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Immunology and Infection

जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ मुरीन छोटी आंत उपकला ऑर्गेनोइड्स की सह-संस्कृति

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल मुरीन छोटी आंत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है, मूरीन छोटी आंत लामिना प्रोपरिया से टाइप -1 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को अलग करता है, और आंतों के उपकला कोशिकाओं और टाइप -1 जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के बीच द्वि-दिशात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए दोनों सेल प्रकारों के बीच 3-आयामी (3 डी) सह-संस्कृतियों की स्थापना करता है।

Abstract

प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ ऑर्गेनोइड्स की जटिल सह-संस्कृतियां द्वि-दिशात्मक इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करती हैं जो म्यूकोसल होमियोस्टैसिस के नाजुक संतुलन को रेखांकित करती हैं। ये 3 डी, मल्टी-सेलुलर सिस्टम बहु-फैक्टोरियल बीमारियों को संबोधित करने और तकनीकी कठिनाइयों को हल करने के लिए एक रिडक्शनिस्ट मॉडल प्रदान करते हैं जो दुर्लभ सेल प्रकारों जैसे ऊतक-निवासी जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी) का अध्ययन करते समय उत्पन्न होती हैं। यह लेख एक मुरीन प्रणाली का वर्णन करता है जो छोटी आंत के ऑर्गेनोइड्स और छोटी आंत लामिना प्रोपरिया व्युत्पन्न सहायक-जैसे टाइप -1 आईएलसी (आईएलसी 1 एस) को जोड़ता है, जिसे आसानी से अन्य आईएलसी या प्रतिरक्षा आबादी तक बढ़ाया जा सकता है। आईएलसी एक ऊतक-निवासी आबादी है जो विशेष रूप से म्यूकोसा में समृद्ध है, जहां वे होमियोस्टैसिस को बढ़ावा देते हैं और तेजी से क्षति या संक्रमण का जवाब देते हैं। आईएलसी के साथ ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों ने पहले से ही आंत में नए उपकला-प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मॉड्यूल पर प्रकाश डालना शुरू कर दिया है, जिससे पता चलता है कि विभिन्न आईएलसी सबसेट आंतों के उपकला बाधा अखंडता और उत्थान को कैसे प्रभावित करते हैं। यह प्रोटोकॉल उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच पारस्परिक बातचीत में आगे की जांच को सक्षम करेगा, जो म्यूकोसल होमोस्टैसिस और सूजन के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता रखता है।

Introduction

आंतों के उपकला और आंत-निवासी प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संचार आंतों के होमियोस्टैसिस1 के रखरखाव के लिए केंद्रीय है। इन इंटरैक्शन के लिए व्यवधान स्थानीय और प्रणालीगत दोनों बीमारियों से जुड़े हुए हैं, जिनमें सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) और जठरांत्र संबंधी कैंसर2 शामिल हैं। होमोस्टैसिस के हाल ही में वर्णित महत्वपूर्ण नियामक का एक उल्लेखनीय उदाहरण जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं (आईएलसी) के अध्ययन से आता है, जो आंतों की प्रतिरक्षा परिदृश्य3 में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में उभरा है। आईएलसी हेटरोजेनस जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक समूह है जो आंतों के होमोस्टैसिस को विनियमित करता है और साइटोकाइन-मध्यस्थता सिग्नलिंग 4 के माध्यम से बड़े पैमाने पर सूजन को व्यवस्थित करताहै।

मुरीन आईएलसी को मोटे तौर पर प्रतिलेखन कारक, रिसेप्टर और साइटोकाइन अभिव्यक्ति प्रोफाइल5 के आधार पर उपप्रकारों में विभाजित किया गया है। टाइप -1 आईएलसी, जिसमें साइटोटॉक्सिक नेचुरल किलर (एनके) कोशिकाएं और सहायक-जैसे टाइप -1 आईएलसी (आईएलसी 1 एस) शामिल हैं, को प्रतिलेखन कारक (इओमेसोडर्मिन) इओम्स और टी-बॉक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित किया गया है, जो क्रमशः टी कोशिकाओं (टी-बेट) 6 में व्यक्त किया गया है, और टी हेल्पर टाइप -1 (टीएच1) प्रतिरक्षा से जुड़े साइटोकिन्स को स्रावित करता है: इंटरफेरॉन-γ (आईएफएन) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ), इंटरल्यूकिन (आईएल) के जवाब में, इंटरफेरॉन-γ (आईएफएन) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर (टीएनएफ), इंटरल्यूकिन (आईएल) के जवाब में। आईएल -15 और आईएल -187। होमियोस्टैसिस के दौरान, ऊतक-निवासी आईएलसी 1 एस उपकला प्रसार और मैट्रिक्स रीमॉडलिंग 8 को चलाने के लिए ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर β (टीजीएफ-β) का स्राव करताहै। टाइप -2 आईएलसी (आईएलसी 2 एस) मुख्य रूप से टी हेल्पर टाइप -2 (टीएच2) संबंधित साइटोकिन्स के स्राव के माध्यम से हेल्मिंथ संक्रमण का जवाब देते हैं: आईएल -4, आईएल -5, और आईएल -13, और रेटिनोइक एसिड से संबंधित अनाथ रिसेप्टर (आरओआर) α (आरओआर -α)9 और गाटा बाइंडिंग प्रोटीन 3 (जीएटीए -3) 10,11,12 की अभिव्यक्ति की विशेषता है। . चूहों में, आंतों के "भड़काऊ" आईएलसी 2 एस को किलर सेल लेक्टिन-जैसे रिसेप्टर (उपपरिवार जी सदस्य 1, केएलआरजी) 13 की अभिव्यक्ति की विशेषता है जहां वे उपकला टफ्ट-सेल व्युत्पन्न आईएल -2514,15 का जवाब देते हैं। अंत में, टाइप -3 आईएलसी, जिसमें लिम्फोइड ऊतक प्रेरक कोशिकाएं और सहायक-जैसे टाइप -3 आईएलसी (आईएलसी 3) शामिल हैं, प्रतिलेखन कारकआरओआर-16 पर निर्भर हैं, और समूहों में क्लस्टर हैं जो स्थानीय आईएल -1 और आईएल -23 सिग्नल17 के जवाब में ग्रैनुलोसाइट्स मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), आईएल -17, या आईएल -22 को स्रावित करते हैं। लिम्फोइड ऊतक प्रेरक कोशिकाएं पियर्स के पैच में क्लस्टर होती हैं और विकास18 के दौरान इन माध्यमिक लिम्फोइड अंगों के विकास के लिए महत्वपूर्ण होती हैं, जबकि आईएलसी 3 एस वयस्क मुरीन छोटी आंत लामिना प्रोपरिया में सबसे प्रचुर मात्रा में आईएलसी उपप्रकार हैं। आईएलसी 3 के साथ शुरुआती मुरीन आंतों के ऑर्गेनोइड सह-संस्कृति प्रणालियों में से एक का उपयोग सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (स्टेट -3) के एक्टिवेटर पर साइटोकाइन आईएल -22 के प्रभाव को अलग करने के लिए किया गया था मध्यस्थता ल्यूसीन-रिच दोहराने में जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर 5 (एलजीआर 5) + आंतों के स्टेम सेल प्रसार19, एक पुनर्योजी आईएलसी-उपकला बातचीत का एक शक्तिशाली उदाहरण। आईएलसीअंगों 20,21 के बीच छाप-विषमता प्रदर्शित करते हैं और ध्रुवीकरण साइटोकिन्स22 के जवाब में सबसेट के बीच प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करते हैं। इन ऊतक-विशिष्ट छापों और प्लास्टिसिटी मतभेदों को क्या चलाता है, और आईबीडी23 जैसी पुरानी बीमारियों में वे क्या भूमिका निभाते हैं, रोमांचक विषय बने हुए हैं जिन्हें ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।

आंतों के ऑर्गेनोइड्स आंतों के उपकला24,25 का अध्ययन करने के लिए एक सफल और विश्वसनीय मॉडल के रूप में उभरे हैं। ये आंतों के उपकला Lgr5 + स्टेम कोशिकाओं, या पूरे अलग crypts, जो WNT परिवार के सदस्य 3A (WNT3a) के एक अंतर्जात स्रोत के रूप में पनेथ कोशिकाओं को शामिल करने के द्वारा उत्पन्न होते हैं। इन 3 डी संरचनाओं को या तो सिंथेटिक हाइड्रोजेल26 में या बायोमैटेरियल्स में बनाए रखा जाता है जो बेसल लामिना प्रोपरिया की नकल करते हैं, उदाहरण के लिए, थर्मल-क्रॉसलिंकिंग बेसल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (टीबीईएम), और आगे विकास कारकों के साथ पूरक होते हैं जो आसपास के आला की नकल करते हैं, सबसे विशेष रूप से उपकला विकास कारक (ईजीएफ), बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) -अवरोधक नोगिन, और एक Lgr5-लिगैंड और WNT-एगोनिस्ट R-Spondin127 . इन शर्तों के तहत, ऑर्गेनोइड्स उपकला एपिको-बेसल ध्रुवीयता को बनाए रखते हैं और नवोदित स्टेम सेल क्रिप्ट्स के साथ आंतों के उपकला की क्रिप्ट-विली संरचना को दोहराते हैं जो ऑर्गेनोइड के केंद्र में अवशोषक और स्रावी कोशिकाओं में अंतर करते हैं, जो तब एनोइकिस28 द्वारा आंतरिक स्यूडोलुमेन में बहाते हैं। यद्यपि अकेले आंत्र ऑर्गेनोइड्स29,30 अलगाव में उपकला विकास और गतिशीलता के न्यूनीकरणवादी मॉडल के रूप में बेहद फायदेमंद रहे हैं, वे यह समझने के लिए जबरदस्त भविष्य की क्षमता रखते हैं कि इन व्यवहारों को कैसे विनियमित किया जाता है, प्रभावित किया जाता है, या यहां तक कि प्रतिरक्षा डिब्बे द्वारा बाधित किया जाता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स और लामिना प्रोपरिया व्युत्पन्न आईएलसी 1 एस के बीच सह-संस्कृति की एक विधि का वर्णन किया गया है, जिसका उपयोग हाल ही में यह पहचानने के लिए किया गया था कि यह आबादी अप्रत्याशित रूप से सूजन के आंतों के हस्ताक्षर को कैसे कम करती है और इसके बजाय इस प्रणाली में टीजीएफ-β के माध्यम से उपकला प्रसार में वृद्धि में योगदान देतीहै।

