надежной моделью для изучения кишечного эпителия24,25. Они генерируются культивированием эпителиальных стволовых клеток Lgr5+ или целых изолированных крипт, которые включают клетки Paneth в качестве эндогенного источника члена семейства Wnt 3A (Wnt3a). Эти 3D-структуры поддерживаются либо в синтетических гидрогелях26, либо в биоматериалах, которые имитируют базальную lamina propria, например, термосшивающий базальный внеклеточный матрикс (TBEM), и дополнительно дополняются факторами роста, которые имитируют окружающую нишу, в первую очередь эпителиальным фактором роста (EGF), ингибитором костного морфогенетического белка (BMP) Ноггином и Lgr5-лигандом и Wnt-агонистом R-Spondin127. . В этих условиях органоиды сохраняют эпителиальную апико-базальную полярность и рекапитулируют крипто-ворсинчатую структуру кишечного эпителия с почковыми криптами стволовых клеток, которые терминально дифференцируются в абсорбирующие и секреторные клетки в центре органоида, которые затем сбрасываются во внутренний псевдолюменаноикисом 28. Хотя одни только кишечные органоиды были чрезвычайно выгодны в качестве редукционистских моделей развития и динамики эпителия в изоляции29,30, они обладают огромным будущим потенциалом для понимания того, как это поведение регулируется, влияет или даже нарушается иммунным компартментом.

В следующем протоколе описан метод кокультурирования между мышиными тонкокишечными органоидами и ILC1, полученными из lamina propria, который недавно был использован для определения того, как эта популяция неожиданно уменьшает кишечные сигнатуры воспаления и вместо этого способствует увеличению эпителиальной пролиферации через TGF-β в этой системе8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты должны быть завершены в соответствии и с соблюдением всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов для использования животных. Этическое одобрение для исследования, описанного в следующей статье и видео, было получено в соответствии и соответствии со всеми соответствующими нормативными и институциональными руководящими принципами для использования животных.

Все мыши были выбракованы путем вывиха шейки матки в соответствии со стандартной этической процедурой, проведенной обученными особями. Перед извлечением органов и тканей в качестве подтверждающих оценок смерти проводилось перерезание бедренной артерии или обезглавливание (в соответствии с имеющимся протоколом). Животные содержались в определенных условиях, свободных от патогенов (если не указано иное) в аккредитованном коммерческом подразделении и подразделении животных Королевского колледжа Лондона в соответствии с Законом Великобритании о животных (научные процедуры) 1986 года (лицензия на проект Министерства внутренних дел Великобритании (PPL: 70/7869 до сентября 2018 года; P9720273E от сентября 2018 года).

1. Создание органоидов тонкого кишечника у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается генерация кишечных органоидов из тонкой кишки мышей. Крипты сначала выделяют из ткани, повторно суспендируют в TBEM, а затем инкубируют со средами, содержащими EGF, Noggin и R-Spondin (ENR). Установление органоидов тонкого кишечника мышей также было хорошо описано в других местах 24,25,27.

