Summary

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Abstract

Les co-cultures complexes d’organoïdes avec des cellules immunitaires fournissent un outil polyvalent pour interroger les interactions bidirectionnelles qui sous-tendent l’équilibre délicat de l’homéostasie muqueuse. Ces systèmes multicellulaires 3D offrent un modèle réductionniste pour traiter les maladies multifactorielles et résoudre les difficultés techniques qui surviennent lors de l’étude de types de cellules rares telles que les cellules lymphoïdes innées (ILC) résidant dans les tissus. Cet article décrit un système murin qui combine des organoïdes de l’intestin grêle et des ILC de type 1 dérivés de la lamina propria de l’intestin grêle, qui peuvent être facilement étendus à d’autres ILC ou populations immunitaires. Les ILC sont une population résidant dans les tissus qui s’enrichit particulièrement dans la muqueuse, où ils favorisent l’homéostasie et réagissent rapidement aux dommages ou aux infections. Les co-cultures organoïdes avec des ILC ont déjà commencé à mettre en lumière de nouveaux modules de signalisation épithéliale-immunitaire dans l’intestin, révélant comment différents sous-ensembles d’ILC affectent l’intégrité et la régénération de la barrière épithéliale intestinale. Ce protocole permettra d’approfondir les recherches sur les interactions réciproques entre les cellules épithéliales et immunitaires, qui ont le potentiel de fournir de nouvelles informations sur les mécanismes de l’homéostasie muqueuse et de l’inflammation.

Introduction

La communication entre l’épithélium intestinal et le système immunitaire résident de l’intestin est essentielle au maintien de l’homéostasie intestinale1. Les perturbations de ces interactions sont associées à des maladies locales et systémiques, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et les cancers gastro-intestinaux2. Un exemple notable d’un régulateur critique de l’homéostasie décrit plus récemment provient de l’étude des cellules lymphoïdes innées (ILC), qui sont devenues des acteurs clés du paysage immunitaire intestinal3. Les ILC sont un groupe de cellules immunitaires innées hétérogènes qui régulent l’homéostasie intestinale et orchestrent l’inflammation en grande partie par la signalisation médiée par les cytokines4.

Les ILC murins sont largement divisés en sous-types en fonction des profils d’expression du facteur de transcription, des récepteurs et des cytokines5. Les ILC de type 1, qui comprennent les cellules cytotoxiques Natural Killer (NK) et les ILC de type auxiliaire de type 1 (ILC1s), sont définis par l’expression du facteur de transcription (eomesodermine) Eomes et de la protéine T-box exprimées dans les lymphocytes T (T-bet)6, respectivement, et sécrètent des cytokines associées à l’immunité T helper de type 1 (TH1) : interféron-γ (IFNγ) et facteur de nécrose tumorale (TNF), en réponse à l’interleukine (IL)-12, IL-15 et IL-187. Au cours de l’homéostasie, les ILC1 résidant dans les tissus sécrètent des β transformant le facteur de croissance (TGF-β) pour stimuler la prolifération épithéliale et le remodelage de la matrice8. Les ILC de type 2 (ILC2) répondent principalement à l’infection par les helminthes par la sécrétion de cytokines associées au T helper de type 2 (TH2) : IL-4, IL-5 et IL-13, et sont caractérisées par l’expression du récepteur orphelin (ROR) lié à l’acide rétinoïque α (ROR-α)9 et de la protéine de liaison GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Chez la souris, les ILC2 « inflammatoires » intestinaux sont en outre caractérisés par l’expression du récepteur de type lectine des cellules tueuses (sous-famille G membre 1, KLRG)13 où ils répondent à l’IL-2514,15 dérivée des cellules épithéliales de la touffe. Enfin, les ILC de type 3, qui comprennent les cellules inductrices du tissu lymphoïde et les ILC de type 3 auxiliaires (ILC3), dépendent du facteur de transcription ROR-γt16 et se regroupent en groupes qui sécrètent soit un facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF), IL-17 ou IL-22 en réponse aux signaux locaux IL-1β et IL-2317. Les cellules inductrices du tissu lymphoïde se regroupent dans les patchs de Peyer et sont cruciales pour le développement de ces organes lymphoïdes secondaires au cours du développement18, tandis que les ILC3 sont le sous-type d’ILC le plus abondant dans la lamina propria de l’intestin grêle murin adulte. L’un des premiers systèmes de co-culture organoïde intestinale murine avec des ILC3 a été exploité pour distinguer l’impact de la cytokine IL-22 sur le transducteur de signal et l’activateur de transcription 3 (STAT-3) médié par la répétition riche en leucine contenant le récepteur couplé à la protéine G 5 (Lgr5) + prolifération des cellules souchesintestinales 19, un exemple puissant d’une interaction ILC-épithéliale régénérative. Les ILC présentent une hétérogénéité d’empreinte entre les organes20,21 et présentent une plasticité entre les sous-ensembles en réponse à des cytokines polarisantes22. Ce qui motive ces empreintes tissulaires et ces différences de plasticité, et quel rôle elles jouent dans les maladies chroniques telles que laMII 23, restent des sujets passionnants qui pourraient être abordés à l’aide de co-cultures organoïdes.