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Protocol

सभी प्रयोगों को पशु उपयोग के लिए सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार और अनुपालन में पूरा किया जाना चाहिए। निम्नलिखित लेख और वीडियो में वर्णित अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन पशु उपयोग के लिए सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार और अनुपालन में प्राप्त किया गया था।

सभी चूहों को प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा आयोजित मानक नैतिक प्रक्रिया के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा मारा गया था। अंग और ऊतक कटाई से पहले, ऊरु धमनी या विच्छेदन की टुकड़ा करने की क्रिया (हाथ में प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त) मृत्यु के पुष्टिकरण मूल्यांकन के रूप में आयोजित की गई थी। जानवरों को विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों (जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है) के तहत एक मान्यता प्राप्त वाणिज्यिक इकाई और किंग्स कॉलेज लंदन पशु इकाई में यूके एनिमल (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम 1986 (यूके होम ऑफिस प्रोजेक्ट लाइसेंस (पीपीएल: 70/7869 से सितंबर 2018) के अनुसार रखा गया था; सितंबर 2018 से P9720273E)।

1. मूरीन छोटे आंतों organoids की स्थापना

नोट: प्रोटोकॉल का यह खंड मुरीन छोटी आंत से आंतों के ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी का वर्णन करता है। क्रिप्ट्स को पहले ऊतक से अलग किया जाता है, टीबीईएम में फिर से निलंबित किया जाता है, और फिर ईजीएफ, नोगिन और आर-स्पॉन्डिन (ईएनआर) वाले मीडिया के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स की स्थापना को भी कहीं और24,25,27 अच्छी तरह से वर्णित किया गया है।

  1. बर्फ पर TBEM को पिघलने के लिए रखें (40 μL / अच्छी तरह से) और एक मानक ऊतक-संस्कृति का इलाज किया गया (हाइड्रोफिलिक और नकारात्मक रूप से चार्ज की गई सतह के साथ प्लेटों को संदर्भित करता है) 24-अच्छी तरह से प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पूर्व-गर्म करने के लिए।
    नोट: TBEM के 500 μL लगभग 2-4 घंटे में पिघल जाएगा; इसे कमरे के तापमान पर न छोड़ें।
  2. ईजीएफ, नोगिन और आर-स्पॉन्डिन को बेसल माध्यम (तालिका 1) में जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखकर ईएनआर माध्यम के प्रति कुएं ~ 4 एमएल या 550 एमएल तैयार करें।
  3. एक 6-12-सप्ताह पुराने जानवर को कुल्ल करें और संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके छोटी आंत को विच्छेदित करें। इसे बर्फ पर फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (पीबीएस) के 15 मिलीलीटर में रखें।
  4. अभिविन्यास के बिंदुओं के रूप में पेट और कैकम का उपयोग करते हुए, छोटी आंत के वांछित क्षेत्र को अलग करें (ग्रहणी, जेजुनम, या इलियम)। इस प्रोटोकॉल में, इलियम को अलग किया जाता है।
  5. बर्फ पर एक 10 सेमी2 पेट्री पकवान पर पीबीएस में आंत को डुबोएं। संदंश का उपयोग करके, आंत से धीरे से, लेकिन पूरी तरह से वसा को हटा दें।
  6. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से काटें (अधिमानतः छिद्र से बचने के लिए गोल युक्तियों के साथ)। पीबीएस में डूबी आंत को रखते हुए, फेकल पदार्थ को हटाने के लिए हिलाएं, और ऊतक अभिविन्यास को ट्रैक करने के लिए श्लेष्मा पक्ष को बनाए रखें।
  7. बर्फ पर एक पेट्री डिश के सूखे ढक्कन पर ऊतक स्थानांतरित करें, आंत श्लेष्म / विलस पक्ष को ऊपर रखें। संदंश के साथ आंत के एक छोर को पकड़ना, धीरे से एक साफ ग्लास स्लाइड के कोण वाले किनारे का उपयोग करके बलगम को दूर करना।
  8. बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ प्लेट भरें और ऊतक को कुल्ला करें।
  9. पीबीएस 2 (पीबीएस + 2% एफसीएस; तालिका 1 देखें) के साथ एक 50 एमएल ट्यूब को प्री-कोट करें ताकि प्लास्टिक में ऊतक के आसंजन को रोका जा सके और इस ट्यूब में 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ा जा सके। आंत को छोटे (~ 2 मिमी) खंडों में काटें और उन्हें पीबीएस 2 के साथ पूर्व-लेपित 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. PBS2 के साथ पूर्व लेपित 25 mL पिपेट का उपयोग करके, ऊतक के टुकड़ों को साफ करने के लिए 5-10 बार खंडों को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  11. खंडों को 15-30 सेकंड के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें, पीबीएस supernatant को हटा दें और छोड़ दें, और समाधान स्पष्ट होने तक चरण 1.10 और 1.11 को दोहराएं (लगभग 3-4 बार)।
  12. खंडों को व्यवस्थित करने और PBS supernatant को छोड़ने के लिए अनुमति दें। बर्फ-ठंडे क्रिप्ट अलगाव बफर के 30 मिलीलीटर जोड़ें (तालिका 1)।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30-60 आरपीएम (या कोमल) पर एक क्षैतिज रोलर या रॉकर पर ट्यूब रखें। तेज गति, उच्च तापमान, या लंबी अवधि पर इनक्यूबेट न करें क्योंकि क्रिप्ट्स समय से पहले विस्थापित हो जाएंगे और कम व्यवहार्यता और उपज के साथ एकल कोशिकाएं बन जाएंगे।
    नोट: इस चरण के बाद से, सभी प्रक्रियाओं को बाँझ सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग करके एक एसेप्टिक वातावरण में आयोजित किया जाना चाहिए।
  14. आंतों के खंडों को 50 एमएल ट्यूब के आधार पर बसने की अनुमति दें। बसे हुए खंडों को बाधित किए बिना क्रिप्ट अलगाव बफर को हटा दें और इसे बर्फ पर 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट:: यदि क्रिप्ट अलगाव प्रक्रिया बहुत कठोर था, तो इस अंश में crypts देखा जा सकता है। इसलिए इसे एक रिजर्व के रूप में रखा जा सकता है लेकिन प्रोटोकॉल के अंत में बेहतर ढंग से छोड़ दिया जाएगा।
  15. आंतों के खंडों में 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस जोड़ें। PBS2 के साथ एक 25 एमएल पिपेट पूर्व लेपित का उपयोग करते हुए, पिपेट आंतों के खंडों को 5-8 बार ऊपर और नीचे करते हैं।
  16. खंडों को 30 सेकंड के लिए व्यवस्थित होने दें। पीबीएस 2 के साथ एक 50 एमएल ट्यूब और 25 एमएल पिपेट को प्री-कोट करें। इस पिपेट का उपयोग करके, पूर्व-लेपित 50 एमएल ट्यूब में supernatant (अंश 1) इकट्ठा करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    नोट: यह अंश शेष क्रिप्ट अलगाव बफर को दूर कुल्ला करने के लिए कार्य करता है। हालांकि, यह एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम के रूप में भी कार्य करता है; यदि pipetting बहुत जोरदार था, crypts इस कुल्ला अंश में प्रचुर मात्रा में हो जाएगा, और अगर यह बहुत कोमल था, वहाँ इस अंश में बहुत कम मलबा हो जाएगा. इष्टतम रूप से, प्रोटोकॉल के अंत में अंश 1 को छोड़ दिया जाता है, लेकिन इसका उपयोग ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए किया जा सकता है यदि नीचे प्राप्त अंश 2-4 के साथ समस्याएं उत्पन्न होती हैं।
  17. 1.15 और 1.16 चरणों को दोहराएं, लेकिन 20 मिलीलीटर के बजाय 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे पीबीएस जोड़ें और पीबीएस 2 (अंश 2) के साथ पूर्व-लेपित एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में सुपरनेटेंट रखें।
  18. चरण 1.17 को दो बार और दोहराएं, लेकिन 2-4 अंश प्राप्त करने के लिए अंश 2 (चरण 1.17 से एक ही 50 एमएल ट्यूब में) के साथ परिणामी supernatant पूल करें। इस एकल 50 एमएल ट्यूब में बर्फ-ठंडे पीबीएस के 30 मिलीलीटर में विघटित क्रिप्ट्स होने चाहिए।
  19. पूल किए गए 2-4 अंशों से एक 50 μL ऐलीकोट निकालें और इसे एक coverslip पर रखें। एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उपकला क्रिप्ट्स की उपस्थिति के लिए आकलन करें।
    नोट:: यदि crypts मौजूद नहीं हैं, तो crypts जारी किए जाने तक pipetting के दौरान अधिक बल का उपयोग कर चरण 1.17 और 1.18 दोहराएँ। सुनिश्चित करें कि क्रिप्ट्स समय से पहले क्रिप्ट अलगाव बफर में चरण 1.14 से या चरण 1.16 से अंश 1 में विस्थापित नहीं थे।
  20. पीबीएस 2 के साथ एक 100 μm छलनी और 50 मिलीलीटर ट्यूब को प्री-कोट करें। इस छलनी के माध्यम से और पूर्व लेपित 50 मिलीलीटर ट्यूब में pooled तहखाने अंश पास.
  21. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर तनावपूर्ण क्रिप्ट अंशों को नीचे स्पिन करें।
  22. supernatant को त्यागें और बर्फ-ठंडा उन्नत DMEM / F12 के 10 मिलीलीटर में crypts resuspend। क्रिप्ट्स को 15 एमएल ट्यूब पर ले जाएं।
  23. एकल कोशिकाओं और लिम्फोसाइटों को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 210 x g पर क्रिप्ट्स को स्पिन करें।
  24. बर्फ-ठंडे उन्नत DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर में crypts resuspend.
  25. एक 10 μL ऐलीकोट निकालें और इसे एक coverslip पर रखें। एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, क्रिप्ट एकाग्रता निर्धारित करने के लिए क्रिप्ट्स की संख्या की गणना करें।
  26. ~ 400 और ~ 1,500 crypts के लिए आवश्यक मात्रा की गणना करें। पीबीएस 2 के साथ एक p1000 टिप को प्री-कोट करें और इस टिप का उपयोग आवश्यक मात्रा (~ 400 और ~ 1,500 क्रिप्ट्स युक्त) को अलग-अलग 1.5 एमएल ट्यूबों में पिपेट करने के लिए करें।
  27. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर crypts नीचे स्पिन।
  28. जितना संभव हो उतना supernatant निकालें, और फिर बर्फ पर रखे गए TBEM के 80 μL में क्रिप्ट्स को फिर से निलंबित करें (मैट्रिक्स जेलेशन को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्री-कूल पिपेट टिप्स, जो 12 डिग्री सेल्सियस पर होता है)।
  29. इनक्यूबेटर से चरण 1.1 में रखी गई 24-अच्छी तरह से प्लेट को हटा दें। धीरे से पिपेट 40 μL क्रिप्ट्स के एक धीमी गति से, परिपत्र गति में एक अच्छी तरह से केंद्र में एक फ्लैट लेकिन 3 डी गुंबद संरचना बनाने के लिए, या तीन अलग-अलग छोटे गुंबदों में।
    नोट: ऑर्गेनोइड्स की व्यवहार्यता गुंबद के केंद्र में सबसे कम है जहां पोषक तत्व और गैसें कम प्रभावी ढंग से31 तक पहुंचती हैं; इस प्रकार, स्पष्ट 3 डी संरचनाओं को बनाए रखते हुए मीडिया के संपर्क में आने वाले सतह क्षेत्र को अधिकतम करना महत्वपूर्ण है।
  30. चरण 1.29 को दोहराएं ताकि ~ 200 क्रिप्ट्स प्रति अच्छी तरह से घनत्व के साथ कुल दो कुओं को बनाया जा सके और प्रति अच्छी तरह से ~ 750 क्रिप्ट्स के घनत्व के साथ दो और कुओं को बनाया जा सके। 15-20 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में सीधे रखें, चिपचिपा लेकिन अभी भी तरल मैट्रिक्स गुंबदों को बाधित न करने का ध्यान रखें।
  31. प्रति अच्छी तरह से (चरण 1.2 से) पूर्व-गर्म ईएनआर मीडिया के 550 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इस स्तर पर, यह WNT एगोनिस्ट (CHIR 99021) और 5 μM Rho Kinase inhibitor (Y-27632) के 5 μM के साथ ENR माध्यम के पूरक करने का सुझाव दिया जाता है संस्कृति के पहले 24 ज के लिए अलगाव के बाद अलगाव के लिए उपज और दक्षता में सुधार करने के लिए उपज और ऊतक से ताजा अलग crypts के organoid पीढ़ी की दक्षता में सुधार करने के लिए।
    नोट: क्रिप्ट्स को 24 घंटे के भीतर गोल संरचनाओं को बनाने के लिए बंद होना चाहिए, और क्रिप्ट कलियों को 2-4 दिनों के भीतर दिखाई देना चाहिए (चित्रा 1 ए)।
  32. चरण 1.31 में इनक्यूबेशन के अंत में ताजा ईएनआर माध्यम के साथ बदलें, और फिर हर ~ 2 दिन या जब संस्कृति माध्यम में फिनोल पीएच संकेतक पीला नारंगी हो जाता है, लेकिन इससे पहले कि यह पीला हो जाए।