  1. Поместите TBEM на лед для оттаивания (40 мкл/ лунка) и поместите стандартную тканевую культуру, обработанную (имеется в виду пластины с гидрофильной и отрицательно заряженной поверхностью) 24-луночную пластину в инкубатор с температурой 37 °C для предварительного нагрева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл TBEM оттаивают примерно через 2-4 ч; не оставляйте его при комнатной температуре.
  2. Приготовьте ~4 мл или 550 мл на лунку среды ENR, добавив eGF, Noggin и R-спондин в базальную среду (таблица 1) и поместите в инкубатор при температуре 37 °C.
  3. Выбраковьте 6-12-недельное животное и рассекните тонкую кишку с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц. Поместите его в 15 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) на льду.
  4. Используя желудок и белую кишку в качестве точек ориентации, выделяют нужную область тонкой кишки (двенадцатиперстную кишку, тощую кишку или подвздошную кишку). В этом протоколе подвздошная кишка изолирована.
  5. Погрузите кишечник в PBS на чашку Петриразмером 10 см2 на льду. Используя щипцы, удалите жир осторожно, но полностью, из кишечника.
  6. Разрезайте ткань продольно с помощью микродиссекционных ножниц (желательно с закругленными кончиками, чтобы избежать перфорации). Удерживая кишечник погруженным в PBS, встряхните, чтобы удалить фекалии, и поддерживайте слизистую сторону вверх, чтобы отслеживать ориентацию тканей.
  7. Перенесите ткань в сухую крышку чашки Петри на льду, поместив слизистую/ворсинки кишечника стороной вверх. Удерживая один конец кишечника щипцами, аккуратно соскоблите слизь с помощью углового края чистого стеклянного предметного стекла.
  8. Наполните тарелку ледяным PBS и промойте ткань.
  9. Предварительно покройте трубку объемом 50 мл PBS2 (PBS + 2% FCS; см. Таблицу 1) для предотвращения адгезии ткани к пластику и добавьте в эту трубку 10 мл ледяного PBS. Разрежьте кишечник на мелкие (~2 мм) сегменты и переложите их в пробирку объемом 50 мл, предварительно покрытую PBS2.
  10. Используя пипетку объемом 25 мл, предварительно покрытую PBS2, пипетку сегментов вверх и вниз 5-10 раз для очистки фрагментов ткани.
  11. Дайте сегментам освоиться в течение 15-30 с, удалите и выбросьте супернатант PBS и повторяйте шаги 1.10 и 1.11 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (примерно 3-4 раза).
  12. Позвольте сегментам оседать и отбрасывать супернатант PBS. Добавить 30 мл буфера изоляции ледяного крипта (таблица 1).
  13. Поместите трубки на горизонтальный ролик или коромысло при 30-60 об/мин (или мягко) в течение 30 мин при 4 °C. Не инкубируйте на более высоких скоростях, более высоких температурах или большей продолжительности, так как крипты преждевременно вытеснятся и станут одиночными клетками с более низкой жизнеспособностью и выходом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов.
  14. Дайте сегментам кишечника осесть у основания трубки объемом 50 мл. Снимите буфер изоляции крипты, не нарушая осевшие сегменты, и перенесите его в 50-литровую трубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если процесс изоляции крипты был слишком строгим, крипты могут быть замечены в этой фракции. Поэтому он может быть сохранен в качестве резерва, но оптимально будет выброшен в конце протокола.
  15. Добавьте 20 мл ледяного PBS в сегменты кишечника. Используя пипетку объемом 25 мл, предварительно покрытую PBS2, кишечные сегменты пипетки поднимаются и опускаются в 5-8 раз.
  16. Пусть сегменты осядут в течение 30 с. Предварительно покройте трубку объемом 50 мл и пипетку 25 мл PBS2. Используя эту пипетку, соберите супернатант (фракция 1) в предварительно покрытую трубку объемом 50 мл и поместите трубку на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фракция служит для смывания оставшегося буфера изоляции крипты. Однако он также служит дополнительным этапом контроля качества; если пипетка была слишком энергичной, склепы будут в изобилии в этой фракции промывки, а если она была слишком мягкой, в этой фракции будет очень мало мусора. Оптимально, фракция 1 отбрасывается в конце протокола, но она может быть использована для изготовления органоидов, если возникают проблемы с фракциями 2-4, полученными ниже.
  17. Повторите шаги 1,15 и 1,16, но добавьте 10 мл ледяного PBS, а не 20 мл, и поместите супернатант в свежую трубку объемом 50 мл, предварительно покрытую PBS2 (фракция 2).
  18. Повторите шаг 1.17 еще дважды, но объедините полученный супернатант с фракцией 2 (в ту же пробирку объемом 50 мл из шага 1.17) для получения фракций 2-4. Эта единственная трубка объемом 50 мл должна содержать смещенные крипты в 30 мл ледяного PBS.
  19. Извлеките аликвоту объемом 50 мкл из объединенных 2-4 фракций и поместите ее на крышку. Оцените наличие эпителиальных крипт с помощью инвертированного светового микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если крипты отсутствуют, повторите шаги 1.17 и 1.18, используя больше силы во время пипетки, пока крипты не будут освобождены. Убедитесь, что крипты не были преждевременно перемещены в буфер изоляции крипты с шага 1.14 или во фракции 1 из шага 1.16.
  20. Предварительно покройте сетчатый фильтр 100 мкм и трубку объемом 50 мл PBS2. Пропустите объединенные фракции крипты через это ситечко и в предварительно покрытую 50 мл трубку.
  21. Открутите растянутые фракции крипты при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  22. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте крипты в 10 мл ледяного Advanced DMEM/F12. Переместите крипты в трубку объемом 15 мл.
  23. Откручивайте крипты при 210 х г в течение 5 мин при 4 °C для удаления одиночных клеток и лимфоцитов.
  24. Повторное суспендирование крипт в 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12.
  25. Извлеките аликвоту объемом 10 мкл и поместите ее на крышку. Используя инвертированный световой микроскоп, подсчитайте количество крипт, чтобы определить концентрацию крипты.
  26. Рассчитайте объем, необходимый для ~400 и ~1 500 крипт. Предварительно покройте наконечник p1000 PBS2 и используйте этот наконечник для пипсирования необходимых объемов (содержащих ~ 400 и ~ 1 500 крипт) в отдельные трубки объемом 1,5 мл.
  27. Раскрутите склепы при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  28. Удалите как можно больше супернатанта, а затем повторно суспендируйте крипты в 80 мкл TBEM, помещенного на лед (предварительно охлаждайте кончики пипеток при 4 °C, чтобы предотвратить гелеобразование матрицы, которое происходит при 12 °C).
  29. Извлеките из инкубатора 24-луночную пластину, помещенную на этапе 1.1. Аккуратно пипетки 40 мкл крипт в центр колодца медленным круговым движением, чтобы сформировать плоскую, но 3D-структуру купола, или в три отдельных небольших купола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность органоидов является самой низкой в центре купола, где питательные вещества и газы проникают менее эффективно31; таким образом, максимизация площади поверхности, подвергаемой воздействию среды, при сохранении четких 3D-структур имеет решающее значение.
  30. Повторите шаг 1.29, чтобы создать в общей сложности две скважины с плотностью ~200 крипт на скважину и еще две скважины с плотностью ~750 крипт на скважину. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C и 5% CO2) на 15-20 минут, заботясь о том, чтобы не нарушить вязкие, но все еще жидкие матричные купола.
  31. Добавьте 550 мкл предварительно нагретой среды ENR на лунку (начиная со стадии 1.2) и инкубируйте в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO2. На этом этапе предлагается дополнить среду ENR 5 мкМ агониста Wnt (CHIR 99021) и ингибитором Rho киназы 5 мкМ (Y-27632) в течение первых 24 ч культуры после изоляции для повышения выхода и эффективности органоидной генерации только что выделенных из ткани крипт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крипты должны закрываться к образованию округлых структур в течение 24 ч, а крипты должны появиться в течение 2-4 дней (рисунок 1А).
  32. Замените свежей средой ENR в конце инкубации на этапе 1.31, а затем каждые ~2 дня или когда показатель рН фенола в культуральной среде становится бледно-оранжевым, но до того, как он станет желтым.

2. Поддержание органоидов тонкого кишечника мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола описывает поддержание и прохождение органоидов тонкого кишечника мышей. Органоиды сначала извлекают, а затем механически разрушают с помощью изогнутого наконечника p1000. Этот процесс разрушает крупные органоиды, состоящие из многочисленных крипт, на несколько более мелких фрагментов для расширения и высвобождает мертвые клетки, которые накопились в псевдолюмене. Поддержание органоидов в тонком кишечнике мышей также было хорошо описано в других местах 24,25,27. Все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов. Прохождение или расширение органоидов один раз в 4-5 дней, прежде чем происходит разрыв органоидов от существенного скопления мусора в просвете органоида. Органоиды могут проходить в соотношении 1:2-1:3 в зависимости от плотности органоидов, которая оптимально составит от 100 до 200 органоидов на лунку.

