Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Abstract

Complexe co-culturen van organoïden met immuuncellen bieden een veelzijdig hulpmiddel voor het onderzoeken van de bidirectionele interacties die de delicate balans van mucosale homeostase ondersteunen. Deze 3D, multicellulaire systemen bieden een reductionistisch model voor het aanpakken van multifactoriële ziekten en het oplossen van technische problemen die zich voordoen bij het bestuderen van zeldzame celtypen zoals weefselbewonende aangeboren lymfoïde cellen (LIC's). Dit artikel beschrijft een muizensysteem dat dunne darmorganoïden en dunne darm lamina propria afgeleide helper-achtige type-1 ILCs (ILC1's) combineert, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar andere ILC- of immuunpopulaties. ILCs zijn een weefsel-residente populatie die bijzonder verrijkt is in het slijmvlies, waar ze homeostase bevorderen en snel reageren op schade of infectie. Organoïde coculturen met ILCs zijn al begonnen met het werpen van licht op nieuwe epitheliaal-immuun signaleringsmodules in de darm, wat onthult hoe verschillende ILC-subsets de integriteit en regeneratie van intestinale epitheliale barrières beïnvloeden. Dit protocol zal verder onderzoek mogelijk maken naar wederzijdse interacties tussen epitheel- en immuuncellen, die het potentieel hebben om nieuwe inzichten te verschaffen in de mechanismen van mucosale homeostase en ontsteking.

Introduction

Communicatie tussen het darmepitheel en het darm-residente immuunsysteem staat centraal in het onderhoud van intestinale homeostase1. Verstoringen van deze interacties worden geassocieerd met zowel lokale als systemische ziekten, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD) en gastro-intestinale kankers2. Een opmerkelijk voorbeeld van een meer recent beschreven kritische regulator van homeostase komt uit de studie van aangeboren lymfoïde cellen (LIC's), die naar voren zijn gekomen als belangrijke spelers in het intestinale immuunlandschap3. ILCs zijn een groep heterogene aangeboren immuuncellen die intestinale homeostase reguleren en ontstekingen grotendeels orkestreren via cytokine-gemedieerde signalering4.

Murine ILCs zijn grofweg onderverdeeld in subtypen op basis van transcriptiefactor, receptor en cytokine expressieprofielen5. Type-1 ILCs, waaronder cytotoxische Natural Killer (NK) cellen en helper-achtige type-1 ILCs (ILC1s), worden gedefinieerd door expressie van de transcriptiefactor (eomesodermin) Eomen en T-box eiwit uitgedrukt in T-cellen (T-bet)6, respectievelijk, en scheiden cytokines geassocieerd met T helper type-1 (TH1) immuniteit: interferon-γ (IFNγ) en tumor necrose factor (TNF), in reactie op interleukine (IL)-12, IL-15 en IL-187. Tijdens homeostase scheiden weefselbewonende ILC1's Transforming Growth Factor β (TGF-β) uit om epitheliale proliferatie en matrixremodellering8 te stimuleren. Type-2 ILCs (ILC2's) reageren voornamelijk op worminfectie via secretie van T-helper type-2 (TH2) geassocieerde cytokines: IL-4, IL-5 en IL-13, en worden gekenmerkt door de expressie van retinoïnezuur-gerelateerde weesreceptor (ROR) α (ROR-α)9 en GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Bij muizen worden intestinale "inflammatoire" ILC2's verder gekenmerkt door expressie van Killer cell lectine-achtige receptor (subfamilie G-lid 1, KLRG)13 waar ze reageren op epitheliale plukcel afgeleide IL-2514,15. Ten slotte zijn type-3 ILCs, waaronder lymfoïde weefselinductorcellen en helperachtige type-3 ILCs (ILC3s), afhankelijk van de transcriptiefactor ROR-γt16 en clusteren ze zich in groepen die Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 of IL-22 afscheiden als reactie op lokale IL-1β- en IL-23-signalen17. Lymfoïde weefselinductorcellen clusteren in Peyer's patches en zijn cruciaal voor de ontwikkeling van deze secundaire lymfoïde organen tijdens de ontwikkeling18, terwijl ILC3's het meest voorkomende ILC-subtype zijn in de volwassen muriene dunne darm lamina propria. Een van de vroegste muriene intestinale organoïde co-kweeksystemen met ILC3's werd gebruikt om de impact van het cytokine IL-22 op signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT-3) gemedieerde Leucine-Rich Repeat Containing G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + intestinale stamcelproliferatie19 uit elkaar te halen, een krachtig voorbeeld van een regeneratieve ILC-epitheliale interactie. ILCs vertonen imprint-heterogeniteit tussen organen20,21 en vertonen plasticiteit tussen subsets als reactie op polariserende cytokines22. Wat deze weefselspecifieke indrukken en plasticiteitsverschillen drijft, en welke rol ze spelen bij chronische ziekten zoals IBD23, blijven spannende onderwerpen die kunnen worden aangepakt met behulp van organoïde co-culturen.

Intestinale organoïden zijn naar voren gekomen als een succesvol en betrouwbaar model om het darmepitheelte bestuderen 24,25. Deze worden gegenereerd door het kweken van intestinale epitheliale Lgr5 + stamcellen, of hele geïsoleerde crypten, waaronder Paneth-cellen als een endogene bron van Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Deze 3D-structuren worden onderhouden in synthetische hydrogels26 of in biomaterialen die de basale lamina propria nabootsen, bijvoorbeeld Thermal-crosslinking Basal Extracellular Matrix (TBEM), en worden verder aangevuld met groeifactoren die de omliggende niche nabootsen, met name Epithelial Growth Factor (EGF), de Bone Morphogenetic Protein (BMP)-inhibitor Noggin en een Lgr5-ligand en Wnt-agonist R-Spondin127 . Onder deze omstandigheden handhaven organoïden epitheliale apico-basale polariteit en recapituleren ze de crypt-villi-structuur van het darmepitheel met ontluikende stamcelcrypten die terminaal differentiëren in absorberende en secretoire cellen in het midden van de organoïde, die vervolgens door anoikis 28 in het interne pseudolumenworden afgeworpen. Hoewel intestinale organoïden alleen al enorm voordelig zijn geweest als reductionistische modellen van epitheliale ontwikkeling en dynamiek in isolatie29,30, hebben ze een enorm toekomstig potentieel om te begrijpen hoe dit gedrag wordt gereguleerd, beïnvloed of zelfs verstoord door het immuuncompartiment.

In het volgende protocol wordt een methode van co-kweek tussen muriene dunne darm organoïden en lamina propria afgeleide ILC1's beschreven, die onlangs werd gebruikt om te identificeren hoe deze populatie onverwacht intestinale signaturen van ontsteking vermindert en in plaats daarvan bijdraagt aan verhoogde epitheliale proliferatie via TGF-β in dit systeem8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten moeten worden voltooid in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen voor het gebruik van dieren. Ethische goedkeuring voor de studie beschreven in het volgende artikel en video werd verkregen in overeenstemming met en in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen voor diergebruik.