Les organoïdes intestinaux sont apparus comme un modèle réussi et fiable pour étudier l’épithélium intestinal24,25. Ceux-ci sont générés par la culture de cellules souches Lgr5+ épithéliales intestinales, ou de cryptes isolées entières, qui incluent des cellules Paneth comme source endogène de Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Ces structures 3D sont maintenues soit dans des hydrogels synthétiques26, soit dans des biomatériaux qui imitent la lamina propria basale, par exemple, la matrice extracellulaire basale à réticulation thermique (TBEM), et sont complétées par des facteurs de croissance qui imitent la niche environnante, notamment le facteur de croissance épithélial (EGF), l’inhibiteur de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) Noggin, et un ligand Lgr5 et un agoniste Wnt R-Spondin127 . Dans ces conditions, les organoïdes maintiennent la polarité apico-basale épithéliale et récapitulent la structure crypte-villosité de l’épithélium intestinal avec des cryptes de cellules souches bourgeonnantes qui se différencient en phase terminale en cellules absorbantes et sécrétoires au centre de l’organoïde, qui se déversent ensuite dans le pseudollumen interne par anoikis28. Bien que les organoïdes intestinaux seuls aient été extrêmement avantageux en tant que modèles réductionnistes du développement épithélial et de la dynamique isolément29,30, ils recèlent un énorme potentiel futur pour comprendre comment ces comportements sont régulés, influencés ou même perturbés par le compartiment immunitaire.

Dans le protocole suivant, une méthode de co-culture entre des organoïdes murins de l’intestin grêle et des ILC1 dérivés de la lamina propria est décrite, qui a récemment été utilisée pour identifier comment cette population diminue de manière inattendue les signatures intestinales de l’inflammation et contribue plutôt à une prolifération épithéliale accrue via le TGF-β dans ce système8.

Protocol

Toutes les expériences doivent être réalisées conformément à toutes les lignes directrices réglementaires et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation des animaux. L’approbation éthique de l’étude décrite dans l’article et la vidéo suivants a été obtenue conformément à toutes les directives réglementaires et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation des animaux. Toutes les souris ont été abattues par luxation cervicale selon la procédure éthique stan…

Representative Results

Une fois terminées avec succès, les cryptes fraîchement isolées devraient former des structures de crypte naissantes dans les 2 à 4 jours (Figure 1A). Les cultures organoïdes saines et robustes doivent être en croissance active et peuvent être passées et étendues comme détaillé dans le protocole. Ce protocole décrit l’isolement de l’ILC1 de l’intestin grêle de la lignée transgénique transgénique murine RORγtGFP , ce qui permet l?…

Discussion

Ce protocole décrit les méthodes permettant d’établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, d’isoler des ILC1 rares en minimisant la perte de lymphocytes pendant le protocole de dissociation intestinale et d’établir des co-cultures entre ces deux compartiments. Ce protocole comporte de nombreuses étapes, et bien que certaines soient spécifiques aux ILC1, cette approche peut être appliquée à d’autres types de cellules immunitaires intestinales, et les configurations de co-culture peuvent être ad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

E.R. reconnaît une bourse de doctorat du Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. reconnaît une bourse de doctorat du Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. reconnaît une bourse de doctorat du NIHR GSTT BRC. J.F.N. reconnaît une bourse Marie Skłodowska-Curie, une bourse du Prix du Roi, une bourse rcuk/UKRI Rutherford Fund (MR/R024812/1) et un Seed Award in Science du Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Nous remercions également l’équipe de base de cytométrie en flux BRC basée à l’hôpital Guy. Les souris reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 ont été un don généreux de G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, France). Les souris CD45.1 C57BL/6 ont été aimablement administrées par T. Lawrence (King’s College London, Londres) et P. Barral (King’s College London, Londres).

Materials

Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O’Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Play Video

Cite This Article
Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

View Video