  1. Как и на этапах 1.1 и 1.2, разморозьте TBEM на льду (40 мкл/лунку) и получите среду ENR (550 мкл на скважину). Поместите среду и стандартную культуру тканей, обработанную 24-луночной пластиной, в инкубатор с температурой 37 °C.
  2. Извлеките пластинку, содержащую органоиды, из инкубатора. Выбросьте носитель из колодца, который нужно пройти.
  3. Добавьте в скважину 500 мкл ледяного Advanced DMEM/F12. Используя наконечник p1000 (предварительно покрытый средой, чтобы избежать прилипания органоида к внутренней части кончика), извлеките органоиды в трубку объемом 15 мл.
  4. Промыть дно скважины 250-300 мкл ледяного Advanced DMEM/F12, гарантируя, что в скважине не останется органоидов, и поместить в трубку объемом 15 мл, содержащую извлеченные органоиды из шага 2.3. Повторите шаги 2.3 и 2.4 при прохождении нескольких скважин и объединении органоидов из нескольких скважин в одну и ту же трубу объемом 15 мл.
  5. Отращивание органоидов при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  6. При центрифугировании убедитесь, что есть четыре видимые фракции: базовая фракция со здоровыми органоидами, центральная и прозрачная матричная фракция, матричная фракция, содержащая одиночные и мертвые клетки, и верхний надводный слой, содержащий одиночные и мертвые клетки. Удалите супернатант, фракцию мусора и как можно больше прозрачного фрагмента матрицы, не нарушая гранулы органоидов.
  7. Аккуратно согните наконечник наконечника пипетки p1000 (примерно 2-5 мм). Предварительно покройте этот наконечник в PBS2 или Advanced DMEM/F12. Используя этот наконечник, пипетка органоидов вверх и вниз 10-20 раз, чтобы механически нарушить органоиды и оставшийся матрикс.
  8. Открутите при 210 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  9. Как и на этапе 2.6, удалите супернатант, фракцию мусора и как можно больше прозрачного фрагмента матрицы, не нарушая гранулы диссоциированных крипт. Если здоровые крипты или мелкие органоиды не образовали прозрачную гранулу, центрифугируют снова при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C.
  10. Рассчитайте необходимый объем TBEM (80-120 мкл на лунку извлеченных органоидов в зависимости от того, используется ли соотношение прохождения 1:2 или 1:3).
  11. Повторно суспендировать гранулу в расчетном объеме TBEM и приложить 40 мкл на скважину к предварительно нагретой 24-луночной плите для формирования купола. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% CO2) на 15-20 мин.
  12. Добавьте 550 мкл среды ENR на лунку и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. Проверьте культуры на органоидное образование через 24 ч. Заменяйте на свежий носитель ENR каждые 2-3 дня после прохождения.

3. Выделение тонкокишечных lamina propria врожденных лимфоидных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается выделение ILC1 из мышиной тонкой кишки lamina propria мышей-репортеров RORγtGFP. Это включает в себя удаление эпителиальных клеток, переваривание тканей, разделение лимфоцитов с градиентом плотности и выделение ILC1 с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Изоляция FACS в соответствии со стратегией гастинга , показанной на рисунке 2 , требует установки внеклеточного окрашивания (Таблица 4) с дополнительными элементами управления окрашиванием, описанными в Таблице 2 и Таблице 3 для машины (Таблица 2) и затвора (Таблица 3). Репортерные мыши RORγtGFP используются для изоляции живого, чистого ILC1 и выхода RORγtGFP+ ILC3. Обработка тканей для выделения лимфоцитов lamina propria также была хорошо описана в другом месте32.