Alle muizen werden geruimd door cervicale dislocatie volgens de standaard ethische procedure, uitgevoerd door getrainde individuen. Vóór het oogsten van organen en weefsels werd het snijden van de dijbeenslagader of onthoofding uitgevoerd (afhankelijk van het protocol in de hand) als bevestigende beoordelingen van de dood. Dieren werden gehuisvest onder specifiek-pathogeenvrije omstandigheden (tenzij anders vermeld) bij een geaccrediteerde commerciële eenheid en King's College London animal unit in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 tot september 2018; P9720273E vanaf september 2018).

1. Het vaststellen van muizenche dunne darm organoïden

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol beschrijft de generatie van intestinale organoïden uit de dunne darm van het muizen. Crypten worden eerst geïsoleerd uit weefsel, geresuspendeerd in TBEM en vervolgens geïncubeerd met media die EGF, Noggin en R-Spondin (ENR) bevatten. Het vaststellen van muizenorganoïden in de dunne darm is ook elders goed beschreven 24,25,27.

  1. Plaats TBEM op ijs om te ontdooien (40 μL/put) en plaats een standaard weefselkweek behandeld (verwijst naar platen met een hydrofiel en negatief geladen oppervlak) 24-well plaat in een incubator van 37 °C om voor te verwarmen.
    OPMERKING: 500 μL TBEM zal ontdooien in ongeveer 2-4 uur; laat het niet op kamertemperatuur staan.
  2. Bereid ~4 ml of 550 ml per putje ENR-medium door EGF, Noggin en R-Spondin toe te voegen aan basaal medium (tabel 1) en plaats in een incubator van 37 °C.
  3. Ruim een dier van 6-12 weken oud en ontleed de dunne darm met een tang en een microdissectieschaar. Plaats het in 15 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
  4. Gebruik de maag en het caecum als oriëntatiepunten en isoleer het gewenste gebied van de dunne darm (twaalfvingerige darm, jejunum of ileum). In dit protocol wordt het ileum geïsoleerd.
  5. Dompel de darm onder in PBS op een petrischaaltje van 10 cm2 op ijs. Gebruik een tang om vet voorzichtig, maar volledig, uit de darm te verwijderen.
  6. Knip het weefsel in de lengterichting met een microdissectieschaar (bij voorkeur met afgeronde uiteinden om perforatie te voorkomen). Houd de darm ondergedompeld in PBS, schud om fecale materie te verwijderen en houd de slijmzijde omhoog om de weefseloriëntatie te volgen.
  7. Breng weefsel over naar het droge deksel van een petrischaaltje op ijs en plaats het darmslijm / villus-zijde naar boven. Houd het ene uiteinde van de darm vast met een tang en schraap voorzichtig slijm weg met behulp van de schuine rand van een schone glasplaat.
  8. Vul de plaat met ijskoude PBS en spoel het weefsel af.
  9. Bekleed een buis van 50 ml vooraf met PBS2 (PBS + 2% FCS; zie tabel 1) om hechting van het weefsel aan het plastic te voorkomen en voeg 10 ml ijskoude PBS toe aan deze buis. Snijd de darm in kleine (~ 2 mm) segmenten en breng ze over in de buis van 50 ml die is voorgecoat met PBS2.
  10. Pipetteer met behulp van een pipet van 25 ml, voorgecoat met PBS2, de segmenten 5-10 keer op en neer om de weefselfragmenten te reinigen.
  11. Laat de segmenten 15-30 s bezinken, verwijder en gooi het PBS-supernatant weg en herhaal stap 1.10 en 1.11 totdat de oplossing helder is (ongeveer 3-4 keer).
  12. Laat de segmenten bezinken en gooi het PBS-supernatant weg. Voeg 30 ml ijskoude crypte-isolatiebuffer toe (tabel 1).
  13. Plaats de buizen op een horizontale roller of rocker bij 30-60 tpm (of zacht) gedurende 30 minuten bij 4 °C. Incubeer niet met hogere snelheden, hogere temperaturen of langere duur, omdat de crypten voortijdig losraken en afzonderlijke cellen worden met een lagere levensvatbaarheid en opbrengst.
    OPMERKING: Vanaf deze fase moeten alle procedures worden uitgevoerd in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia.
  14. Laat darmsegmenten bezinken aan de basis van de buis van 50 ml. Verwijder de cryptisolatiebuffer zonder de bezonken segmenten te verstoren en breng deze over in een buis van 50 ml op ijs.
    OPMERKING: Als het isolatieproces van de crypte te rigoureus was, kunnen crypten in deze fractie worden gezien. Het kan dus als reserve worden aangehouden, maar zal aan het einde van het protocol optimaal worden weggegooid.
  15. Voeg 20 ml ijskoude PBS toe aan darmsegmenten. Pipetteer met behulp van een pipet van 25 ml, voorgecoat met PBS2, darmsegmenten 5-8 keer op en neer.
  16. Laat de segmenten genoegen nemen met 30 s. Voorcoat een buis van 50 ml en een pipet van 25 ml met PBS2. Verzamel met deze pipet het supernatant (fractie 1) in de voorgecoate buis van 50 ml en plaats de buis op ijs.
    OPMERKING: Deze fractie dient om de resterende cryptisolatiebuffer weg te spoelen. Het dient echter ook als een extra stap voor kwaliteitscontrole; als pipetteren te krachtig was, zullen crypten overvloedig aanwezig zijn in deze spoelfractie, en als het te zacht was, zal er heel weinig vuil in deze fractie zijn. Optimaal wordt fractie 1 aan het einde van het protocol weggegooid, maar het kan worden gebruikt om organoïden te maken als er problemen optreden met fracties 2-4 die hieronder worden verkregen.
  17. Herhaal stap 1.15 en 1.16, maar voeg 10 ml ijskoude PBS toe in plaats van 20 ml en plaats het supernatant in een verse buis van 50 ml die is voorgecoat met PBS2 (fractie 2).
  18. Herhaal stap 1.17 nog twee keer, maar bundel het resulterende supernatant met breuk 2 (in dezelfde buis van 50 ml uit stap 1.17) om fracties 2-4 te verkrijgen. Deze enkele buis van 50 ml moet de losgeraakte crypten bevatten in 30 ml ijskoude PBS.
  19. Verwijder een aliquot van 50 μL uit de samengevoegde 2-4 fracties en plaats deze op een deklip. Beoordeel op de aanwezigheid van epitheliale crypten met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop.
    OPMERKING: Als er geen crypten aanwezig zijn, herhaalt u stap 1.17 en 1.18 met meer kracht tijdens het pipetteren totdat de crypten worden vrijgegeven. Zorg ervoor dat crypten niet voortijdig zijn losgemaakt in de cryptisolatiebuffer van stap 1.14 of in fractie 1 van stap 1.16.
  20. Voorcoat een zeef van 100 μm en een buis van 50 ml met PBS2. Passeer de gepoolde cryptefracties door deze zeef en in de voorgecoate buis van 50 ml.
  21. Draai gespannen cryptracties bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden.
  22. Gooi het supernatant weg en resuspend de crypten in 10 ml ijskoude Advanced DMEM / F12. Verplaats de crypten naar een buis van 15 ml.
  23. Draai crypten bij 210 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om afzonderlijke cellen en lymfocyten te verwijderen.
  24. Resuspend crypten in 1 ml ijskoude Advanced DMEM / F12.
  25. Verwijder een aliquot van 10 μL en plaats deze op een deklip. Tel met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop het aantal crypten om de crypteconcentratie te bepalen.
  26. Bereken het volume dat nodig is voor ~400 en ~1.500 crypten. Voorbedek een p1000-tip met PBS2 en gebruik deze tip om de vereiste volumes (met ~ 400 en ~ 1.500 crypten) in afzonderlijke buizen van 1,5 ml te pipetten.
  27. Draai de crypten gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g .
  28. Verwijder zoveel mogelijk bovennatuurlijk materiaal en suspens de crypten vervolgens opnieuw in 80 μL TBEM die op ijs is geplaatst (pipetpunten vooraf koelen bij 4 °C om matrixgelatatie te voorkomen, die optreedt bij 12 °C).
  29. Verwijder de 24-putplaat, geplaatst in stap 1.1, uit de couveuse. Pipetteer voorzichtig 40 μL crypten in het midden van een put in een langzame, cirkelvormige beweging om een platte maar 3D-koepelstructuur te vormen, of in drie afzonderlijke kleine koepels.
    OPMERKING: De levensvatbaarheid van de organoïden is het laagst in het midden van de koepel waar voedingsstoffen en gassen minder effectief doordringen31; het maximaliseren van het oppervlak dat wordt blootgesteld aan media met behoud van duidelijke 3D-structuren is dus van cruciaal belang.
  30. Herhaal stap 1.29 om in totaal twee putten te maken met een dichtheid van ~ 200 crypten per put en nog twee putten met een dichtheid van ~ 750 crypten per put. Plaats de plaat direct in een incubator (37 °C en 5% CO2) gedurende 15-20 minuten, waarbij u ervoor zorgt dat de viskeuze maar nog steeds vloeibare matrixkoepels niet worden verstoord.
  31. Voeg 550 μL voorverwarmde ENR-media per put toe (vanaf stap 1.2) en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. In dit stadium wordt voorgesteld om het ENR-medium aan te vullen met 5 μM Wnt-agonist (CHIR 99021) en 5 μM Rho Kinase-remmer (Y-27632) voor de eerste 24 uur van de kweek na isolatie om de opbrengst en efficiëntie van organoïdegeneratie van crypten vers geïsoleerd uit weefsel te verbeteren.
    OPMERKING: Crypten moeten binnen 24 uur afgeronde structuren vormen en cryptknoppen moeten binnen 2-4 dagen verschijnen (figuur 1A).
  32. Vervang door vers ENR-medium aan het einde van de incubatie in stap 1.31 en vervolgens om de ~ 2 dagen of wanneer de fenol pH-indicator in het kweekmedium lichtoranje wordt, maar voordat deze geel wordt.