2. murine छोटे आंत्र organoids के रखरखाव

नोट: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग रखरखाव और murine छोटे आंत्र organoids के passaging का वर्णन करता है। ऑर्गेनोइड्स को पहले काटा जाता है, और फिर एक मुड़े हुए पी 1000 टिप का उपयोग करके यांत्रिक रूप से बाधित किया जाता है। यह प्रक्रिया विस्तार के लिए कई छोटे टुकड़ों में कई क्रिप्ट्स से मिलकर बड़े ऑर्गेनोइड्स को तोड़ती है और मृत कोशिकाओं को जारी करती है जो स्यूडोलुमेन में जमा हो गई हैं। मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड रखरखाव को भी कहीं और24,25,27 अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। सभी प्रक्रियाओं को बाँझ सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग करके एक एसेप्टिक वातावरण में आयोजित किया जाना चाहिए। हर 4-5 दिनों में एक बार ऑर्गेनोइड्स का मार्ग या विस्तार, ऑर्गेनोइड्स के फटने से पहले ऑर्गेनोइड लुमेन में मलबे के पर्याप्त संचय से होता है। ऑर्गेनोइड्स को ऑर्गेनोइड घनत्व के आधार पर 1: 2-1: 3 के अनुपात में पारित किया जा सकता है, जो प्रति अच्छी तरह से 100-200 ऑर्गेनोइड्स के बीच होगा।

  1. चरण 1.1 और 1.2 के रूप में, बर्फ (40 μL / अच्छी तरह से) पर TBEM पिघलना और ENR माध्यम (550 μL प्रति अच्छी तरह से) तैयार करें। मध्यम और मानक ऊतक संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से प्लेट का इलाज करें।
  2. इनक्यूबेटर से ऑर्गेनोइड्स युक्त प्लेट को हटा दें। मीडिया को कुएं से पारित करने के लिए छोड़ दें।
  3. अच्छी तरह से बर्फ-ठंडा उन्नत DMEM / F12 के 500 μL जोड़ें। एक p1000 टिप का उपयोग करना (टिप इंटीरियर से चिपके ऑर्गेनोइड से बचने के लिए मीडिया के साथ पूर्व-लेपित), ऑर्गेनोइड्स को 15 एमएल ट्यूब में काट लें।
  4. बर्फ-ठंडे उन्नत DMEM / F12 के 250-300 μL के साथ अच्छी तरह से कुल्ला यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई ऑर्गेनोइड्स कुएं में नहीं रहता है, और चरण 2.3 से काटे गए ऑर्गेनोइड्स युक्त 15 एमएल ट्यूब में पूल करता है। कई कुओं को पास करते समय चरण 2.3 और 2.4 को दोहराएं और एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब में कई कुओं से ऑर्गेनोइड्स को पूल करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर ऑर्गेनोइड्स को नीचे स्पिन करें।
  6. centrifugation पर, सुनिश्चित करें कि चार दिखाई देने वाले अंश हैं: स्वस्थ ऑर्गेनोइड्स के साथ एक आधार अंश, एक केंद्रीय और स्पष्ट मैट्रिक्स अंश, एकल और मृत कोशिकाओं वाला एक मैट्रिक्स अंश, और एकल और मृत कोशिकाओं वाली एक ऊपरी supernatant परत। supernatant, मलबे अंश, और के रूप में संभव के रूप में स्पष्ट मैट्रिक्स टुकड़ा के रूप में अधिक से अधिक organoids के छर्रे को बाधित किए बिना निकालें.
  7. धीरे से एक p1000 पिपेट टिप (लगभग 2-5 मिमी मोड़) की नोक को मोड़ें। पीबीएस 2 या उन्नत DMEM / F12 में इस टिप को प्री-कोट करें। इस टिप का उपयोग करते हुए, ऑर्गेनोइड्स को 10-20 बार ऊपर और नीचे करने के लिए ऑर्गेनोइड्स और शेष मैट्रिक्स को यांत्रिक रूप से बाधित करने के लिए पिपेट करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 210 x g पर नीचे स्पिन करें।
  9. चरण 2.6 के रूप में, supernatant, मलबे अंश, और स्पष्ट मैट्रिक्स टुकड़ा के रूप में के रूप में अधिक से अधिक के रूप में संभव के रूप में अलग crypts के छर्रे को बाधित किए बिना निकालें. यदि स्वस्थ क्रिप्ट्स या छोटे ऑर्गेनोइड्स ने एक स्पष्ट गोली का गठन नहीं किया है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 300 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. TBEM की आवश्यक मात्रा की गणना करें (80-120 μL काटे गए ऑर्गेनोइड्स के प्रति कुएं के आधार पर कि क्या 1: 2 या 1: 3 मार्ग अनुपात का उपयोग किया जाता है)।
  11. TBEM की गणना की मात्रा में गोली resuspend और एक गुंबद बनाने के लिए पूर्व गर्म 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए अच्छी तरह से 40 μL लागू होते हैं। 15-20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ2) में प्लेट को सीधे रखें।
  12. अच्छी तरह से प्रति ENR माध्यम के 550 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर इनक्यूबेट करें। 24 घंटे के बाद ऑर्गेनोइड गठन के लिए संस्कृतियों की जांच करें। हर 2-3 दिनों के बाद पारित होने पर ताजा ईएनआर माध्यम के साथ बदलें।

3. छोटे आंतों के लामिना propria जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के अलगाव

नोट: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग RORπtGFP रिपोर्टर चूहों के मुरीन छोटी आंत लामिना प्रोपरिया से ILC1 के अलगाव का वर्णन करता है। इसमें उपकला सेल हटाने, ऊतक पाचन, लिम्फोसाइटों के घनत्व ढाल पृथक्करण, और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) के माध्यम से आईएलसी 1 अलगाव शामिल है। चित्रा 2 में गेटिंग रणनीति के बाद FACS अलगाव के लिए बाह्य कोशिकीय धुंधला मास्टरमिक्स (तालिका 4) की आवश्यकता होती है, जिसमें मशीन (तालिका 2) और गेटिंग (तालिका 3) सेट अप के लिए तालिका 2 और तालिका 3 में वर्णित अतिरिक्त धुंधला नियंत्रण होते हैं। RORγtGFP रिपोर्टर चूहों का उपयोग लाइव, शुद्ध ILC1 को अलग करने और RORπtGFP + ILC3 को गेट आउट करने के लिए किया जाता है। लामिना प्रोपरिया लिम्फोसाइट्स के अलगाव के लिए ऊतक प्रसंस्करण को भी कहीं और वर्णित किया गयाहै।

  1. ऊतक प्रसंस्करण
    नोट: व्यक्तिगत जैविक पशु प्रतिकृतियों से ऊतक को इस प्रोटोकॉल में अलग रखा जाता है। इन नमूनों को उचित रूप से लेबल किया जाना चाहिए और जब भी संभव हो बर्फ पर रखा जाना चाहिए। पाचन एंजाइमों को छोड़कर सभी अभिकर्मकों को तेजी से ऊतक पाचन सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दी जानी चाहिए।
    1. पिघलने के लिए बर्फ पर TBEM रखें (40 μL / अच्छी तरह से)। एक मानक ऊतक-संस्कृति को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से इलाज किया गया प्लेट को पूर्व-गर्म करने के लिए रखें।
    2. ताजा उपकला हटाने बफर और पाचन बफर तैयार करें ( तालिका 1 देखें)। आइसोटोनिक कम चिपचिपाहट घनत्व ढाल माध्यम (LVDGM) (90% LVDGM और 10% 10x PBS), 40% आइसोटोनिक LVDGM, और 80% आइसोटोनिक LVDGM को बेअसर बफर (तालिका 1) में तैयार करें।
    3. एक 6-12-सप्ताह पुराने जानवर को कुल, संदंश और माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके छोटी आंत को विच्छेदित करें, और आंत को बर्फ पर पीबीएस के 15 मिलीलीटर में रखें।
    4. बर्फ पर 10 सेमी2 पेट्री डिश पर पीबीएस में आंत को डुबोएं और आंत से वसा को धीरे से लेकिन पूरी तरह से हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    5. पीयर के पैच (~ 5-10; वसा ऊतक की रेखा के विपरीत एक पंक्ति में चल रहा है) को हटा दें, लिम्फोइड ऊतक प्रेरक कोशिकाओं और बी-कोशिकाओं को कम करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके।
      नोट: पीयर के पैच रैग-/- और अन्य वंश-समाप्त जानवरों में अनुपस्थित हैं। हवा के बुलबुले के विपरीत, पीयर के पैच जगह में रहेंगे यदि नज किया जाता है।
    6. माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से काटें (अधिमानतः छिद्र से बचने के लिए गोल युक्तियों के साथ)। पीबीएस में डूबी आंत को रखते हुए, फेकल पदार्थ को हटाने के लिए हिलाएं।
    7. ऊतक को 2-4 सेमी लंबाई के टुकड़ों में काटें और उन्हें 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. बर्फ-ठंडे पीबीएस के लगभग 20-40 मिलीलीटर जोड़ें और श्लेष्म और मलबे को हटाने के लिए 5-15 सेकंड के लिए जोरदार रूप से हिलाएं।
    9. एक ताजा पेट्री डिश पर ट्यूब की सामग्री को छोड़ दें और संदंश का उपयोग करके एक ही 50 एमएल ट्यूब में आंतों के टुकड़ों को प्रतिस्थापित करें।
    10. चरण 3.1.8 और 3.1.9 3-4 बार दोहराएँ, या जब तक PBS स्पष्ट नहीं है।
  2. उपकला निष्कासन
    1. बर्फ पर एक ताजा पेट्री डिश में आंतों के टुकड़ों को रखें। संदंश का उपयोग करके, आंतों के खंडों को उठाएं और सूखी सतह पर टैप करके अतिरिक्त तरल को हटा दें।
    2. ऊतक को ~ 0.75-1 सेमी टुकड़ों में काटें और उन्हें एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। उपकला हटाने बफर के 5-7 मिलीलीटर जोड़ें (तालिका 1). ट्यूब भंवर और सुनिश्चित करें कि सभी आंतों के खंड बफर में डूब रहे हैं.
    3. 12-15 मिनट के लिए रॉकिंग (100-150 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। भंवर 20-30 s के लिए ट्यूब.
    4. चरण 3.2.1-3.2.3 को एक बार फिर दोहराएं, बादल supernatant (अंश में उपकला और इंट्रा-उपकला कोशिकाएं होती हैं) को त्यागना और इसे ताजा उपकला हटाने बफर के साथ बदलना।
  3. ऊतक का पाचन
    1. एक ताजा पेट्री पकवान पर टिप सामग्री. संदंश का उपयोग करके, आंतों के खंडों को उठाएं और अतिरिक्त तरल को त्यागने के लिए सूखी सतह पर टैप करें। बर्फ पर एक ताजा पेट्री पकवान में खंडों जगह.
    2. एक घने द्रव्यमान में पेट्री डिश के केंद्र में खंडों क्लस्टर. या तो दो स्केलपेल्स या तेज कैंची का उपयोग करके, ऊतक को बारीक रूप से काट दिया जाता है जब तक कि यह एक चिपचिपा स्थिरता तक नहीं पहुंच जाता है जो पी 1000 पिपेट टिप से गुजर सकता है।
    3. चिमटी का उपयोग करते हुए, कीमा बनाया हुआ ऊतक को एक साफ 50 एमएल ट्यूब में रखें। किसी भी शेष ऊतक को इकट्ठा करने के लिए पाचन बफर (तालिका 1) के 1-2 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश को कुल्ला करें और इसे कटा हुआ ऊतक के साथ 50 एमएल ट्यूब में पूल करें।
    4. कटा हुआ ऊतक में 5-7 मिलीलीटर पाचन बफर जोड़ें और सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक ट्यूब के नीचे एकत्र किए गए हैं।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें, मध्यम रॉकिंग (~ 100-150 आरपीएम) के साथ 15 मिनट के लिए। पाचन सहायता के लिए हर 5 मिनट में 20-30 s के लिए ट्यूब भंवर.
    6. जबकि नमूने incubating कर रहे हैं, प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा 50 mL ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 μm सेल छलनी जगह है। बेअसर बफर के 1-2 मिलीलीटर के साथ फिल्टर कोट (तालिका 1).
    7. भंवर इनक्यूबेशन समाप्त होने के बाद 20-30 s के लिए नमूने.
    8. लेपित 40 μm फ़िल्टर के माध्यम से आंशिक रूप से पचे हुए ऊतक को 50 mL ट्यूब में फ़िल्टर करें जिसमें बेअसर बफर होता है।
    9. 40 μm फ़िल्टर से अपाच्य ऊतक एकत्र करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और इसे 50 मिलीलीटर ट्यूब में वापस रखें, जिसमें पाचन किया गया था, पाचन के दूसरे दौर के लिए। फ़िल्टर निकालें और फ़िल्टर का पालन करने वाले किसी भी अपाच्य ऊतक को हटाने के लिए पाचन बफर के साथ उन्हें कुल्ला करें।
    10. एक बार के रूप में संभव के रूप में ज्यादा के रूप में undigested ऊतक फिल्टर से हटा दिया गया है और 50 mL ट्यूब है कि पाचन में प्रदर्शन किया गया था में वापस रखा गया है, फिल्टर 1-2 mL बेअसर बफर के साथ कुल्ला 50 mL ट्यूब फ़िल्टर supernatant युक्त पर.
    11. फ़िल्टर किए गए supernatant करने के लिए बेअसर बफर के 20-25 mL जोड़ें और ऊतक पाचन के दूसरे दौर के दौरान अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए इसे बर्फ पर रखें।
    12. अपाच्य ऊतक में एक और 5-10 मिलीलीटर पाचन बफर जोड़ें और चरण 3.3.5-3.3.10 को दोहराएं, जो पचे हुए ऊतक को उसी ट्यूब में फ़िल्टर करना सुनिश्चित करता है जैसा कि चरण 3.3.8 में उपयोग किया जाता है (एक ही फिल्टर को भी पुन: उपयोग किया जा सकता है)। 50 मिली लाइन तक पहुँचने तक बेअसर बफर के साथ फ़िल्टर कुल्ला, और फिर किसी भी शेष undigested ऊतक को छोड़ दें।
  4. घनत्व ढाल द्वारा लिम्फोसाइट अलगाव
    1. 10 मिनट के लिए 500 x g पर प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए एकत्रित supernatants स्पिन।
    2. चरण 3.4.1 के दौरान, प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब में 80% आइसोटोनिक एलवीडीजीएम के 5 एमएल जोड़ें।
    3. centrifugation के बाद, फ़िल्टर किए गए, पचे हुए ऊतक से supernatant को छोड़ दें। 40% आइसोटोनिक LVDGM के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित कर दिया, यह सुनिश्चित करते हुए कि गोली अच्छी तरह से homogenized है, और कोई बड़ा हिस्सा नहीं रहता है।
    4. पिपेट सहायता को अपनी सबसे धीमी सेटिंग पर सेट करते हुए, 80% आइसोटोनिक एलवीडीजीएम युक्त 15 एमएल ट्यूब को झुकाएं, और बहुत धीरे से 40% आइसोटोनिक एलवीडीजीएम में सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर को ओवरले करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सेल निलंबन 80% अंश के साथ मिश्रण नहीं करता है।
      नोट: यदि अंशों को कभी भी गलती से मिश्रण करना चाहिए, तो तेजी से लिम्फोसाइट्स वितरित करें जो पीबीएस से भरे दो 50 एमएल ट्यूबों के बीच 80% अंश तक पहुंच गए, और 500 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। उसके बाद, supernatant को छोड़ दें, और चरण 3.4.3-3.4.4 दोहराएँ।
    5. 900 x g और 20 °C पर ट्यूबों को स्पिन करें, त्वरण और मंदी के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंश बाधित नहीं हैं, सबसे कम सेटिंग पर सेट किया गया है। 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज (ब्रेक समय सहित नहीं)।
      नोट: इस चरण के बाद से सभी प्रक्रियाओं को बाँझ सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग करके एक एसेप्टिक ऊतक संस्कृति हुड में आयोजित किया जाना चाहिए।
    6. पीबीएस 2 के साथ प्रत्येक नमूने के लिए एक 50 एमएल ट्यूब को प्री-कोट करें और बर्फ-ठंडे पीबीएस के 45 एमएल जोड़ें।
    7. centrifugation के बाद, धीरे से 15 मिलीलीटर ट्यूब से ऊपरी मलबे की परत को हटा दें। पीबीएस 2 के साथ एक p1000 टिप कोट करें और इसका उपयोग 40% -80% ग्रेडिएंट के बीच लिम्फोसाइट-लदे इंटरफेज को 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए करें जिसमें 45 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस होता है।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर ट्यूबों को स्पिन करें।
    9. Supernatant को त्यागें और FACS बफर के 500 μL में छर्रे को फिर से निलंबित करें (PBS, 2% FCS, 0.5 mM EDTA, और 10 mM HEPES; तालिका 1 देखें)। पूर्व-कोट FACS बफर के साथ एक 40 μm फिल्टर और एक प्रवाह ट्यूब में सेल निलंबन फ़िल्टर करने के लिए इसका उपयोग करें। FACS बफर के एक अतिरिक्त 500 μL के साथ 50 mL ट्यूब कुल्ला और एक ही प्रवाह ट्यूब में फ़िल्टर।
    10. सेल निलंबन के परिणामी 1 मिलीलीटर से एक 10 μL ऐलीकोट निकालें। एक सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपज की गणना करें और प्रत्येक नमूने के लिए सेल एकाग्रता की गणना करें।
  5. छँटाई के लिए नमूना तैयारी - बाह्य कोशिकीय धुंधला
    नोट: बाह्य कोशिकीय धुंधला मास्टरमिक्स में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी, साथ ही साथ ठीक करने योग्य व्यवहार्यता डाई और एफसी ब्लॉक समाधान तैयार करने के लिए अभिकर्मकों का उपयोग 5 x 10 तक के लिए पर्याप्त सांद्रता में किया जाता है6 कोशिकाओं प्रति 100 μL. वॉल्यूम तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। आईएलसी 1 को सॉर्ट करने के लिए एफएसीएस मशीन मुआवजे के लिए, बाह्य कोशिकीय धुंधला मास्टरमिक्स में प्रत्येक फ्लोरोफोरस के लिए एकल-रंग नियंत्रण की आवश्यकता होती है। एंटीबॉडी के लिए, मुआवजे के मोतियों जिसमें एक सकारात्मक एंटीबॉडी बाध्यकारी मनका आबादी और एक नकारात्मक एंटीबॉडी गैर-बाध्यकारी मनका आबादी होती है, का उपयोग किया जा सकता है। पराबैंगनी (यूवी) फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई एकल रंग नियंत्रण के लिए, मुआवजे के मोतियों जिसमें अमाइन-प्रतिक्रियाशील (सकारात्मक संकेत के लिए) और गैर-प्रतिक्रियाशील (नकारात्मक संकेत के लिए) आबादी होती है, का उपयोग किया जा सकता है। से कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है RORγtGFPयूवी fixable व्यवहार्यता डाई एकल रंग नियंत्रण के लिए रिपोर्टर चूहों, के रूप में इन कोशिकाओं में एक GFP शामिल होगा+ संकेत।
    1. प्रत्येक नमूने से ~ 10 μL का एक छोटा सा एलीकोट निकालें और इसे एक अलग प्रवाह ट्यूब में पूल करें जिसमें FACS बफर के 250 μL शामिल हैं। ट्यूब को बर्फ पर रखें। इसका उपयोग बिना दाग वाले नियंत्रण के लिए किया जाएगा।
    2. नमूना ट्यूबों में शेष मात्रा में PBS के 1 mL जोड़ें। 3-5 मिनट के लिए 300-400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. प्रति नमूना यूवी फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई समाधान के 200 μL तैयार करें। पतला यूवी fixable व्यवहार्यता डाई (निर्माता के निर्देशों के बाद DMSO में resuspended) PBS में 1: 500 (या निर्माता के निर्देशों का पालन).
    4. supernatant त्यागें और यूवी fixable व्यवहार्यता डाई समाधान के 200 μL में नमूनों resuspend. भंवर ट्यूबों और 10-15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में ऊष्मायन.
    5. यूवी फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई को बुझाने के लिए ट्यूबों में एफएसीएस बफर के 2 एमएल जोड़ें, 10 एस के लिए भंवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 300-400 एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूज्ड ट्यूबों से supernatant को छोड़ दें।
    6. प्रति नमूना Fc ब्लॉक समाधान के 200 μL तैयार करें (FACS बफर में Fc ब्लॉक के 0.25 mg/ mL)।
    7. चरण 3.5.5 से प्रत्येक नमूने के लिए एफसी ब्लॉक समाधान के 200 μL जोड़ें, 10 s के लिए भंवर, और 10 मिनट के लिए 4 °C पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    8. एक ताजा प्रवाह ट्यूब के लिए FACS बफर के 500 μL जोड़ें। प्रत्येक नमूने से एक 2-5 μL ऐलीकोट निकालें और प्रतिदीप्ति माइनस एक (FMO) नियंत्रण के लिए ट्यूब में पूल करें।
    9. भंवर 10 s के लिए FMO ट्यूब और समान रूप से वितरित (100 μL प्रति ट्यूब) ताजा प्रवाह FMO नियंत्रण (वंश कॉकटेल FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO, और NK1.1 FMO) में से प्रत्येक के लिए लेबल ताजा प्रवाह ट्यूबों में वितरित; तालिका 3 देखें). प्रत्येक ट्यूब में ब्याज के एंटीबॉडी को छोड़कर सभी एंटीबॉडी जोड़ें (जैसा कि तालिका 3 में वर्णित है) और 10 सेकंड के लिए भंवर। FMO नियंत्रण को 4 °C पर अंधेरे में एक तरफ रखें।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 300-400 x g पर नमूनों (एफएमओ नियंत्रण नहीं) को सेंट्रीफ्यूज करें।
    11. तालिका 4 में वर्णित अंतिम एंटीबॉडी dilutions के साथ extracellular धुंधला mastermix (प्रति नमूना 200 μL) तैयार करें। चरण 3.4.10 से सेल गिनती के आधार पर उपयुक्त सेल एकाग्रता (प्रति 5 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 μL तक) के लिए धुंधला मात्रा समायोजित करें।
    12. नमूनों के लिए एक्स्ट्रासेल्युलर स्टेनिंग मास्टरमिक्स जोड़ें, 10 सेकंड के लिए भंवर, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में एक तरफ रखें।
    13. गेटिंग रणनीति (चित्रा 2) में उपयोग किए जाने के उद्देश्य से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए एक ताजा एकल रंग नियंत्रण तैयार करें। 20 s के लिए भंवर एंटीबॉडी क्षतिपूर्ति मोतियों, एक प्रवाह ट्यूब में मोतियों की 1 बूंद जोड़ें, एंटीबॉडी के 0.5 μL के साथ दाग (जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है, या निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए), और 10 s के लिए भंवर।
    14. एक यूवी fixable व्यवहार्यता डाई एकल रंग नियंत्रण एक अमाइन प्रतिक्रियाशील मुआवजा मनका किट का उपयोग कर तैयार करें. 20 s के लिए भंवर अमाइन-प्रतिक्रियाशील मुआवजा मोतियों, लाइव / मृत यूवी डाई के 1 μL जोड़ें (जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है, या निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए) और 10 s के लिए भंवर।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में नमूने, एफएमओ, और एकल रंग नियंत्रण को इनक्यूबेट करें।
    16. इस समय के दौरान, सॉर्ट की गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक नमूने के लिए 1.5 mL ट्यूबों के लिए उन्नत DMEM / F12 में 10% FBS के 400-500 μL जोड़ें।
    17. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक नमूने, FMO नियंत्रण, और एकल रंग नियंत्रण के लिए PBS2 के 2 mL जोड़ें।
    18. सेंट्रीफ्यूज नमूने, FMO नियंत्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 300-400 x g पर एकल रंग नियंत्रण.
    19. सभी centrifuged ट्यूबों से supernatant त्याग. 10 s के लिए FACS बफर और भंवर के 250 μL में नमूनों और FMO नियंत्रण ों को फिर से निलंबित करें।
    20. PBS2 के 250 μL में एकल रंग नियंत्रण को पुन: निलंबित करें। यूवी fixable व्यवहार्यता डाई एकल रंग नियंत्रण के लिए अमाइन गैर प्रतिक्रियाशील मोतियों की 1 बूंद जोड़ें. भंवर 10 s के लिए सभी नियंत्रण.
    21. कोशिकाएं अब सॉर्ट करने के लिए तैयार हैं। नमूने, एफएमओ नियंत्रण, और अंधेरे में बर्फ पर एकल रंग नियंत्रण रखें जब भी संभव हो सेल व्यवहार्यता में सुधार करने और photobleaching से संकेत के नुकसान को रोकने के लिए।

4. जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ छोटे आंतों organoids की सह संस्कृति

नोट: यह अनुभाग सॉर्ट किए गए म्यूरीन छोटे आंतों के आईएलसी 1 (अनुभाग 3 में प्रोटोकॉल के बाद अलग-थलग) की सह-संस्कृति का वर्णन करता है, जिसमें मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (अनुभाग 1 और 2 में वर्णित) होते हैं। ऑर्गेनोइड्स को पारित होने के 1-2 दिनों के बाद बेहतर ढंग से उपयोग किया जाना चाहिए। सह-संस्कृति में ऑर्गेनोइड्स की कटाई, आईएलसी 1 की उचित संख्या को जोड़ना, पैलेट ऑर्गेनोइड्स और आईएलसी 1 को एक साथ सेंट्रीफ्यूज करना और टीबीईएम में फिर से निलंबित करना शामिल है। एक बार जब ILC1 को अलग कर दिया जाता है तो इस अनुभाग को जितनी जल्दी हो सके पूरा करें। सभी प्रक्रियाओं को बाँझ सामग्री और अभिकर्मकों का उपयोग करके एक एसेप्टिक वातावरण में आयोजित किया जाना चाहिए।

  1. सुनिश्चित करें कि चरण 3.1.1 से TBEM पिघला दिया गया है।
  2. 1-2-दिन पुराने ऑर्गेनोइड्स की कटाई करें जैसा कि चरण 2.3 और 2.4 में वर्णित है।
  3. ठंडे बर्फ-ठंडे उन्नत DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर में organoid गोली resuspend. ऑर्गेनोइड्स को पास करते समय किए गए पी 1000 टिप को मोड़ें नहीं, क्योंकि यहां इरादा सह-संस्कृति के लिए ऑर्गेनोइड संरचना को बनाए रखना है। यदि आवश्यक हो, तो ऑर्गेनोइड्स को अलग-अलग पीबीएस 2 लेपित 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में बर्फ पर एक छोटी अवधि के लिए अलग-अलग सह-संस्कृति स्थितियों के बीच वितरित करने के लिए रखें।
    नोट: केवल ऑर्गेनोइड्स की तैयारी शुरू करें जब आईएलसी नमूने सह-संस्कृति के लिए तैयार हो जाते हैं; बर्फ पर काम करते हैं और तेजी से के रूप में जल्द ही organoids उपकला कोशिका मृत्यु को कम से कम करने के लिए काटा गया है.
  4. पूर्व कोट एक 1.5 मिलीलीटर प्रति आईएलसी प्रतिकृति नमूना PBS2 के साथ ट्यूब. प्रत्येक ट्यूब में ~ 100-200 ऑर्गेनोइड्स (24-अच्छी तरह से प्लेट का लगभग 1 अच्छी तरह से) वितरित करें।
  5. पीबीएस 2 में एक p1000 टिप को प्री-कोट करें और FACS शुद्धिकरण (250-300 μL + सॉर्ट की गई मात्रा) के बाद ILC1s की मात्रा का आकलन करने के लिए इसका उपयोग करें। सॉर्ट से रिकॉर्ड किए गए कक्षों की संख्या का उपयोग करके प्रति एमएल ILC1 की एकाग्रता निर्धारित करें और आवश्यक वॉल्यूम निर्धारित करें।
  6. एक ही PBS2 लेपित p1000 टिप का उपयोग करते हुए, PBS2 लेपित 1.5 mL ट्यूब में कम से कम 500 ILC1s जोड़ें जिसमें ऑर्गेनोइड्स होते हैं। यदि सॉर्ट से प्राप्त ILC1s की संख्या 500 से कम है, तो स्थानांतरण से कोशिकाओं के नुकसान को कम करने के लिए मूल सॉर्ट युक्त ट्यूब में सीधे ऑर्गेनोइड जोड़ें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर ILC1 और organoids नीचे स्पिन। यदि संभव हो, तो छोटे व्यास के टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज से बचें, क्योंकि ये ट्यूब की नोक पर एक गोली बनाने के विरोध में ट्यूब इंटीरियर के किनारे के साथ कोशिकाओं को पूल करेंगे। चूंकि सेल संख्या बहुत कम है, इसलिए इन चरणों के दौरान कोशिकाओं के नुकसान को कम करना आवश्यक है।
  8. धीरे-धीरे और धीरे-धीरे गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant को हटा दें (जो आंखों से दिखाई नहीं दे सकता है, विशेष रूप से नो-ऑर्गेनोइड आईएलसी-केवल नियंत्रण में)। नमूने को बर्फ पर रखें।
  9. TBEM के प्रति अच्छी तरह से 30 μL में ठंडे छर्रे को फिर से निलंबित करें। ठंडी सतह पर ट्यूब को पकड़ते समय (उदाहरण के लिए, ऊतक संस्कृति हुड में रखा गया बर्फ का एक छोटा सा बॉक्स), यहां तक कि वितरण सुनिश्चित करने के लिए ऑर्गेनोइड्स और आईएलसी को कम से कम 10-15 बार मिलाएं। ऑर्गेनोइड्स को नुकसान पहुंचाने और बुलबुले के गठन से बचने के लिए, बार-बार लेकिन धीरे-धीरे ट्राइट्यूरेट करें।
  10. एक गुंबद बनाने के लिए एक पूर्व-गर्म 24- या 48-अच्छी तरह से प्लेट के लिए TBEM में ILC-organoids के प्रति अच्छी तरह से 30 μL लागू करें। प्लेट को सीधे इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में10-20 मिनट के लिए रखें।
    नोट: यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि ILC-केवल और ऑर्गेनोइड-केवल नियंत्रण डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सेट किए जाते हैं। आईएलसी 1 दुर्लभ हैं, लेकिन जीएफपी- आईएलसी 2 को इम्यूनोफ्लोरेसेंस या एफएससी / एसएससी फ्लो साइटोमेट्री नियंत्रण के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जहां वैज्ञानिक रूप से उपयुक्त है।
  11. पूर्ण ILC1 माध्यम (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol) के 550 μL (प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें; तालिका 1 देखें) किसी भी वांछित प्रयोगात्मक साइटोकिन्स या अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
  12. 24 घंटे के बाद, धीरे से इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें और प्लेट को 1 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति हुड में बैठने की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लिम्फोसाइट्स बस गए हैं।
  13. मीडिया के 200-250 μL निकालें और इसे 24-अच्छी तरह से प्लेट के खाली कुएं में रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई लिम्फोसाइट्स नहीं हटाया गया था, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ इस supernatant की जाँच करें।
    1. यदि supernatant स्पष्ट है, तो मूल अच्छी तरह से सह-संस्कृति के लिए ताजा ILC1 माध्यम के 300 μL जोड़ें। यदि लिम्फोसाइट्स supernatant में मौजूद हैं, 300-400 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और ताजा ILC1 माध्यम के 300 μL में resuspend और मूल अच्छी तरह से मीडिया के शेष 200-250 μL में इसे जोड़ें। हर 1-2 दिनों में मीडिया को फिर से भरना सुनिश्चित करें या जब मीडिया पीला-नारंगी / पीला हो जाता है।
      नोट:: मीडिया को पर्याप्त रूप से वाष्पित करने की अनुमति न दें कि मैट्रिक्स गुंबद की नोक मीडिया की सतह को तोड़ती है। हमेशा सुनिश्चित करें कि मैट्रिक्स पूरी तरह से जलमग्न है। ऊतक संस्कृति प्लेटों में केंद्रीय कुओं का उपयोग करके और आसपास के कुओं में पीबीएस के ~ 600 μL जोड़कर अतिरिक्त वाष्पीकरण से बचा जा सकता है। वयस्क आईएलसी के साथ सह-संस्कृतियां 1-4 दिनों के लिए स्थिर होती हैं, जिसके बाद बड़े व्यवधान के बिना बीज वाले ऑर्गेनोइड्स टूट जाएंगे और नए क्रिप्ट्स के रूप में फिर से तैयार होंगे। यदि उपकला का विश्लेषण करते हैं, तो यह अनुशंसा की जाती है कि सह-संस्कृतियों की स्थापना के 1-4 दिनों के भीतर संस्कृतियों का विश्लेषण किया जाता है।
    2. एकल सेल या बल्क आरएनए-सेक या आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लाइसिस बफर में लक्ष्य आबादी के इम्युनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री, या एफएसीएस शुद्धिकरण का उपयोग करके डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करें, जैसा कि संदर्भ8 में वर्णित है।

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Representative Results

जब सफलतापूर्वक पूरा हो जाता है, तो ताजा अलग-थलग क्रिप्ट्स को 2-4 दिनों के भीतर नवोदित क्रिप्ट संरचनाओं का निर्माण करना चाहिए (चित्रा 1 ए)। स्वस्थ और मजबूत ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को सक्रिय रूप से बढ़ना चाहिए और प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप से पारित और विस्तारित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल RORπtGFP murine ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइन से छोटे आंतों के ILC1 के अलगाव का वर्णन करता है, जो FACS (चित्रा 2) द्वारा लाइव ILC1 के अलगाव की अनुमति देता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अपेक्षित ILC1 गिनती श्रेणी 350-3,500 पृथक कक्ष है।

ऑर्गेनोइड्स के साथ बीज होने के बाद, सह-संस्कृतियों को इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (चित्रा 3 ए-बी) द्वारा कल्पना की जा सकती है। आईएलसी और उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा भी किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है। ILC1 उपकला CD44 को नियंत्रित करता है, जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 4A-B) और immunocytochemistry (चित्रा 4C) की विशेषता है। विशेष रूप से, ILC1 organoids में CD44 v6 splice संस्करण की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जैसा कि RT-qPCR (चित्रा 4D) द्वारा प्रदर्शित किया गया है।

तालिका 1: मीडिया और बफ़र रचनाएं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: एकल रंग नियंत्रण. चित्र 2 में परिभाषित गेटिंग रणनीति का उपयोग करके छोटी आंत लामिना प्रोपरिया आईएलसी 1 को अलग करने के लिए एकल रंग नियंत्रण की संरचना। उपयोग किए गए एंटीबॉडी का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: प्रतिदीप्ति माइनस एक (FMO) mastermixes. वंश कॉकटेल FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO, और NK1.1 FMO के लिए FMO mastermixes की संरचना। एफएमओ मास्टरमिक्स में ब्याज के एंटीबॉडी को छोड़कर उपयोग किए जाने वाले सभी एंटीबॉडी होते हैं और इसका उपयोग नमूना एलीकोट को दागने के लिए किया जाता है। वंश कॉकटेल CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C के रूप में परिभाषित किया गया है। उपयोग किए गए एंटीबॉडी का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: एक्स्ट्रासेल्युलर स्टेनिंग मास्टरमिक्स। सांद्रता को FACS बफर के 200 μL में 5 x 106 कोशिकाओं तक धुंधला करने के लिए समायोजित किया जाता है। उपयोग किए गए एंटीबॉडी का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्रा 1: Murine छोटे आंत्र organoids. (ए) की प्रतिनिधि छवि ने सफलतापूर्वक छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स को 2-3 दिनों के पारित होने के बाद और (बी) असफल संस्कृति उत्पन्न की। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसजेनिक RORΠtGFP रिपोर्टर चूहों के छोटे आंत लामिना propria से ILC1s को अलग करने के लिए गेटिंग रणनीति। FACS द्वारा ट्रांसजेनिक RORTGFP रिपोर्टर चूहों के छोटे आंत लामिना प्रोपरिया से ILC1 अलगाव के प्रतिनिधि प्रवाह cytometric साजिश. ILC1s को लाइव, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORπt-, NKp46+, और NK1.1+ के रूप में परिभाषित किया गया है। एन से प्रतिनिधि = >50 चूहों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Organoid और ILC1 सह संस्कृतियों. उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (ए), confocal माइक्रोस्कोपी छवियों (बी), और FACS भूखंडों (सी) छोटे आंतों organoids (SIO) अकेले सुसंस्कृत (ऊपर) या ILC1s (नीचे) के साथ (N = 3 चूहों से ILC1s के साथ प्रयोगों के प्रतिनिधि) के साथ सुसंस्कृत छोटे आंतों organoids (SIO) के भूखंडों. (बी) सीडी 45 के साथ धुंधला ILC1s और Zonula occludens प्रोटीन 1 (ZO-1) organoids में उपकला कोशिकाओं को चिह्नित करता है। स्केल सलाखों: 50 μm. (C) पहले एकल, जीवित कोशिकाओं पर गेटेड. उपकला सेलुलर आसंजन अणु (EpCAM) ऑर्गेनोइड्स में आंत्र उपकला कोशिकाओं (आईईसी) को चिह्नित करता है और CD45 चिह्न ILC1s को चिह्नित करता है। आंकड़ा संदर्भ8 से अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र4: छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति में ILC1s आंतों की उपकला कोशिकाओं में CD44 के अपरेग्युलेशन को चलाता है। (A) उपकला सेलुलर आसंजन अणु (EpCAM) सकारात्मक उपकला कोशिकाओं (लाइव, CD45-, EpCAM +) में CD44 अभिव्यक्ति का एक प्रतिनिधि साइटोमेट्रिक प्लॉट छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (SIO) से अकेले (बाएं) या ILC1s के साथ 4 दिनों (दाएं) के लिए सुसंस्कृत है। (बी) आंतों की उपकला कोशिकाओं (आईईसी) में सीडी 44 अभिव्यक्ति का प्रवाह परिमाणीकरण (एन = 5 चूहों से आईएलसी 1 एस)। (सी) अकेले d4 SIO (बाएं) में CD44 स्थानीयकरण की प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोपी छवि या ILC1s (दाएं) (N = 3 चूहों का प्रतिनिधि) के साथ सह-सुसंस्कृत। स्केल सलाखों: 50 μm. (डी) RT-qPCR CD44 splice वेरिएंट v4, और v6 (N = 3) के लिए एक्सोन-विशिष्ट प्राइमरों के साथ। यह आंकड़ा संदर्भ8 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल म्यूरीन छोटी आंत ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के तरीकों का वर्णन करता है, आंतों के पृथक्करण प्रोटोकॉल के दौरान लिम्फोसाइट्स के नुकसान को कम करके दुर्लभ आईएलसी 1 को अलग करता है, और इन दो डिब्बों के बीच सह-संस्कृतियों की स्थापना करता है। इस प्रोटोकॉल के कई चरण हैं, और जबकि कुछ आईएलसी 1 एस के लिए विशिष्ट हैं, इस दृष्टिकोण को अन्य आंतों के प्रतिरक्षा सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है, और सह-संस्कृति सेटअप को व्यक्तिगत शोध प्रश्नों के अनुरूप मॉड्यूलर रूप से अनुकूलित किया जा सकता है। कई महत्वपूर्ण कदम (जो विचलित नहीं होने की सिफारिश की जाती है), साथ ही साथ इस प्रोटोकॉल के अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तत्वों के लिए समस्या निवारण दिशानिर्देश, यहां हाइलाइट किए गए हैं।

एकल Lgr5 + -eGFP आंतों स्टेम कोशिकाओं से मुरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स का उपयोग तेजी से अच्छी तरह से स्थापित हो रहा है33,34; हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, यह CD45.1 जानवरों से Lieberkuehn के बरकरार, पूरे crypts को अलग करने का सुझाव दिया है। न केवल बरकरार क्रिप्ट्स एकल Lgr5 + कोशिकाओं की तुलना में अधिक तेज़ी से ठीक होते हैं, लेकिन GFP रिपोर्टर के बिना CD45.1 जानवरों का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि कोई क्रॉस-दूषित CD45.2 + ILC ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों से विश्लेषण नहीं किया जाता है और जीएफपी-आधारित रिपोर्टर युक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपयोग के साथ संगत है। लेखकों के अनुभव में, ऑर्गेनोइड्स के 1-3 मार्गों के बाद कोई मेसेनकाइमल या प्रतिरक्षा कोशिकाएं नहीं होती हैं। इसलिए ऑर्गेनोइड्स की स्थापना के लिए CD45.2 या अन्य जानवरों का उपयोग पूरी तरह से स्वीकार्य है। ऑर्गेनोइड स्थापना के दौरान, यदि क्रिप्ट्स चरण 1.1.19 पर मौजूद नहीं हैं, तो बरकरार क्रिप्ट्स को हटाने के लिए अधिक कठोर मैनुअल मिलाते हुए आवश्यक हो सकते हैं। परिवेश के कमरे के तापमान जैसे पर्यावरणीय कारक (उदाहरण के लिए, चाहे प्रक्रिया गर्मियों या सर्दियों में की जाती है) पृथक्करण के दौरान इनक्यूबेशन समय में कुछ परिवर्तनशीलता जोड़ सकते हैं। क्रिप्ट्स का सीडिंग घनत्व प्रारंभिक ऑर्गेनोइड गठन उपज को प्रभावित करेगा; इसलिए सफलता सुनिश्चित करने के लिए कम से कम दो अलग-अलग घनत्वों को बीज करने की सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, 200-750 यहां सुझाया गया है, लेकिन इस सीमा को व्यक्तिगत आवश्यकताओं के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है)।

एक बार स्थापित होने के बाद, आंतों की ऑर्गेनोइड संस्कृतियां एक ही माउस तनाव से स्थापित लाइनों के बीच हेटरोजेनस होती हैं, जठरांत्र संबंधी मार्ग (उदाहरण के लिए, ग्रहणी बनाम इलियम) के साथ, और यहां तक कि ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के एक ही कुएं के भीतर भी35,36। यद्यपि यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड्स के कई अलग-अलग बैचों पर मजबूत पाया गया था, यह विषमता डेटा परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकती है। फेनोटाइपिक रूप से अप्रासंगिक डेटा से तकनीकी शोर को कम करने के लिए ऑर्गेनोइड रखरखाव (पासिंग और मीडिया परिवर्तन) के अनुरूप होना अच्छा अभ्यास है। इसमें प्री-सीडिंग पासिंग टाइमलाइन के अनुरूप होना और ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले बल के साथ शामिल है। तुलना किए जा रहे प्रयोगों के लिए एक ही बेसल मैट्रिक्स का उपयोग करने की भी सिफारिश की जाती है, और विभिन्न जानवरों (जब वित्तीय और तकनीकी रूप से व्यवहार्य हो) से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की जैविक प्रतिकृति का उपयोग करके किए जाने वाले प्रयोगों के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम मजबूत रूप से पुन: प्रस्तुत करने योग्य हैं।

सह-संस्कृतियों की स्थापना में, उपकला कोशिकाओं के लिए प्रतिरक्षा का अनुपात एक महत्वपूर्ण विचार है जिसे अनुसंधान प्रश्नों के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होगी। यदि आईएलसी पर उपकला कोशिकाओं के प्रभाव से पूछताछ की जा रही है, तो सभी आईएलसी को संतृप्त करने के लिए बीज वाले ऑर्गेनोइड्स की संख्या को पर्याप्त होने की आवश्यकता होगी। इसके विपरीत, उपकला पर आईएलसी के प्रभाव का आकलन करते समय, विभिन्न आईएलसी / उपकला अनुपात के परिणामस्वरूप विभिन्न फेनोटाइपिक आउटपुट हो सकते हैं, जो म्यूकोसा में आईएलसी सबसेट संवर्धन के अंतर राज्यों को दर्शाते हैं। आईएलसी 1 व्यवहार्यता संस्कृति में अच्छी तरह से बनाए रखी जाती है, और आबादी हल्के विस्तार से गुजरेगी, जिसमें ~ 500 आईएलसी 1 और 100 छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स (एसआईओ) औसतन 2-3-गुना विस्तार से गुजर रहे हैं। हालांकि, यह उपज अतिरिक्त उपचारों से प्रभावित होगी, जिसमें टीजीएफ-न्यूट्रलाइजेशन में सुधार और पी 38-निषेध सह-संस्कृति8 के बाद आईएलसी 1 की पूर्ण संख्या को कम कर देगा। सीडेड आईएलसी 1 संख्याओं के 50% से अधिक का कोई भी अप्रत्याशित नुकसान या तो आईएलसी 1 से एसआईओ (सीडेड क्रिप्ट्स की संख्या में वृद्धि), एसआईओ संदूषण (यह सुनिश्चित करना कि एंटीबायोटिक कॉकटेल काम कर रहा है और माइकोप्लाज्मा के लिए supernatant का परीक्षण कर रहा है), या साइटोकाइन स्टॉक में गुणवत्ता के मुद्दों का परिणाम हो सकता है, जिसमें ILC1 आईएल -2 या आईएल -15 की कमी के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील है। केंद्रित 96- या 48-अच्छी तरह से प्लेटों से सह-संस्कृति supernatants सफलतापूर्वक ELISAs के लिए इस्तेमाल किया गया है। सह-संस्कृतियों को अलग करते समय, 20 मिनट के कोमल ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन के बाद डीएनएस के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने या क्षतिग्रस्त उपकला कोशिकाओं से सेल क्लम्पिंग को रोकने के लिए एकल कोशिकाओं के लिए ईडीटीए-आधारित पृथक्करण करने की सिफारिश की जाती है।

इस प्रोटोकॉल की एक ताकत यह है कि यह जटिल सेल प्रकारों के साथ न्यूनीकरणवादी संस्कृति स्थितियों को संतुलित करता है। हालांकि, इन संस्कृतियों में अन्य आईएलसी सबसेट के व्यवहार इस विशेष प्रोटोकॉल में मौजूद नहीं कारकों पर निर्भर हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, आईएलसी 3 सह-संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले लिंडेमेंस प्रोटोकॉल में, आईएल -23 को आईएलसी 3 रखरखाव और सक्रियण8 का समर्थन करने के लिए सह-संस्कृति मीडिया में अतिरिक्त रूप से पूरक किया गया था। आईएल -15 को इस प्रोटोकॉल में वर्णित सह-संस्कृति प्रणाली में आईएलसी 1 के रखरखाव में विशेष रूप से महत्वपूर्ण पाया गया था, जो आईएलसी 1 की पिछली रिपोर्टों के अनुरूप था, जिसमें होमियोस्टैसिस के लिए इस साइटोकाइन की आवश्यकता थी, हालांकि विकास6 नहीं। आईएलसी को सक्रिय करने के लिए, या आईएलसी 2 को बनाए रखने के लिए, विकास माध्यम को आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, आंत में अन्य सेलुलर डिब्बे, उपकला के अलावा, आईएलसी को विनियमित करते हैं। उदाहरण के लिए, आंतों के न्यूरॉन्स को आंशिक रूप से स्रावित न्यूरोपेप्टाइड्स37 की गतिविधि के माध्यम से आईएलसी 2 एस को संशोधित करने के लिए जाना जाता है। माइक्रोबियल कारक आईएलसी फेनोटाइप38 को भी प्रभावित करते हैं। इस सीमा को इन तत्वों के अलावा के माध्यम से दूर किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, साइटोकिन्स, पेप्टाइड्स, या माइक्रोबियल कारक, सह-संस्कृति प्रणाली में। यह आईएलसी और कई सेलुलर डिब्बों के बीच बातचीत की पूछताछ के लिए भी अनुमति दे सकता है एक कमीवादी सेटिंग में। इस तर्क के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि एंटी-बायोटिक / एंटी-माइकोटिक अभिकर्मकों को जोड़ा जाता है और अक्सर सह-संस्कृतियों की स्थापना से पहले ऑर्गेनोइड मीडिया में फिर से भर दिया जाता है। यह भी महत्वपूर्ण है कि सभी संस्कृतियों को एसेप्टिक वातावरण में किया जाता है क्योंकि किसी भी संस्कृति संदूषण (जैसे, कवक विकास या माइकोप्लाज्मा) की संभावना एंटीजन गैर-विशिष्ट आईएलसी को सक्रिय करेगी, जिससे महत्वपूर्ण फेनोटाइप ्स बनते हैं जो गैर-दूषित संस्कृतियों में मौजूद नहीं हो सकते हैं। इस कारण से, एंटी-बायोटिक / -माइकोटिक अभिकर्मकों की वापसी की सिफारिश नहीं की जाती है, यहां तक कि सह-संस्कृतियों में भी, क्योंकि वे उपकला या आईएलसी पर प्रतिकूल प्रभाव पैदा करने के लिए नहीं पाए गए थे।

यह विधि आईएलसी और आंतों के उपकला के बीच सिग्नलिंग मॉड्यूल को चिह्नित करने का एक अनूठा तरीका प्रदान करती है, जिससे दोनों डिब्बों के जीव विज्ञान की जांच की जा सकती है। एक ही सेल प्रकार से मिलकर अन्य इन विट्रो विधियों की तुलना में, यहां प्रस्तुत प्रणाली विवो फिजियोलॉजी में अधिक तुलनीय है और उपकला कोशिकाओं और आईएलसी के बीच कई संभावित सिग्नलिंग तंत्रों से पूछताछ करने में सक्षम बनाती है। इन विट्रो आईएलसी संस्कृति के अन्य तरीके मुख्य रूप से स्ट्रोमल फीडर सेल लाइनों पर भरोसा करते हैं, जैसे कि OP9 या OP9-DL139। यह रेखा नवजात माउस कैल्वरिया से ली गई है, जो आंतों के वातावरण का प्रतिनिधि नहीं है। जबकि इन ने आज तक विट्रो में आईएलसी को बनाए रखने के लिए स्वर्ण मानक प्रदान किया है, वे उपकला पर आईएलसी के प्रभाव को समझने के लिए अपने आवेदन में पर्याप्त सीमाओं का सामना करते हैं।

म्यूरीन छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स और लामिना प्रोपरिया व्युत्पन्न आईएलसी के बीच यहां वर्णित सह-संस्कृति प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण शोध अनुप्रयोग हैं। सह-संस्कृति की इस प्रणाली का उपयोग पहले से ही सीडी 44 + उपकला क्रिप्ट्स8 के विस्तार में आईएलसी 1 व्युत्पन्न टीजीएफ-β की भूमिका को निर्धारित करने के लिए किया गया है, जो सूजन आंत्र रोग में उपकला गतिशीलता की समझ में योगदान देता है। ये अध्ययन साहित्य के बढ़ते शरीर में योगदान करते हैं जो आंतों के होमियोस्टैसिस और सूजन 3 में उपकला-आईएलसी सिग्नलिंग के महत्वपूर्ण महत्व को रेखांकित करताहै।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

E.R. Wellcome Trust (215027/ Z/18/Z) से पीएचडी फैलोशिप को स्वीकार करता है। G.M.J. Wellcome Trust (203757/ Z/16/A) से पीएचडी फैलोशिप को स्वीकार करता है। डीसी NIHR GSTT BRC से पीएचडी studentship स्वीकार करता है। J.F.N. एक मैरी Skóodowska-Curie फैलोशिप, एक राजा के पुरस्कार फैलोशिप, एक RCUK / UKRI रदरफोर्ड फंड फैलोशिप (MR / R024812 / 1), और वेलकम ट्रस्ट (204394 / Z / 16 / Z) से विज्ञान में एक बीज पुरस्कार स्वीकार करता है। हम गाय के अस्पताल में स्थित बीआरसी फ्लो साइटोमेट्री कोर टीम को भी धन्यवाद देते हैं। Rorc (πt) - GfpTG C57BL / 6 रिपोर्टर चूहों जी Eberl (Institute Pasteur, पेरिस, फ्रांस) से एक उदार उपहार थे। CD45.1 C57BL/6 चूहों को कृपया टी लॉरेंस (किंग्स कॉलेज लंदन, लंदन) और पी. बैरल (किंग्स कॉलेज लंदन, लंदन) द्वारा दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181
जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के साथ मुरीन छोटी आंत उपकला ऑर्गेनोइड्स की सह-संस्कृति
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Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

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