  1. Обработка тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань из отдельных биологических реплик животных хранится отдельно в этом протоколе. Эти образцы должны быть надлежащим образом маркированы и храниться на льду, когда это возможно. Всем реагентам, кроме ферментов пищеварения, следует дать достичь комнатной температуры, чтобы обеспечить быстрое переваривание тканей.
    1. Поместите TBEM на лед для оттаивания (40 мкл/лунка). Держите стандартную тканевую культуру, обработанную 24-луночной пластиной, в инкубаторе с температурой 37 °C до предварительного нагрева.
    2. Готовят свежий буфер удаления эпителия и буфер пищеварения (см. табл. 1). Готовят изотонную среду градиента низкой вязкости плотности (LVDGM) (90% LVDGM и 10% 10x PBS), 40% изотоническую LVDGM и 80% изотоническую LVDGM в нейтрализующем буфере (таблица 1).
    3. Выбраковьте 6-12-недельное животное, рассекните тонкую кишку с помощью щипцов и микродиссекционных ножниц и поместите кишечник в 15 мл PBS на льду.
    4. Погрузите кишечник в PBS на чашку Петри размером 10см2 на льду и используйте щипцы, чтобы мягко, но полностью удалить жир из кишечника.
    5. Удалите пластыри Пейера (~5-10; проходят по линии, противоположной линии жировой ткани) с помощью микродиссекционных ножниц для истощения индукторных клеток лимфоидной ткани и В-клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пятна Пейера отсутствуют у Rag-/- и других животных, истощенных линией. В отличие от пузырьков воздуха, пятна Пейера останутся на месте, если их подтолкнуть.
    6. Разрезайте ткань продольно с помощью микродиссекционных ножниц (желательно с закругленными кончиками, чтобы избежать перфорации). Удерживая кишечник погруженным в PBS, встряхните, чтобы удалить фекалии.
    7. Разрежьте ткань на кусочки длиной 2-4 см и переложите их в тюбик объемом 50 мл.
    8. Добавьте примерно 20-40 мл ледяного PBS и энергично встряхивайте в течение 5-15 с, чтобы удалить слизь и мусор.
    9. Выбросьте содержимое трубки на свежую чашку Петри и замените кишечные фрагменты в ту же трубку объемом 50 мл с помощью щипцов.
    10. Повторите шаги 3.1.8 и 3.1.9 3-4 раза или до тех пор, пока PBS не станет ясным.
  2. Удаление эпителия
    1. Поместите фрагменты кишечника в свежую чашку Петри на льду. С помощью щипцов подберите сегменты кишечника и удалите лишнюю жидкость, постукивая по сухой поверхности.
    2. Разрежьте ткань на ~0,75-1 см кусочки и переложите их в свежий тюбик объемом 50 мл. Добавьте 5-7 мл буфера эпителиального удаления (таблица 1). Вихрь трубки и убедитесь, что все сегменты кишечника погружены в буфер.
    3. Инкубировать образцы при 37 °C с раскачиванием (100-150 об/мин) в течение 12-15 мин. Вихрь трубки в течение 20-30 с.
    4. Повторите шаги 3.2.1-3.2.3 еще раз, отбросив мутный супернатант (фракция содержит эпителиальные и внутриэпителиальные клетки) и заменив его свежим буфером эпителиального удаления.
  3. Переваривание тканей
    1. Нанесите содержимое на свежую чашку Петри. Используя щипцы, подберите сегменты кишечника и постучите по сухой поверхности, чтобы отбросить лишнюю жидкость. Поместите сегменты в свежую чашку Петри на льду.
    2. Сгруппируйте сегменты в центр чашки Петри в плотную массу. Используя два скальпеля или острые ножницы, мелко измельчите ткань, пока она не достигнет вязкой консистенции, которая может пройти через кончик пипетки p1000.
    3. С помощью пинцета поместите измельченную ткань в чистую пробирку объемом 50 мл. Промыть чашку Петри 1-2 мл буфера пищеварения (таблица 1), чтобы собрать оставшуюся ткань и объединить ее в пробирку объемом 50 мл с измельченной тканью.
    4. Добавьте 5-7 мл буфера пищеварения в измельченную ткань и убедитесь, что вся ткань собрана на дне трубки.
    5. Инкубируйте образцы при 37 °C, со средним раскачиванием (~100-150 об/мин) в течение 15 мин. Вращайте трубку в течение 20-30 с каждые 5 минут, чтобы помочь пищеварению.
    6. Пока образцы инкубируются, поместите клеточный ситечко 40 мкм поверх свежей пробирки объемом 50 мл для каждого образца. Покрыть фильтры 1-2 мл нейтрализующего буфера (табл. 1).
    7. Вихрь образцов в течение 20-30 с после окончания инкубации.
    8. Отфильтруйте частично переваренную ткань через фильтр с покрытием 40 мкм в трубку объемом 50 мл, содержащую нейтрализующий буфер.
    9. Используйте пинцет, чтобы собрать непереваренную ткань из фильтра 40 мкм и поместить ее обратно в трубку объемом 50 мл, в которой было выполнено пищеварение, для второго раунда пищеварения. Удалите фильтры и промойте их буфером пищеварения, чтобы вытеснить любую непереваренную ткань, прилипшую к фильтру.
    10. После того, как из фильтра было удалено как можно больше непереваренной ткани и помещено обратно в трубку объемом 50 мл, в которой осуществлялось пищеварение, промойте фильтр нейтрализующим буфером 1-2 мл над трубкой объемом 50 мл, содержащей фильтрованный супернатант.
    11. Добавьте 20-25 мл нейтрализующего буфера к фильтрованному супернатанту и поместите его на лед для поддержания жизнеспособности изолированных клеток во время второго раунда переваривания тканей.
    12. Добавьте еще 5-10 мл буфера пищеварения в непереваренную ткань и повторите шаги 3.3.5-3.3.10, обеспечив фильтрацию переваренной ткани в ту же пробирку, которая используется на этапе 3.3.8 (тот же фильтр также может быть использован повторно). Промойте фильтр нейтрализующим буфером до тех пор, пока не будет достигнута линия 50 мл, а затем выбросьте все оставшиеся непереваренные ткани.
  4. Выделение лимфоцитов по градиенту плотности
    1. Вращайте собранные супернатанты для каждой биологической реплики при 500 х г в течение 10 мин.
    2. На этапе 3.4.1 добавьте 5 мл 80% изотонического LVDGM в пробирку объемом 15 мл для каждой биологической реплики.
    3. После центрифугирования выбросьте супернатант из отфильтрованной, переваренной ткани. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл 40% изотонического LVDGM, гарантируя, что гранула хорошо гомогенизирована, и не останется больших кусков.
    4. Установка пипетки помогает на самую медленную установку, наклоните трубку объемом 15 мл, содержащую 80% изотонической LVDGM, и очень осторожно наложите 10 мл клеточной суспензии в 40% изотонической LVDGM, гарантируя, что клеточная суспензия не смешивается с 80% фракцией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фракции когда-либо случайно смешиваются, быстро распределите лимфоциты, которые достигли 80% фракции, между двумя трубками по 50 мл, заполненными PBS, и центрифугой в течение 10 мин при 500 х г. Затем отбросьте супернатант и повторите шаги 3.4.3-3.4.4.