2. Onderhoud van muizenche dunne darm organoïden

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol beschrijft het onderhoud en de passaging van muriene dunne darm organoïden. Organoïden worden eerst geoogst en vervolgens mechanisch verstoord met behulp van een gebogen p1000-punt. Dit proces breekt grote organoïden bestaande uit talrijke crypten in meerdere kleinere fragmenten voor expansie en geeft dode cellen vrij die zich in het pseudolumen hebben opgehoopt. Murine small intestinal organoid maintenance is ook elders goed beschreven 24,25,27. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia. Passage of expand organoïden eenmaal per 4-5 dagen, voordat het barsten van de organoïden optreedt door aanzienlijke ophoping van puin in het organoïde lumen. Organoïden kunnen worden gepasseerd in een verhouding van 1:2-1:3 afhankelijk van de organoïdedichtheid, die optimaal tussen de 100-200 organoïden per put zal liggen.

  1. Net als in stap 1.1 en 1.2 ontdooi je TBEM op ijs (40 μL/put) en bereid je ENR-medium (550 μL per put). Plaats de medium en standaard weefselkweek behandelde 24-well plaat in een incubator van 37 °C.
  2. Verwijder de plaat met organoïden uit de couveuse. Gooi de media weg uit de put die moet worden gepasseerd.
  3. Voeg 500 μL ijskoude Advanced DMEM/F12 toe aan de put. Gebruik een p1000-tip (voorgecoat met media om te voorkomen dat organoïden aan de binnenkant van de punt blijven plakken) en oogst de organoïden in een buis van 15 ml.
  4. Spoel de bodem van de put af met 250-300 μL ijskoude Advanced DMEM/F12 om ervoor te zorgen dat er geen organoïden in de put achterblijven en voeg deze samen in de buis van 15 ml met geoogste organoïden uit stap 2.3. Herhaal stap 2.3 en 2.4 bij het passeren van meerdere putten en bundel de organoïden uit meerdere putten in dezelfde buis van 15 ml.
  5. Draai organoïden bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  6. Zorg er bij het centrifugeren voor dat er vier zichtbare fracties zijn: een basisfractie met gezonde organoïden, een centrale en heldere matrixfractie, een matrixfractie met enkele en dode cellen en een bovenste bovennatuurlijke laag met enkele en dode cellen. Verwijder het supernatant, de puinfractie en zoveel mogelijk van het heldere matrixfragment zonder de pellet van organoïden te verstoren.
  7. Buig voorzichtig de punt van een p1000 pipetpunt (ongeveer 2-5 mm buigen). Voorbedek deze tip in PBS2 of Advanced DMEM/F12. Pipetteer met behulp van deze tip de organoïden 10-20 keer op en neer om de organoïden en de resterende matrix mechanisch te verstoren.
  8. Draai gedurende 3 minuten bij 4 °C neer bij 210 x g.
  9. Verwijder net als in stap 2.6 het supernatant, de puinfractie en zoveel mogelijk van het heldere matrixfragment zonder de pellet van gedissocieerde crypten te verstoren. Als gezonde crypten of kleine organoïden geen heldere pellet hebben gevormd, centrifugeer dan opnieuw bij 300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  10. Bereken het vereiste volume TBEM (80-120 μL per put geoogste organoïden, afhankelijk van of een passageverhouding van 1:2 of 1:3 wordt gebruikt).
  11. Resuspend de pellet in het berekende volume TBEM en breng 40 μL per put aan op de voorverwarmde 24-well plaat om een koepel te vormen. Plaats de plaat direct in de incubator (37 °C; 5% CO2) gedurende 15-20 min.
  12. Voeg 550 μL ENR-medium per put toe en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Controleer culturen op organoïdevorming na 24 uur. Vervang door vers ENR-medium om de 2-3 dagen na passage.

3. Isolatie van in de dunne darm levende lamina propria aangeboren lymfoïde cellen

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol beschrijft de isolatie van ILC1 uit de muriene dunne darm lamina propria van de RORγtGFP reporter muizen. Dit omvat epitheelcelverwijdering, weefselvertering, dichtheidsgradiëntscheiding van lymfocyten en ILC1-isolatie via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS-isolatie volgens de gatingstrategie in figuur 2 vereist de extracellulaire kleuringsmastermix (tabel 4), met de aanvullende kleuringscontroles beschreven in tabel 2 en tabel 3 voor de machine (tabel 2) en gating (tabel 3) ingesteld. De RORγtGFP reporter muizen worden gebruikt om levende, pure ILC1 te isoleren en RORγtGFP+ ILC3 uit te schakelen. Weefselverwerking voor isolatie van lamina propria lymfocyten is ook elders goed beschreven32.

  1. Weefselverwerking
    OPMERKING: Weefsel van individuele biologische dierlijke replicaties wordt gescheiden gehouden in dit protocol. Deze monsters moeten op passende wijze worden geëtiketteerd en waar mogelijk op ijs worden bewaard. Alle reagentia, met uitzondering van spijsverteringsenzymen, moeten op kamertemperatuur worden gebracht om een snelle weefselvertering te garanderen.
    1. Plaats TBEM op ijs om te ontdooien (40 μL/put). Bewaar een standaard weefselkweekbehandelde 24-well plaat in een incubator van 37 °C om voor te verwarmen.
    2. Bereid verse epitheliale verwijderingsbuffer en verteringsbuffer voor (zie tabel 1). Bereid isotone lage viscositeitsdichtheidsgradiënt medium (LVDGM) (90% LVDGM en 10% 10x PBS), 40% isotone LVDGM en 80% isotone LVDGM in neutraliserende buffer (tabel 1).
    3. Ruim een 6-12 weken oud dier, ontleed de dunne darm met een tang en een microdissectieschaar en plaats de darm in 15 ml PBS op ijs.
    4. Dompel de darm onder in PBS op een 10 cm2 petrischaaltje op ijs en gebruik een tang om vet voorzichtig maar volledig uit de darm te verwijderen.
    5. Verwijder Peyer's patches (~ 5-10; lopend in een lijn tegenover de lijn van vetweefsel) met behulp van een microdissectieschaar om lymfoïde weefselinductorcellen en B-cellen uit te putten.
      OPMERKING: Peyer's patches zijn afwezig bij Rag-/- en andere afstammings-uitgeputte dieren. In tegenstelling tot luchtbellen blijven de patches van Peyer op hun plaats als ze worden aangedrukt.
    6. Knip het weefsel in de lengterichting met een microdissectieschaar (bij voorkeur met afgeronde uiteinden om perforatie te voorkomen). Houd de darm ondergedompeld in PBS, schud om fecale materie te verwijderen.
    7. Snijd het weefsel in stukken van 2-4 cm lengte en breng ze over in een buis van 50 ml.
    8. Voeg ongeveer 20-40 ml ijskoude PBS toe en schud krachtig gedurende 5-15 s om slijm en vuil te verwijderen.
    9. Gooi de inhoud van de buis weg op een verse petrischaal en vervang darmfragmenten in dezelfde buis van 50 ml met een tang.
    10. Herhaal stap 3.1.8 en 3.1.9 3-4 keer, of totdat de PBS duidelijk is.
  2. Epitheelverwijdering
    1. Leg darmfragmenten in een verse petrischaal op ijs. Pak met een tang darmsegmenten op en verwijder overtollige vloeistof door op een droog oppervlak te tikken.
    2. Snijd het weefsel in stukjes van ~ 0,75-1 cm en breng ze over in een verse buis van 50 ml. Voeg 5-7 ml epitheliale verwijderingsbuffer toe (tabel 1). Draai de buis en zorg ervoor dat alle darmsegmenten in de buffer worden ondergedompeld.
    3. Incubeer de monsters bij 37 °C met schommelen (100-150 rpm) gedurende 12-15 min. Vortex de buis voor 20-30 s.
    4. Herhaal stap 3.2.1-3.2.3 nogmaals, gooi het troebele supernatant (fractie bevat epitheel- en intra-epitheelcellen) weg en vervang het door een verse epitheliale verwijderingsbuffer.
  3. Vertering van het weefsel
    1. Tip de inhoud op een verse petrischaal. Pak met een tang de darmsegmenten op en tik op een droog oppervlak om overtollige vloeistof weg te gooien. Leg de segmenten in een verse petrischaal op ijs.
    2. Cluster de segmenten in het midden van de petrischaal tot een dichte massa. Gebruik twee scalpels of een scherpe schaar om het weefsel fijn te versnipperen totdat het een stroperige consistentie bereikt die door een p1000-pipetpunt kan gaan.
    3. Plaats met een pincet het gehakte weefsel in een schone buis van 50 ml. Spoel de petrischaal af met 1-2 ml verteringsbuffer (tabel 1) om het resterende weefsel te verzamelen en bundel het in de buis van 50 ml met het versnipperde weefsel.
    4. Voeg 5-7 ml verteringsbuffer toe aan het versnipperde weefsel en zorg ervoor dat al het weefsel op de bodem van de buis wordt verzameld.
    5. Incubeer de monsters bij 37 °C, met middelmatig schommelen (~ 100-150 rpm) gedurende 15 minuten. Vortex de buis voor 20-30 s elke 5 minuten om de spijsvertering te bevorderen.
    6. Terwijl de monsters worden geïncubeerd, plaatst u een celzeef van 40 μm bovenop een verse buis van 50 ml voor elk monster. Bestrijk de filters met 1-2 ml neutraliserende buffer (tabel 1).
    7. Vortex de monsters gedurende 20-30 s nadat de incubatie is voltooid.
    8. Filtreer het gedeeltelijk verteerde weefsel door het gecoate filter van 40 μm in de buis van 50 ml met neutraliserende buffer.
    9. Gebruik een pincet om onverteerd weefsel van het 40 μm-filter te verzamelen en plaats het terug in de buis van 50 ml waarin de spijsvertering werd uitgevoerd, voor de tweede ronde van de spijsvertering. Verwijder filters en spoel ze af met een verteringsbuffer om onverteerde weefsels die zich aan het filter hechten los te maken.
    10. Zodra zoveel mogelijk onverteerd weefsel uit het filter is verwijderd en teruggeplaatst in de buis van 50 ml waarin de spijsvertering werd uitgevoerd, spoelt u het filter met 1-2 ml neutraliserende buffer over de buis van 50 ml met het gefilterde supernatant.
    11. Voeg 20-25 ml neutraliserende buffer toe aan het gefilterde supernatant en plaats het op ijs om de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen te behouden tijdens de tweede ronde van weefselvertering.
    12. Voeg nog eens 5-10 ml spijsverteringsbuffer toe aan het onverteerde weefsel en herhaal stap 3.3.5-3.3.10, waarbij u ervoor zorgt dat het verteerde weefsel in dezelfde buis wordt gefilterd als in stap 3.3.8 (hetzelfde filter kan ook opnieuw worden gebruikt). Spoel het filter met een neutraliserende buffer totdat de lijn van 50 ml is bereikt en gooi vervolgens het resterende onverteerde weefsel weg.
  4. Lymfocytenisolatie door dichtheidsgradiënt
    1. Draai de verzamelde supernatanten voor elke biologische replicatie op 500 x g gedurende 10 minuten.
    2. Voeg tijdens stap 3.4.1 5 ml 80% isotone LVDGM toe aan een buis van 15 ml voor elke biologische replicatie.
    3. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg uit het gefilterde, verteerde weefsel. Resuspend de pellet in 10 ml van 40% isotone LVDGM, zodat de pellet goed gehomogeniseerd is en er geen grote brokken overblijven.
    4. Stel de pipethulp in op de langzaamste stand, kantel de buis van 15 ml met 80% isotone LVDGM en leg de 10 ml celsuspensie heel voorzichtig over in 40% isotone LVDGM, zodat de celsuspensie zich niet mengt met de 80% fractie.
      OPMERKING: Als de fracties ooit per ongeluk mengen, verdeel dan snel lymfocyten die de 80% fractie bereikten tussen twee 50 ml buizen gevuld met PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 x g. Gooi vervolgens het supernatant weg en herhaal stap 3.4.3-3.4.4.
    5. Draai de buizen op 900 x g en 20 °C, waarbij de versnelling en vertraging op de laagste stand zijn ingesteld om ervoor te zorgen dat de fracties niet worden verstoord. Centrifugeer gedurende 20 minuten (exclusief pauzetijd).
      OPMERKING: Alle procedures vanaf deze stap moeten worden uitgevoerd in een aseptische weefselkweekkap met behulp van steriele materialen en reagentia.
    6. Voordek een buis van 50 ml voor elk monster met PBS2 en voeg 45 ml ijskoude PBS toe.
    7. Verwijder na het centrifugeren voorzichtig de bovenste vuillaag uit de buis van 15 ml. Bestrijk een p1000-tip met PBS2 en gebruik deze om de met lymfocyten beladen interfase tussen de 40% -80% gradiënten in de buis van 50 ml met 45 ml ijskoude PBS te verzamelen.
    8. Draai de buizen gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 4 °C.
    9. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in 500 μL FACS-buffer (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA en 10 mM HEPES; zie tabel 1). Voorbedek een filter van 40 μm met FACS-buffer en gebruik deze om de celsuspensie in een stroombuis te filteren. Spoel de buis van 50 ml af met een extra 500 μL FACS-buffer en filter in dezelfde stroombuis.
    10. Verwijder een aliquot van 10 μL uit de resulterende 1 ml celsuspensie. Tel de lymfocytenopbrengst met behulp van een celteller of hemocytometer en bereken de celconcentratie voor elk monster.
  5. Monstervoorbereiding voor sortering - extracellulaire kleuring
    OPMERKING: De antilichamen die worden gebruikt in de extracellulaire kleuringsmastermix, evenals de reagentia om de fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof en Fc-blokoplossing te bereiden, worden gebruikt in concentraties die voldoende zijn voor maximaal 5 x 106 cellen per 100 μL. Volumes moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Voor FACS-machinecompensatie om ILC1 te sorteren, zijn eenkleurige controles voor elk van de fluoroforen in de extracellulaire kleuringsmastermix vereist. Voor de antilichamen kunnen compensatieparels worden gebruikt die een positieve antilichaambindende kralenpopulatie en een negatieve antilichaamvrije kralenpopulatie bevatten. Voor de ultraviolette (UV) fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof single color controle, compensatie kralen die amine-reactieve (voor positief signaal) en niet-reactieve (voor negatief signaal) populaties bevatten kunnen worden gebruikt. Het wordt niet aanbevolen om cellen van de RORγtGFPreporter muizen voor de UV-fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof single color controle, omdat deze cellen een GFP zullen bevatten+ signaal.
    1. Verwijder een klein aliquot van ~10 μL uit elk monster en bundel het in een aparte stroombuis met 250 μL FACS-buffer. Plaats de tube op ijs. Dit zal worden gebruikt voor de ongevlekte controle.
    2. Voeg 1 ml PBS toe aan het resterende volume in de monsterbuizen. Centrifugeer bij 300-400 x g gedurende 3-5 min.
    3. Bereid 200 μL UV-fixeerbare levensvatbaarheidskleurstofoplossing per monster. Verdun UV-fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof (geresuspendeerd in DMSO volgens de instructies van de fabrikant) 1:500 in PBS (of volgens de instructies van de fabrikant).
    4. Gooi het supernatant weg en resuspend de monsters in 200 μL UV-fixeerbare levensvatbaarheidskleurstofoplossing. Vortex de buizen en incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 10-15 min.
    5. Voeg 2 ml FACS-buffer toe aan de buizen om de UV-fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof te doven, vortex gedurende 10 s en centrifugeer de buizen bij 300-400 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant uit de gecentrifugeerde buizen.
    6. Bereid 200 μL Fc-blokoplossing per monster (0,25 mg/ml Fc-blok in de FACS-buffer).
    7. Voeg 200 μL Fc-blokoplossing toe aan elk van de monsters uit stap 3.5.5, vortex gedurende 10 s, en incubeer in het donker bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    8. Voeg 500 μL FACS-buffer toe aan een verse stroombuis. Verwijder een aliquot van 2-5 μL uit elk monster en bundel het in de buis voor de fluorescentie minus één (FMO) controles.
    9. Vortex de FMO-buis gedurende 10 s en verdeel gelijkmatig (100 μL per buis) in verse stroombuizen die zijn gelabeld voor elk van de FMO-regelaars (Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO en NK1.1 FMO; zie tabel 3). Voeg alle antilichamen, behalve het antilichaam van belang, toe aan elke buis (zoals beschreven in tabel 3) en vortex gedurende 10 s. Leg de FMO-bedieningselementen opzij in het donker bij 4 °C.
    10. Centrifugeer de monsters (geen FMO-controles) bij 300-400 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C.
    11. Bereid extracellulaire kleuringsmastermix (200 μL per monster) met de uiteindelijke antilichaamverdunningen zoals beschreven in tabel 4. Pas het kleuringsvolume aan voor de juiste celconcentratie (tot 5 x 106 cellen per 100 μL), afhankelijk van het celgetal uit stap 3.4.10.
    12. Voeg extracellulaire kleuringsmastermix toe aan de monsters, vortex gedurende 10 s, en leg ze opzij in het donker bij 4 °C.
    13. Bereid een nieuwe controle over één kleur voor elk antilichaam voor dat bedoeld is om te worden gebruikt in de gating-strategie (figuur 2). Vortex antilichaamcompensatieparels gedurende 20 s, voeg 1 druppel kralen toe aan een stroombuis, kleur met 0,5 μL antilichaam (zoals weergegeven in tabel 2, of volgens de instructies van de fabrikant) en vortex gedurende 10 s.
    14. Bereid een UV-fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof een kleurcontrole voor met behulp van een amine-reactieve compensatiekraalkit. Vortex amine-reactieve compensatieparels gedurende 20 s, voeg 1 μL Live/Dead UV-kleurstof toe (zoals weergegeven in tabel 2, of volgens de instructies van de fabrikant) en vortex gedurende 10 s.
    15. Incubeer de monsters, FMO's en enkele kleurregelaars in het donker gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    16. Bereid gedurende deze tijd buizen voor om de gesorteerde cellen te verzamelen. Voeg 400-500 μL van 10% FBS in Advanced DMEM/F12 toe aan 1,5 ml buizen voor elk monster.
    17. Voeg na de incubatie 2 ml PBS2 toe aan elk van de monsters, FMO-besturingselementen en besturingselementen met één kleur.
    18. Centrifugeer de monsters, FMO-controles en eenkleurregelaars bij 300-400 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C.
    19. Gooi het supernatant uit alle gecentrifugeerde buizen. Resuspend de monsters en FMO-controles in 250 μL FACS-buffer en vortex gedurende 10 s.
    20. Resuspend de enkele kleur controles in 250 μL PBS2. Voeg 1 druppel amine niet-reactieve kralen toe aan UV-fixeerbare levensvatbaarheid kleurstof alleen een kleur controle. Vortex alle controles voor 10 s.
    21. De cellen zijn nu klaar om gesorteerd te worden. Bewaar monsters, FMO-controles en enkele kleurregelaars op ijs waar mogelijk in het donker om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren en signaalverlies door fotobleaching te voorkomen.

4. Co-kweek van dunne darm organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

OPMERKING: In deze rubriek wordt de co-kweek beschreven van gesorteerde muizen dunne darm ILC1 (geïsoleerd volgens het protocol in rubriek 3) met muizenche dunne darm organoïden (beschreven in rubrieken 1 en 2). Organoïden moeten 1-2 dagen na passage optimaal worden gebruikt. Co-cultuur omvat het oogsten van de organoïden, het toevoegen van het juiste aantal ILC1, het centrifugeren van pelletorganoïden en ILC1 samen en het resuspenderen in TBEM. Voltooi deze sectie zo snel mogelijk zodra ILC1 is geïsoleerd. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een aseptische omgeving met behulp van steriele materialen en reagentia.

  1. Zorg ervoor dat TBEM vanaf stap 3.1.1 is ontdooid.
  2. Oogst organoïden van 1-2 dagen oud zoals beschreven in stap 2.3 en 2.4.
  3. Resuspend de organoïde pellet in 1 ml koude ijskoude Advanced DMEM/F12. Buig de p1000-punt niet zoals gedaan bij het passeren van de organoïden, omdat het hier de bedoeling is om de organoïdestructuur voor co-cultuur te behouden. Plaats de organoïden indien nodig in afzonderlijke PBS2-gecoate buizen van 1,5 ml op ijs gedurende een korte periode die moet worden verdeeld over verschillende co-kweekomstandigheden.
    OPMERKING: Begin pas met de bereiding van organoïden zodra ILC-monsters klaar zijn voor co-kweek; werk op ijs en snel zodra organoïden zijn geoogst om epitheelceldood te minimaliseren.
  4. Pre-coat een buis van 1,5 ml met PBS2 per ILC-replicatiemonster. Verdeel ~100-200 organoïden (ongeveer 1 put van een 24-putplaat) in elke buis.
  5. Pre-coat een p1000 tip in PBS2 en gebruik deze om het volume van ILC1s na FACS-zuivering te beoordelen (250-300 μL + gesorteerd volume). Bepaal de concentratie van ILC1 per ml met behulp van het aantal cellen dat is geregistreerd van de sortering en bepaal het vereiste volume.
  6. Voeg met dezelfde PBS2 gecoate p1000 tip maar liefst 500 ILC1's toe aan de PBS2 gecoate 1,5 ml buis met de organoïden. Als het aantal ILC1's dat uit de soort wordt verkregen minder dan 500 is, voegt u de organoïde rechtstreeks toe aan de buis met de oorspronkelijke soort om het verlies van cellen door de overdracht te minimaliseren.
  7. Draai ILC1 en organoïden bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Vermijd indien mogelijk tafelcentrifuges met een kleine diameter, omdat deze de cellen langs de rand van de binnenkant van de buis zullen bundelen in tegenstelling tot het creëren van een pellet aan de punt van de buis. Omdat het aantal cellen erg laag is, is het noodzakelijk om het verlies van cellen tijdens deze stappen te minimaliseren.
  8. Verwijder langzaam en voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant zonder de pellet te verstoren (die mogelijk niet zichtbaar is met het oog, vooral bij controles zonder organoïde ILC). Plaats het monster op ijs.
  9. Resuspend de koude pellet in 30 μL per put tbem. Terwijl u de buis op een koud oppervlak houdt (bijvoorbeeld een klein doosje ijs dat in de weefselkweekkap is geplaatst), mengt u de organoïden en ILC minstens 10-15 keer om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Triturate vaak maar voorzichtig, om beschadiging van de organoïden en de vorming van bellen te voorkomen.
  10. Breng 30 μL per put ILC-organoïden in TBEM aan op een voorverwarmde plaat van 24 of 48 putten om een enkele koepel te vormen. Plaats de plaat direct in de incubator (37 °C en 5% CO2) gedurende 10-20 min.
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om ILC-only en organoid-only controles in te stellen voor downstream-analyse. ILC1 zijn zeldzaam, maar GFP-ILC2 kan worden vervangen door immunofluorescentie of FSC / SSC flowcytometriecontroles waar wetenschappelijk passend.
  11. Voeg 550 μL (per putje) volledig ILC1-medium (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; zie tabel 1) toe aan alle gewenste experimentele cytokines of blokkerende antilichamen en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  12. Verwijder na 24 uur voorzichtig de plaat uit de couveuse en laat de plaat gedurende 1 minuut in een weefselkweekkap zitten om ervoor te zorgen dat de lymfocyten worden bezonken.
  13. Verwijder 200-250 μL media en plaats het in een lege put van een 24-well plaat. Controleer dit supernatant met een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat er geen lymfocyten zijn verwijderd.
    1. Als het supernatant helder is, voeg dan 300 μL vers ILC1-medium toe aan de co-kweek in de oorspronkelijke put. Als lymfocyten in het supernatant aanwezig zijn, centrifugeer dan bij 300-400 x g gedurende 3-5 minuten bij 4 °C en resuspend in 300 μL vers ILC1-medium en voeg dit toe aan de resterende 200-250 μL media in de oorspronkelijke put. Zorg ervoor dat u de media om de 1-2 dagen aanvult of wanneer de media lichtoranje/geel worden.
      OPMERKING: Laat media niet voldoende verdampen dat de punt van de matrixkoepel het oppervlak van de media breekt. Zorg er altijd voor dat de matrix volledig onder water staat. Overmatige verdamping kan worden voorkomen door centrale putten in de weefselkweekplaten te gebruiken en ~ 600 μL PBS toe te voegen aan de omliggende putten. Co-culturen met volwassen ILC zijn stabiel gedurende 1-4 dagen, waarna de organoïden die zonder grote verstoring zijn gezaaid, zullen scheuren en opnieuw worden ingezaaid als nieuwe crypten. Bij het analyseren van het epitheel, wordt aanbevolen dat culturen binnen 1-4 dagen na het vaststellen van co-culturen worden geanalyseerd.
    2. Downstream-analyse uitvoeren met behulp van immunofluorescentie, flowcytometrie of FACS-zuivering van doelpopulaties in lysisbuffer voor genexpressieanalyse door single cell of bulk RNA-seq of RT-qPCR, zoals beschreven in referentie8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wanneer ze met succes zijn voltooid, moeten vers geïsoleerde crypten binnen 2-4 dagen ontluikende cryptestructuren vormen (figuur 1A). Gezonde en robuuste organoïde culturen moeten actief groeien en kunnen worden gepasseerd en uitgebreid zoals beschreven in het protocol.

Dit protocol beschrijft de isolatie van dunne darm ILC1 van de RORγtGFP murine transgene reporterlijn, die de isolatie van levende ILC1 door FACS mogelijk maakt (figuur 2). Met behulp van het protocol dat hier wordt beschreven, is het verwachte ILC1-telbereik 350-3.500 geïsoleerde cellen.

Na te zijn gezaaid met organoïden kunnen co-culturen worden gevisualiseerd door immunocytochemie (figuur 3A-B). ILCs en epitheelcellen kunnen ook worden geanalyseerd door flowcytometrie, zoals aangetoond in figuur 3C. ILC1 upreguleert epitheliale CD44, zoals gekenmerkt door flowcytometrie (figuur 4A-B) en immunocytochemie (figuur 4C). In het bijzonder induceert ILC1 expressie van de CD44 v6-splicevariant in organoïden, zoals aangetoond door RT-qPCR (figuur 4D).

Tabel 1: Media- en buffersamenstellingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Besturingselementen met één kleur. Samenstelling van eenkleurige controles om dunne darm lamina propria ILC1 te isoleren met behulp van de gating-strategie gedefinieerd in figuur 2. Details van de gebruikte antilichamen zijn te vinden in de tabel met materialen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Fluorescentie minus één (FMO) mastermixen. Samenstelling van FMO mastermixen voor Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO en NK1.1 FMO. FMO-mastermixen bevatten alle gebruikte antilichamen behalve het antilichaam van belang en worden gebruikt om een monster aliquot te kleuren. Lineage cocktail wordt gedefinieerd als CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Details van de gebruikte antilichamen zijn te vinden in de tabel met materialen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Extracellulaire kleuring mastermix. De concentraties worden aangepast voor kleuring tot 5 x 106 cellen in 200 μL FACS-buffer. Details van de gebruikte antilichamen zijn te vinden in de tabel met materialen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 1
Figuur 1: Murine dunne darm organoïden. Representatief beeld van (A) met succes gegenereerde dunne darmorganoïden 2-3 dagen na passage en (B) mislukte cultuur. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Gating-strategie om ILC1's te isoleren uit de dunne darm lamina propria van de transgene RORγtGFP reporter muizen. Representatieve flowcytometrische plot van ILC1 isolatie van de dunne darm lamina propria van de transgene RORγtGFP reporter muizen door FACS. ILC1's worden gedefinieerd als live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ en NK1.1+. Vertegenwoordiger van N = >50 muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Organoïde en ILC1 co-culturen. Bright-field images (A), confocale microscopiebeelden (B) en FACS-plots (C) van dunne darmorganoïden (SIO) alleen gekweekt (boven) of met ILC1's (onder) (representatief voor experimenten met ILC1's van N = 3 muizen). (B) Kleuring met CD45 illustreert ILC1's en Zonula occludens eiwit 1 (ZO-1) markeert epitheelcellen in organoïden. Schaalstaven: 50 μm. (C) Voorheen omheind op enkele, levende cellen. Epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM) markeert intestinale epitheelcellen (IEC) in organoïden en CD45 markeert ILC1s. Het cijfer is aangepast van referentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: ILC1's in co-kweek met dunne darmorganoïden stimuleren de upregulatie van CD44 in intestinale epitheelcellen. (A) Een representatieve cytometrische plot van CD44-expressie in epitheliale cellulaire adhesiemolecuul (EpCAM) positieve epitheelcellen (live, CD45-, EpCAM+) van dunne darmorganoïden (SIO) alleen gekweekt (links) of met ILC1's gedurende 4 dagen (rechts). (B) Stroomkwantificering van CD44-expressie in intestinale epitheelcellen (IEC) (ILC1's van N = 5 muizen). (C) Representatief confocale microscopiebeeld van CD44-lokalisatie in d4 SIO alleen (links) of samen met ILC1's (rechts) (representatief voor N = 3 muizen). Schaalbalken: 50 μm. (D) RT-qPCR met exon-specifieke primers voor CD44-splicevarianten v4 en v6 (N = 3). Dit cijfer is aangepast van referentie8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft de methoden voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van zeldzame ILC1 door het minimaliseren van het verlies van lymfocyten tijdens het intestinale dissociatieprotocol en het vaststellen van co-culturen tussen deze twee compartimenten. Er zijn veel stappen in dit protocol, en hoewel sommige specifiek zijn voor ILC1's, kan deze aanpak worden toegepast op andere intestinale immuunceltypen en kunnen co-kweekopstellingen modulair worden aangepast aan individuele onderzoeksvragen. Verschillende kritieke stappen (waarvan niet mag worden afgeweken), evenals richtlijnen voor het oplossen van problemen voor de meer technisch uitdagende elementen van dit protocol, worden hier gemarkeerd.

Het gebruik van muizenche dunne darm organoïden uit enkele Lgr5+-eGFP darmstamcellen wordt steeds meer ingeburgerd33,34; in dit protocol wordt echter voorgesteld om intacte, volledige crypten van Lieberkuehn te isoleren van CD45.1-dieren. Niet alleen herstellen intacte crypten sneller dan enkele Lgr5 + -cellen, maar het gebruik van CD45.1-dieren zonder een GFP-verslaggever zorgt ervoor dat er geen kruisbesmetting CD45.2 + ILC wordt geanalyseerd uit de organoïde co-culturen en is compatibel met het gebruik van immuuncellen die een GFP-gebaseerde verslaggever bevatten. In de ervaring van de auteurs dragen geen mesenchymale of immuuncellen over na 1-3 passages van de organoïden. Het gebruik van CD45.2 of andere dieren voor het vaststellen van organoïden is daarom volledig aanvaardbaar. Tijdens het vaststellen van organoïden, als er geen crypten aanwezig zijn bij stap 1.1.19, kan het nodig zijn om de intacte crypten te verwijderen. Omgevingsfactoren zoals omgevingstemperatuur (bijvoorbeeld of de procedure in de zomer of in de winter wordt uitgevoerd) kunnen enige variabiliteit toevoegen aan incubatietijden tijdens dissociatie. De zaaidichtheid van crypten zal van invloed zijn op de initiële organoïdevormingsopbrengst; het wordt daarom aanbevolen om minimaal twee verschillende dichtheden te zaaien om succes te garanderen (bijv. 200-750 die hier wordt voorgesteld, maar dit bereik kan worden aangepast op basis van individuele behoeften).

Eenmaal vastgesteld, zijn intestinale organoïde culturen heterogeen, zowel tussen lijnen die zijn vastgesteld door dezelfde muizenstam, langs het maagdarmkanaal (bijv. Twaalfvingerige darm versus ileum), en zelfs binnen dezelfde bron van organoïde culturen35,36. Hoewel dit protocol robuust bleek te zijn over veel verschillende batches organoïden, kan deze heterogeniteit bijdragen aan de variabiliteit van de gegevens. Het is een goede gewoonte om consistent te zijn met organoïde onderhoud (passaging en mediaveranderingen) om technische ruis van fenotypisch irrelevante gegevens te verminderen. Dit omvat het consistent zijn met de pre-seeding passaging tijdlijn en met de kracht die wordt gebruikt om organoïden te dissociëren. Het wordt ook aanbevolen om dezelfde basale matrix te gebruiken voor experimenten die worden vergeleken en voor experimenten die moeten worden uitgevoerd met biologische replicaties van organoïden afkomstig van verschillende dieren (indien financieel en technisch haalbaar) om ervoor te zorgen dat de resultaten robuust reproduceerbaar zijn.

Bij het vaststellen van coculturen is de verhouding tussen immuun- en epitheelcellen een kritische overweging die optimalisatie vereist op basis van de onderzoeksvragen. Als de impact van epitheelcellen op ILC wordt onderzocht, moet het aantal gezaaide organoïden voldoende zijn om alle ILC te verzadigen. Omgekeerd, bij het beoordelen van de impact van ILC op het epitheel, kunnen verschillende ILC / epitheliale verhoudingen resulteren in verschillende fenotypische outputs, die differentiële toestanden van ILC-subsetverrijking in het slijmvlies weerspiegelen. De levensvatbaarheid van ILC1 is goed onderhouden in cultuur en de bevolking zal een milde expansie ondergaan, waarbij ~ 500 ILC1 en 100 dunne darmorganoïden (SIO) gemiddeld een 2-3-voudige expansie ondergaan. Deze opbrengst zal echter worden beïnvloed door aanvullende behandelingen, waarbij TGF-neutralisatie verbetert en p38-remming het absolute aantal ILC1 na co-kweekvermindert 8. Elk onverwacht verlies van meer dan 50% van de gezaaide ILC1-nummers kan het gevolg zijn van een onevenwichtige verhouding van ILC1 tot SIO (toename van het aantal gezaaide crypten), SIO-besmetting (zorg ervoor dat de antibioticacocktail functioneert en test het supernatant op mycoplasma), of van kwaliteitsproblemen in de cytokinevoorraden, waarbij ILC1 bijzonder gevoelig is voor een gebrek aan IL-2 of IL-15. Co-cultuur supernatanten van geconcentreerde 96- of 48-well platen zijn met succes gebruikt voor ELISA's. Bij het dissociëren van coculturen wordt aanbevolen om cellen met DNase te incuberen na een zachte trypsinevervanging van 20 minuten of op EDTA gebaseerde dissociatie uit te voeren naar afzonderlijke cellen om te voorkomen dat cellen samenklonteren door beschadigde epitheelcellen.

Een kracht van dit protocol is dat het reductionistische kweekomstandigheden in evenwicht brengt met complexe celtypen. Het gedrag van andere ILC-subsets in deze culturen kan echter afhankelijk zijn van factoren die niet aanwezig zijn in dit specifieke protocol. In het Lindemans-protocol dat wordt gebruikt voor ILC3-coculturen, werd IL-23 bijvoorbeeld aanvullend aangevuld met co-cultuurmedia om ILC3-onderhoud en -activering8 te ondersteunen. IL-15 bleek bijzonder belangrijk te zijn bij het onderhoud van ILC1 in het in dit protocol beschreven co-kweeksysteem, dat congruent was met eerdere meldingen van ILC1 die dit cytokine nodig hadden voor homeostase, maar niet ontwikkeling6. Om ILC te activeren of om ILC2's te onderhouden, kan het groeimedium verdere optimalisatie vereisen. Bovendien reguleren andere cellulaire compartimenten in de darm, afgezien van het epitheel, ILCs. Van darmneuronen is bijvoorbeeld bekend dat ze ILC2's gedeeltelijk moduleren door de activiteit van uitgescheiden neuropeptiden37. Microbiële factoren beïnvloeden ook ILC fenotype38. Deze beperking kan worden overwonnen door de toevoeging van deze elementen, bijvoorbeeld cytokines, peptiden of microbiële factoren, aan het co-kweeksysteem. Dit zou zelfs de ondervraging van de interactie tussen ILCs en meerdere cellulaire compartimenten in een reductionistische setting mogelijk kunnen maken. Volgens deze logica is het van cruciaal belang dat anti-biotische / anti-mycotische reagentia worden toegevoegd en vaak worden aangevuld aan organoïde media voordat co-culturen worden vastgesteld. Het is ook van cruciaal belang dat alle culturen worden uitgevoerd in aseptische omgevingen, omdat elke kweekbesmetting (bijv. Schimmelgroei of mycoplasma) waarschijnlijk de antigeen niet-specifieke ILO's zou activeren, waardoor significante fenotypen ontstaan die mogelijk niet aanwezig zijn in niet-besmette culturen. Om deze reden wordt terugtrekking van anti-biotische / -mycotische reagentia niet aanbevolen, zelfs niet in de co-culturen, omdat ze geen nadelige invloed op het epitheel of ILCs bleken te veroorzaken.

Deze methode biedt een unieke manier om signaleringsmodules tussen ILCs en het darmepitheel te karakteriseren, waardoor de biologie van beide compartimenten kan worden onderzocht. In vergelijking met andere in vitro methoden die bestaan uit een enkel celtype, is het hier gepresenteerde systeem meer vergelijkbaar met in vivo fysiologie en maakt het mogelijk om meerdere potentiële signaleringsmechanismen tussen epitheelcellen en ILCs te ondervragen. Andere methoden van in vitro ILC-kweek zijn voornamelijk afhankelijk van stromale feedercellijnen, zoals OP9 of OP9-DL139. Deze lijn is afgeleid van pasgeboren muis calvaria, die niet representatief is voor de darmomgeving. Hoewel deze tot op heden de gouden standaard hebben geleverd voor het handhaven van ILCs in vitro , lijden ze aan aanzienlijke beperkingen in hun toepassing om de impact van ILC op het epitheel te begrijpen.

Het hier beschreven co-kweekprotocol tussen muriene dunne darm organoïden en lamina propria afgeleide ILCs heeft belangrijke onderzoekstoepassingen. Dit systeem van co-cultuur is al gebruikt om de rol van ILC1 afgeleide TGF-β te bepalen in de uitbreiding van CD44 + epitheliale crypten8, die bijdraagt aan het begrip van epitheliale dynamiek bij inflammatoire darmaandoeningen. Deze studies dragen bij aan een toenemende hoeveelheid literatuur die het kritieke belang van epitheliale-ILC-signalering in intestinale homeostase en ontstekingondersteunt 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Acknowledgments

E.R. erkent een Ph.D. fellowship van de Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. erkent een Ph.D. fellowship van de Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. erkent een Ph.D. studentship van de NIHR GSTT BRC. J.F.N. erkent een Marie Skłodowska-Curie Fellowship, een King's Prize fellowship, een RCUK/UKRI Rutherford Fund fellowship (MR/R024812/1) en een Seed Award in Science van de Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). We bedanken ook het BRC flowcytometrie kernteam in Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reporter muizen waren een gulle gift van G. Eberl (Institut Pasteur, Parijs, Frankrijk). CD45.1 C57BL/6 muizen werden vriendelijk gegeven door T. Lawrence (King's College London, Londen) en P. Barral (King's College London, Londen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 181
Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter