뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양
Summary
이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.
Abstract
오가노이드와 면역 세포의 복잡한 공동 배양은 점막 항상성의 섬세한 균형을 뒷받침하는 양방향 상호 작용을 조사하기위한 다목적 도구를 제공합니다. 이러한 3D 다세포 시스템은 다인자 질환을 해결하고 조직 상주 선천성 림프세포(ILC)와 같은 희귀 세포 유형을 연구할 때 발생하는 기술적 어려움을 해결하기 위한 환원주의 모델을 제공합니다. 이 글에서는 소장 오가노이드와 소장 라미나 프로프리아 유래 헬퍼-유사 타입 1 ILC(ILC1s)를 결합한 뮤린 시스템을 설명하며, 이는 다른 ILC 또는 면역 집단으로 쉽게 확장될 수 있다. ILCs는 점막에서 특히 풍부 한 조직 거주 개체군으로, 항상성을 촉진하고 손상이나 감염에 신속하게 반응합니다. ILCs와의 오가노이드 공동 배양은 이미 장의 새로운 상피 면역 신호 전달 모듈에 대한 빛을 비추기 시작했으며, 다른 ILC 서브 세트가 장 상피 장벽 무결성 및 재생에 어떻게 영향을 미치는지 밝혀 냈습니다. 이 프로토콜은 상피와 면역 세포 사이의 상호 작용에 대한 추가 조사를 가능하게하며, 점막 항상성과 염증의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 보유하고 있습니다.
Introduction
장 상피와 장 상주 면역 체계 사이의 의사 소통은 장 항상성 1의 유지의핵심입니다. 이러한 상호 작용에 대한 중단은 염증성 장 질환 (IBD) 및 위장 암2를 포함한 국소 및 전신 질환 모두와 관련이 있습니다. 항상성의 한 가지 더 최근에 기술된 중요한 조절자의 주목할만한 예는 장 면역 환경에서 핵심 플레이어로 부상한 선천적 림프성 세포 (ILCs)의 연구에서 비롯됩니다3. ILCs는 장 항상성을 조절하고 사이토카인 매개 신호전달을 통해 염증을 크게 조율하는 이질적인 선천적 면역 세포의 그룹이다4.
뮤린 ILCs는 전사 인자, 수용체, 및 사이토카인 발현 프로필5에 기초한 아류형으로 광범위하게 분할된다. 세포독성 내추럴킬러(NK) 세포 및 헬퍼-유사 타입 1 ILCs(ILC1s)를 포함하는 제1형 ILCs는 T 세포(T-bet)6에서 발현되는 전사인자(eomesodermin) 에옴 및 T-박스 단백질의 발현에 의해 각각 정의되며, T 헬퍼 타입-1(TH1)면역과 관련된 사이토카인을 분비한다: 인터페론-γ(IFNγ) 및 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-12에 반응하여, IL-15 및 IL-187. 항상성 동안, 조직-상주 ILC1s는 상피 증식 및 매트릭스 리모델링을 유도하기 위해 변형 성장 인자 β(TGF-β)을 분비한다8. 제2형 ILCs(ILC2s)는 주로 T 헬퍼 타입-2(TH2) 관련 사이토카인의 분비를 통해 기생충 감염에 반응한다: IL-4, IL-5, 및 IL-13, 및 레티노산 관련 고아 수용체(ROR) α(ROR-α)9 및 GATA 결합 단백질 3(GATA-3)10,11,12의 발현을 특징으로 한다. . 마우스에서, 장내 “염증성” ILC2s는 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 (서브패밀리 G 멤버 1, KLRG)13의 발현을 추가로 특징으로 하며, 여기서 이들은 상피 터프트-세포 유래 IL-2514,15에 반응한다. 마지막으로, 림프성 조직 유도제 세포 및 헬퍼-유사 타입-3 ILCs(ILC3s)를 포함하는 타입-3 ILCs는 전사 인자 ROR-γt 16에 의존하고, 국소 IL-1β 및 IL-23신호(17)에 반응하여 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF),IL-17, 또는 IL-22를 분비하는 그룹으로 군집된다. 림프성 조직 유도제 세포는 Peyer의 패치에 군집하고 발달18 동안 이러한 이차 림프성 기관의 발달에 결정적이며, ILC3s는 성인 뮤린 소장 라미나 프로프리아에서 가장 풍부한 ILC 아형이다. ILC3s를 갖는 최초의 뮤린 장내 오가노이드 공동배양 시스템 중 하나는 신호 트랜스듀서 및 전사 3의 활성화제에 대한 사이토카인 IL-22의 영향을 분리하기 위해 이용되었고, 전사 3(STAT-3) 매개된 류신-풍부 반복 G 단백질 결합 수용체 5(Lgr5)+ 장 줄기 세포 증식(19)을 포함하는, 재생 ILC-상피 상호작용의 강력한 예이다. ILCs는 기관(20,21) 사이에 각인-이질성을 나타내고, 편광 사이토카인(22)에 반응하여 서브세트 사이에 가소성을 나타낸다. 이러한 조직 특유의 각인과 가소성 차이를 일으키는 요인과 IBD23과 같은 만성 질환에서 그들이 어떤 역할을하는지는 오가노이드 공동 문화를 사용하여 해결할 수있는 흥미로운 주제로 남아 있습니다.
장 오가노이드는 장 상피24,25를 연구하는 성공적이고 신뢰할 수있는 모델로 부상했습니다. 이들은 Wnt 패밀리 멤버 3A (Wnt3a)의 내인성 공급원으로서 파네스 세포를 포함하는 장 상피 Lgr5+ 줄기 세포 또는 전체 단리된 크립트를 배양함으로써 생성된다. 이러한 3D 구조는 합성 하이드로젤(26) 또는 기저 라미나 프로프리아를 모방한 생체재료, 예를 들어 열-가교 기저 세포외 매트릭스(TBEM)에서 유지되며, 특히 상피 성장 인자(EGF), 골 형태유전 단백질(BMP)-억제제 노긴, Lgr5-리간드 및 Wnt-아고니스트 R-Spondin127을 모방하는 성장 인자로 추가로 보충된다. . 이러한 조건 하에서, 오가노이드는 상피 아피코-기저 극성을 유지하고, 오가노이드의 중심에서 흡수성 및 분비 세포로 말단으로 분화되는 신진 줄기 세포 크립트로 장 상피의 크립트-빌리 구조를 재편성하고, 그 후 anoikis28에 의해 내부 슈도루멘으로 흘려진다. 비록 장내 오가노이드 단독으로는 상피 발달과 역동성의 환원주의 모델로서 매우 유리했지만,29,30은 이러한 행동이 면역 구획에 의해 어떻게 조절, 영향 또는 심지어 파괴되는지를 이해하는 데 엄청난 미래의 잠재력을 가지고 있습니다.
다음의 프로토콜에서, 뮤린 소장 오가노이드와 라미나 프로프리아 유래 ILC1s 사이의 공동 배양 방법이 기술되어 있는데, 이는 최근에 이 집단이 어떻게 예기치 않게 염증의 장 시그니처를 감소시키고 대신이 시스템에서 TGF-β을 통한 상피 증식 증가에 기여하는지를 확인하기 위해 사용되었다8.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 장 해리 프로토콜 동안 림프구의 손실을 최소화하여 희귀 한 ILC1을 분리하고,이 두 구획 사이에 공동 배양을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 많은 단계가 있으며, 일부는 ILC1에 특이적이지만,이 접근법은 다른 장 면역 세포 유형에 적용될 수 있으며 공동 배양 설정은 개별 연구 질문에 맞게 모듈식으로 조정할 수 있습니다. 몇 가지 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.R.은 Wellcome Trust (215027/Z/18/Z)의 박사 학위를 인정합니다. G.M.J.는 Wellcome Trust (203757/Z/16/A)의 박사 학위 펠로우십을 인정합니다. DC는 NIHR GSTT BRC 출신의 박사 과정 학생임을 인정합니다. J.F.N.은 Marie Skłodowska-Curie Fellowship, King ‘s Prize 펠로우십, RCUK / UKRI Rutherford Fund 펠로우십 (MR / R024812 / 1) 및 Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z)의 과학 종자 상을 인정합니다. 우리는 또한 가이 병원에 본사를 둔 BRC 유세포 측정 핵심 팀에 감사드립니다. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 리포터 마우스는 G. Eberl(프랑스 파리의 파스퇴르 연구소)으로부터 관대 한 선물이었다. CD45.1 C57BL/6 마우스는 T. Lawrence (King ‘s College London, London)와 P. Barral (King ‘s College London, London)에 의해 친절하게 주어졌다.
Materials
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | – | – | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | – | – |
References
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