    5. Вращайте трубки при 900 x g и 20 °C, при этом ускорение и снижение ускорения устанавливаются на самую низкую настройку, чтобы гарантировать, что фракции не нарушаются. Центрифуга в течение 20 мин (не включая время перерыва).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, начиная с этого этапа, должны проводиться в асептической культуральной вытяжке с использованием стерильных материалов и реагентов.
    6. Предварительно покройте пробирку объемом 50 мл для каждого образца PBS2 и добавьте 45 мл ледяного PBS.
    7. После центрифугирования аккуратно удалите верхний слой мусора из трубки объемом 15 мл. Покройте наконечник p1000 PBS2 и используйте его для сбора насыщенной лимфоцитами интерфазы между градиентами 40%-80% в трубку объемом 50 мл, содержащую 45 мл ледяного PBS.
    8. Раскрутите пробирки при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    9. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES; см. Таблицу 1). Предварительно покройте фильтр 40 мкм буфером FACS и используйте его для фильтрации клеточной суспензии в проточную трубку. Промыть трубку объемом 50 мл дополнительным буфером FACS объемом 500 мкл и фильтровать в ту же проточную трубку.
    10. Удалите 10 мкл аликвоты из полученного 1 мл клеточной суспензии. Подсчитайте выход лимфоцитов с помощью счетчика клеток или гемоцитометра и рассчитайте концентрацию клеток для каждого образца.
  5. Пробоподготовка к сортировке - внеклеточное окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, используемые в внеклеточном окрашивании mastermix, а также реагенты для приготовления фиксируемого красителя жизнеспособности и раствора Блока Fc, используются в концентрациях, достаточных для 5 х 106 ячеек на 100 мкл. Объемы должны быть соответствующим образом отрегулированы. Для машинной компенсации FACS для сортировки ILC1 требуются одноцветные элементы управления для каждого из флуорофоров во внеклеточном мастермиксе окрашивания. Для антител могут быть использованы компенсационные шарики, которые содержат положительную популяцию бусин, связывающих антитела, и популяцию несвязывающихся бусин с отрицательным антителом. Для ультрафиолетового (УФ) поправимого жизнеспособности красителя одноцветного контроля могут использоваться компенсационные шарики, содержащие амино-реактивные (для положительного сигнала) и нереактивные (для отрицательного сигнала) популяции. Не рекомендуется использовать клетки из RORγtGFPрепортерные мыши для УФ-поправимой жизнеспособности красителя одноцветного контроля, так как эти клетки будут содержать GFP+ сигнал.
    1. Извлеките небольшую аликвоту ~10 мкл из каждого образца и объедините ее в отдельную проточную трубку, содержащую 250 мкл буфера FACS. Поместите трубку на лед. Это будет использоваться для незапятнанного контроля.
    2. Добавьте 1 мл PBS к оставшемуся объему в пробирках. Центрифуга при 300-400 х г в течение 3-5 мин.
    3. Приготовьте 200 мкл УФ-фиксируемого раствора красителя для жизнеспособности на образец. Разбавляйте УФ-фиксируемый краситель жизнеспособности (повторно суспендированный в DMSO в соответствии с инструкциями производителя) 1:500 в PBS (или следуя инструкциям производителя).
    4. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте образцы в 200 мкл УФ-фиксируемого раствора для жизнеспособности. Вихрьте трубки и высиживайте в темноте при 4 °C в течение 10-15 мин.
    5. Добавьте 2 мл буфера FACS в трубки, чтобы погасить УФ-фиксируемый краситель жизнеспособности, вихрь в течение 10 с и центрифугировать трубки при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант из центрифугированных трубок.
    6. Приготовьте 200 мкл раствора блока Fc на образец (0,25 мг/мл блока Fc в буфере FACS).
    7. Добавляют 200 мкл раствора блока Fc к каждому из образцов со стадии 3.5.5, вихрь в течение 10 с и инкубируют в темноте при 4 °C в течение 10 мин.
    8. Добавьте 500 мкл буфера FACS в трубку со свежим потоком. Извлеките 2-5 мкл аликвоты из каждого образца и объедините ее в трубку для флуоресцентного минус один (FMO) контроля.
    9. Вращайте трубку FMO в течение 10 с и равномерно распределяйте (100 мкл на трубку) в трубки со свежим потоком, помеченные для каждого из элементов управления FMO (коктейль Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO и NK1.1 FMO; см. Таблицу 3). Добавьте все антитела, кроме интересующего антитела к каждой трубке (как описано в таблице 3) и вихря в течение 10 с. Поместите элементы управления FMO в сторону в темноте при температуре 4 °C.
    10. Центрифугирование образцов (не FMO контролирует) при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C.
    11. Готовят внеклеточный окрашивающий мастермикс (200 мкл на образец) с окончательным разведением антител, как описано в таблице 4. Отрегулируйте объем окрашивания для соответствующей концентрации клеток (до 5 х 106 клеток на 100 мкл) в зависимости от количества клеток на этапе 3.4.10.
    12. Добавьте к образцам внеклеточный мастермикс окрашивания, вихрь в течение 10 с и поместите их в сторону в темноте при 4 °C.
    13. Подготовьте свежий одноцветный контроль для каждого антитела, предназначенного для использования в стратегии гатинга (рисунок 2). Вихревые антитела компенсируют шарики в течение 20 с, добавляют 1 каплю шариков в проточную трубку, окрашивают 0,5 мкл антитела (как показано в таблице 2 или следуя инструкциям производителя) и вихрь в течение 10 с.
    14. Подготовьте УФ-поправляемый краситель для одноцветного контроля жизнеспособности с помощью набора шариков для компенсации амино-реактивной компенсации. Вихревые аминореактивные компенсационные шарики в течение 20 с добавляют 1 мкл живого/мертвого УФ-красителя (как показано в таблице 2 или в соответствии с инструкциями производителя) и вихрь в течение 10 с.
    15. Инкубируйте образцы, GMO и одноцветные элементы управления в темноте в течение 30 минут при 4 °C.
    16. За это время подготовьте трубки для сбора отсортированных клеток. Добавьте 400-500 мкл 10% FBS в пробирках Advanced DMEM/F12 до 1,5 мл для каждого образца.
    17. После инкубации добавьте 2 мл PBS2 к каждому из образцов, элементов управления FMO и элементов управления одним цветом.
    18. Центрифугирование образцов, элементов управления FMO и одноцветных элементов управления при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °C.
    19. Выбросьте супернатант из всех центрифугированных трубок. Повторное суспендирование образцов и элементов управления FMO в буфере FACS 250 мкл и вихре в течение 10 с.
    20. Повторное суспендирование одноцветных элементов управления в 250 мкл PBS2. Добавьте 1 каплю аминных нереактивных шариков к УФ-поправимому красителю жизнеспособности только одноцветного контроля. Вихрь всех органов управления в течение 10 с.
    21. Теперь ячейки готовы к сортировке. Храните образцы, элементы управления FMO и одноцветные элементы управления на льду в темноте, когда это возможно, чтобы повысить жизнеспособность клеток и предотвратить потерю сигнала от фотоотбеливания.

4. Кокультура органоидов тонкого кишечника с врожденными лимфоидными клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается совместная культивирование отсортированного тонкокишечного кишечника ILC1 (выделенного в соответствии с протоколом в разделе 3) с мышиными тонкокишечными органоидами (описанными в разделах 1 и 2). Органоиды следует оптимально использовать через 1-2 дня после прохождения. Кокультура включает в себя извлечение органоидов, добавление соответствующего количества ILC1, центрифугирование к гранулированным органоидам и ILC1 вместе и повторное использование в TBEM. Завершите этот раздел как можно скорее после изоляции ILC1. Все процедуры должны проводиться в асептической среде с использованием стерильных материалов и реагентов.

  1. Убедитесь, что TBEM из шага 3.1.1 был разморожен.
  2. Извлеките 1-2-дневные органоиды, как описано в шагах 2.3 и 2.4.
  3. Повторно суспендировать органоидную гранулу в 1 мл холодного ледяного Advanced DMEM/F12. Не сгибайте наконечник p1000, как это делается при прохождении органоидов, так как цель здесь состоит в том, чтобы сохранить органоидную структуру для совместной культуры. При необходимости поместите органоиды в отдельные трубки PBS2, покрытые 1,5 мл, на льду на короткий период для распределения между различными условиями кокультуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начинать подготовку органоидов можно только после того, как образцы ILC будут готовы к совместному культивированию; работать на льду и быстро, как только органоиды были извлечены, чтобы свести к минимуму гибель эпителиальных клеток.
  4. Предварительно покройте одну трубку объемом 1,5 мл PBS2 на образец реплицирования ILC. Распределите ~100-200 органоидов (примерно 1 лунку из 24-луночной пластины) в каждую трубку.
  5. Предварительно нанесите наконечник p1000 в PBS2 и используйте его для оценки объема ILC1 после очистки FACS (250-300 мкл + отсортированный объем). Определите концентрацию ILC1 на мл, используя количество клеток, записанных из сортировки, и определите необходимый объем.
  6. Используя тот же наконечник p1000, покрытый PBS2, добавьте не менее 500 ILC1 в трубку PBS2, покрытую 1,5 мл, содержащую органоиды. Если количество ILC1, полученных от сорта, меньше 500, добавьте органоид непосредственно в трубку, содержащую исходный сорт, чтобы свести к минимуму потерю клеток от переноса.
  7. Откручивайте ILC1 и органоиды при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Если возможно, избегайте настольных центрифуг малого диаметра, так как они будут объединять ячейки вдоль края внутренней части трубки, а не создавать гранулу на кончике трубки. Поскольку количество клеток очень низкое, крайне важно свести к минимуму потерю клеток во время этих этапов.
  8. Медленно и осторожно удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу (которая может быть не видна на глаз, особенно в неорганоидных контрольных группах без ILC). Поместите образец на лед.
  9. Повторно суспендировать холодную гранулу в 30 мкл на лунку TBEM. Удерживая трубку на холодной поверхности (например, небольшой ящик со льдом, помещенный в вытяжку для культивирования тканей), смешайте органоиды и ILC не менее 10-15 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Тритурируйте часто, но осторожно, чтобы избежать повреждения органоидов и образования пузырьков.
  10. Нанесите 30 мкл на лунку ILC-органоидов в TBEM на предварительно нагретую 24- или 48-луночную пластину, чтобы сформировать один купол. Непосредственно поместите пластину в инкубатор (37 °C и 5% CO2) на 10-20 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется настроить контроль только для ILC и органоидов для последующего анализа. ILC1 встречаются редко, но GFP-ILC2 может быть заменен иммунофлуоресценцией или контролем проточной цитометрии FSC / SSC, где это научно целесообразно.
  11. Добавьте 550 мкл (на лунку) полной среды ILC1 (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-меркаптоэтанол; см. Таблицу 1) с любыми желаемыми экспериментальными цитокинами или блокирующими антителами и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
  12. Через 24 ч аккуратно извлеките пластину из инкубатора и дайте пластине посидеть в вытяжке для культивирования тканей в течение 1 мин, чтобы убедиться, что лимфоциты оседают.
  13. Удалите 200-250 мкл среды и поместите ее в пустой колодец из 24-луночной пластины. Проверьте этот супернатант с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что лимфоциты не были удалены.
    1. Если супернатант прозрачный, добавьте 300 мкл свежей среды ILC1 к совместной культуре в исходной лунке. Если в супернатанте присутствуют лимфоциты, центрифугируют при 300-400 х г в течение 3-5 мин при 4 °С и повторно суспендируют в 300 мкл свежей среды ILC1 и добавляют к оставшимся 200-250 мкл среды в исходной лунке. Обеспечьте пополнение носителей каждые 1-2 дня или когда медиа становятся бледно-оранжевыми/желтыми.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте, чтобы среда испарялась настолько, что кончик матричного купола разбивает поверхность среды. Всегда следите за тем, чтобы матрица была полностью погружена в воду. Избыточного испарения можно избежать, используя центральные колодцы в тканевых культуральных пластинах и добавляя ~ 600 мкл PBS в окружающие скважины. Кокультуры со взрослыми ILC стабильны в течение 1-4 дней, после чего органоиды, которые были посеяны без серьезных нарушений, будут разрываться и пересеиваться как новые крипты. При анализе эпителия рекомендуется проводить анализ культур в течение 1-4 дней после создания сокультур.
    2. Выполнение последующего анализа с использованием иммунофлуоресценции, проточной цитометрии или очистки FACS целевых популяций в буфер лизиса для анализа экспрессии генов с помощью одноклеточной или объемной РНК-seq или RT-qPCR, как описано в ссылке8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

При успешном завершении свежеизолированные крипты должны образовать почковые криптовые структуры в течение 2-4 дней (рисунок 1А). Здоровые и крепкие органоидные культуры должны активно расти и могут проходить и расширяться, как подробно описано в протоколе.

Этот протокол описывает выделение ILC1 тонкой кишки из мышиной трансгенной репортерной линии RORγtGFP , что позволяет выделять живой ILC1 FACS (рисунок 2). Используя протокол, описанный здесь, ожидаемый диапазон подсчета ILC1 составляет 350-3 500 изолированных клеток.

После посева органоидами кокультуры могут быть визуализированы иммуноцитохимией (рисунок 3А-В). ILC и эпителиальные клетки также могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 3C. ILC1 повышает регуляцию эпителиального CD44, что характеризуется проточной цитометрией (рисунок 4A-B) и иммуноцитохимией (рисунок 4C). В частности, ILC1 индуцирует экспрессию варианта сращивания CD44 v6 в органоидах, как показано в RT-qPCR (рисунок 4D).

Таблица 1: Композиции носителей и буферов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Одноцветные элементы управления. Композиция одноцветных элементов управления для выделения тонкой кишки lamina propria ILC1 с использованием стратегии гатирования, определенной на рисунке 2. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Флуоресценция минус один (FMO) супермиксы. Состав мастермиксов FMO для коктейля Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO и NK1.1 FMO. Мастермиксы FMO содержат все используемые антитела, за исключением интересующего антитела, и используются для окрашивания образца аликвоты. Линейный коктейль определяется как CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Внеклеточное окрашивание мастермикса. Концентрации регулируют для окрашивания до 5 х 106 клеток в 200 мкл буфера FACS. Подробную информацию об используемых антителах можно найти в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Figure 1
Рисунок 1: Мышиные тонкокишечные органоиды кишечника. Репрезентативное изображение (А) успешно генерируется тонкокишечными органоидами через 2-3 дня после прохождения и (В) неудачной культивированием. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Стратегия выделения ILC1s из тонкой кишки lamina propria трансгенных мышей-репортеров RORγtGFP . Репрезентативный цитометрический график выделения ILC1 из тонкой кишки lamina propria трансгенных мышей-репортеров RORγtGFP facS. ILC1 определяются как live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ и NK1.1+. Представитель от N = >50 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Совместные культуры Organoid и ILC1. Изображения яркого поля (A), изображения конфокальной микроскопии (B) и графики FACS (C) тонкокишечных органоидов (SIO), культивируемых отдельно (вверху) или с ILC1s (внизу) (репрезентативные эксперименты с ILC1s у N = 3 мышей). (B) Окрашивание CD45 иллюстрирует ILC1s и Zonula occludens белок 1 (ZO-1) отмечает эпителиальные клетки в органоидах. Шкала: 50 мкм. (C) Ранее закрыта на одиночных живых клетках. Молекула эпителиальной клеточной адгезии (EpCAM) отмечает эпителиальные клетки кишечника (IEC) в органоидах, а CD45 маркирует ILC1s. Рисунок взят из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: ILC1s в кокультуре с тонкокишечными органоидами стимулирует регуляцию CD44 в эпителиальных клетках кишечника. (A) Репрезентативный цитометрический график экспрессии CD44 в эпителиальной клеточной адгезионной молекуле (EpCAM) положительных эпителиальных клеток (живых, CD45-, EpCAM+) из тонкокишечных органоидов (SIO), культивируемых отдельно (слева) или с ILC1s в течение 4 дней (справа). (B) Количественная оценка потока экспрессии CD44 в эпителиальных клетках кишечника (IEC) (ILC1s от N = 5 мышей). (C) Репрезентативное конфокальное микроскопическое изображение локализации CD44 только в d4 SIO (слева) или совместно культивируемое с ILC1s (справа) (представитель N = 3 мышей). Шкала: 50 мкм. (D) RT-qPCR с экзонно-специфическими праймерами для вариантов сращивания CD44 v4 и v6 (N = 3). Эта цифра взята из ссылки8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает методы установления органоидов тонкой кишки мышей, выделения редких ILC1 путем минимизации потери лимфоцитов во время протокола диссоциации кишечника и установления кокультур между этими двумя компартментами. В этом протоколе есть много шагов, и хотя некоторые из них специфичны для ILC1, этот подход может быть применен к другим типам иммунных клеток кишечника, а установки кокультуры могут быть модульно адаптированы в соответствии с индивидуальными исследовательскими вопросами. Здесь выделены несколько критических шагов (от которых рекомендуется не отклоняться), а также рекомендации по устранению неполадок для более технически сложных элементов этого протокола.

Применение мышиных тонкокишечных органоидов из одиночных lgr5+-eGFP кишечных стволовых клеток становится все более устоявшимся33,34; однако в этом протоколе предлагается изолировать неповрежденные целые крипты Либеркена от животных CD45.1. Мало того, что интактные крипты восстанавливаются быстрее, чем одиночные клетки Lgr5+, но использование CD45.1 животных без репортера GFP гарантирует, что никакие перекрестно загрязняющие CD45.2+ ILC не анализируются из органоидных кокультур и совместимы с использованием иммунных клеток, содержащих репортер на основе GFP. По опыту авторов, никакие мезенхимальные или иммунные клетки не переносятся после 1-3 проходов органоидов. Поэтому использование CD45.2 или других животных для установления органоидов является вполне приемлемым. Во время органоидного создания, если крипты отсутствуют на шаге 1.1.19, может потребоваться более строгое ручное встряхивание, чтобы выбить неповрежденные крипты. Факторы окружающей среды, такие как температура окружающей среды в помещении (например, проводится ли процедура летом или зимой), могут добавить некоторую изменчивость к срокам инкубации во время диссоциации. Плотность высева крипт будет влиять на исходный выход органоидного образования; поэтому рекомендуется засеять как минимум две различные плотности для обеспечения успеха (например, 200-750, предложенные здесь, но этот диапазон может быть адаптирован на основе индивидуальных потребностей).

После установления кишечные органоидные культуры гетерогенны как между линиями, установленными из одного и того же штамма мыши, вдоль желудочно-кишечного тракта (например, двенадцатиперстная кишка против подвздошной кишки), так и даже в пределах одного и того же колодца органоидных культур35,36. Хотя этот протокол оказался надежным для многих различных партий органоидов, эта неоднородность может способствовать изменчивости данных. Хорошей практикой является согласование с поддержанием органоидов (пассирование и изменения среды) для снижения технического шума от фенотипически нерелевантных данных. Это включает в себя согласованность с временной шкалой прохождения перед посевом и с силой, используемой для диссоциации органоидов. Также рекомендуется использовать одну и ту же базальную матрицу для сравниваемых экспериментов и для экспериментов, которые должны проводиться с использованием биологических реплик органоидов, полученных от разных животных (когда это финансово и технически осуществимо), чтобы обеспечить надежную воспроизводимость результатов.

При создании кокультур соотношение иммунных и эпителиальных клеток является критическим соображением, которое потребует оптимизации на основе исследовательских вопросов. Если исследуется влияние эпителиальных клеток на ILC, количество посеянных органоидов должно быть достаточным для насыщения всех ILC. И наоборот, при оценке влияния ILC на эпителий различные соотношения ILC/epithelial могут приводить к различным фенотипическим выходам, отражающим дифференциальные состояния обогащения подмножества ILC в слизистой оболочке. Жизнеспособность ILC1 хорошо поддерживается в культуре, и популяция будет подвергаться умеренному расширению, причем ~ 500 ILC1 и 100 органоидов тонкого кишечника (SIO) подвергаются в среднем 2-3-кратному расширению. Однако на этот выход будут влиять дополнительные обработки, при этом TGF-нейтрализация улучшается, а p38-ингибирование уменьшает абсолютное число ILC1 после ко-культуры8. Любая непредвиденная потеря более 50% посевных чисел ILC1 может быть результатом либо несбалансированного соотношения ILC1 к SIO (увеличение числа засеянных крипт), загрязнения SIO (обеспечение функционирования антибиотического коктейля и тестирование супернатанта на микоплазму) или проблем с качеством в запасах цитокинов, причем ILC1 особенно чувствителен к недостатку IL-2 или IL-15. Супернатанты совместного культивирования из концентрированных плит из 96- или 48 скважин успешно используются для ИФА. При диссоциации ко-культур рекомендуется инкубировать клетки с ДНКазой после 20-минутной мягкой замены трипсина или выполнять диссоциацию на основе ЭДТА к отдельным клеткам, чтобы предотвратить слипание клеток от поврежденных эпителиальных клеток.

Сила этого протокола заключается в том, что он уравновешивает редукционистские условия культуры со сложными типами клеток. Однако поведение других подмножеств ILC в этих культурах может зависеть от факторов, отсутствующих в этом конкретном протоколе. Например, в протоколе Lindemans, используемом для кокультур ILC3, IL-23 был дополнительно дополнен в кокультурные среды для поддержки поддержания и активации ILC38. Было обнаружено, что IL-15 особенно важен для поддержания ILC1 в системе кокультур, описанной в этом протоколе, что соответствовало предыдущим сообщениям iLC1, требующим этого цитокина для гомеостаза, хотя и неразвивался 6. Для активации ILC или поддержания ILC2 среда роста может потребовать дальнейшей оптимизации. Более того, другие клеточные компартменты в кишечнике, помимо эпителия, регулируют ILC. Например, известно, что кишечные нейроны модулируют ILC2 частично через активность секретируемых нейропептидов37. Микробные факторы также влияют на фенотипILC 38. Это ограничение может быть преодолено путем добавления этих элементов, например, цитокинов, пептидов или микробных факторов, в систему кокультуры. Это может даже позволить исследовать взаимодействие между ILC и несколькими клеточными компартментами в редукционистской обстановке. Следуя этой логике, крайне важно, чтобы антибиотические / антимикотические реагенты добавлялись и часто пополнялись в органоидные среды до создания кокультур. Также крайне важно, чтобы все культуры выполнялись в асептических средах, потому что любое загрязнение культуры (например, грибковый рост или микоплазма), вероятно, активирует антигенные неспецифические ILC, создавая значительные фенотипы, которые могут отсутствовать в незагрязненных культурах. По этой причине отмена антибиотических/микотических реагентов не рекомендуется даже в сокультурах, так как не было обнаружено, что они оказывают неблагоприятное воздействие на эпителий или ИЛК.

Этот метод обеспечивает уникальный способ характеристики сигнальных модулей между ILC и кишечным эпителием, что позволяет исследовать биологию обоих компартментов. По сравнению с другими методами in vitro , состоящими из одного типа клеток, система, представленная здесь, более сопоставима с физиологией in vivo и позволяет исследовать множественные потенциальные сигнальные механизмы между эпителиальными клетками и ILC. Другие методы культивирования ILC in vitro преимущественно опираются на стромальные фидерные клеточные линии, такие как OP9 или OP9-DL139. Эта линия получена из кальварии новорожденной мыши, которая не является репрезентативной для кишечной среды. Хотя на сегодняшний день они обеспечили золотой стандарт для поддержания ILC in vitro , они сталкиваются с существенными ограничениями в их применении для понимания воздействия ILC на эпителий.

Протокол кокультуры, описанный здесь между органоидами тонкого кишечника мышей и ILC, полученными из lamina propria, имеет значительные исследовательские приложения. Эта система кокультуры уже использовалась для определения роли TGF-β, полученных из ILC1, в расширении CD44+ эпителиальных крипт8, что способствует пониманию динамики эпителия при воспалительных заболеваниях кишечника. Эти исследования способствуют увеличению количества литературы, которая подкрепляет критическую важность передачи эпителиальных сигналов ILC при кишечном гомеостазе и воспалении3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Э.Р. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. получает степень доктора философии от Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. признает докторскую степень студента от NIHR GSTT BRC. J.F.N. признает стипендию Марии Склодовской-Кюри, стипендию Королевской премии, стипендию Фонда Резерфорда RCUK /UKRI (MR/R024812/1) и премию Seed Award в области науки от Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Мы также благодарим основную команду проточной цитометрии BRC, базирующуюся в больнице Гая. Мыши-репортеры Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 были щедрым подарком от Г. Эберля (Институт Пастера, Париж, Франция). Мыши CD45.1 C57BL/6 были любезно предоставлены Т. Лоуренсом (Королевский колледж Лондона, Лондон) и. Барралом (Королевский колледж Лондона, Лондон).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 181
Кокультура эпителиальных органоидов тонкой кишки мышей с врожденными лимфоидными клетками
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter