Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samodling av murina tunntarmsepitelorganoider med medfödda lymfoida celler

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för att upprätta murina tunntarmsorganoider, isolera typ 1 medfödda lymfoida celler från den murina tunntarmen lamina propria och etablera 3-dimensionella (3D) samkulturer mellan båda celltyperna för att studera dubbelriktade interaktioner mellan tarmepitelceller och typ 1 medfödda lymfoida celler.

Abstract

Komplexa samkulturer av organoider med immunceller ger ett mångsidigt verktyg för att förhöra de dubbelriktade interaktionerna som ligger till grund för den känsliga balansen mellan slemhinnehomeostas. Dessa 3D, multicellulära system erbjuder en reduktionistisk modell för att ta itu med multifaktoriella sjukdomar och lösa tekniska svårigheter som uppstår när man studerar sällsynta celltyper som vävnadsboende medfödda lymfoida celler (ILC). Denna artikel beskriver ett murint system som kombinerar tunntarmsorganoider och tunntarm lamina propria härledda hjälparliknande typ-1 ILC (ILC1s), som lätt kan utvidgas till andra ILC- eller immunpopulationer. ILC är en vävnadsbosatt befolkning som är särskilt berikad i slemhinnan, där de främjar homeostas och snabbt svarar på skador eller infektioner. Organoida samkulturer med ILC har redan börjat belysa nya epitel-immuna signalmoduler i tarmen, vilket avslöjar hur olika ILC-delmängder påverkar tarmepitelbarriärens integritet och regenerering. Detta protokoll kommer att möjliggöra ytterligare undersökningar av ömsesidiga interaktioner mellan epitel- och immunceller, som har potential att ge nya insikter i mekanismerna för slemhinnehomeostas och inflammation.

Introduction

Kommunikation mellan tarmepitelet och tarmens immunsystem är centralt för upprätthållandet av intestinal homeostas1. Störningar i dessa interaktioner är förknippade med både lokala och systemiska sjukdomar, inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och gastrointestinal cancer2. Ett anmärkningsvärt exempel på en mer nyligen beskriven kritisk regulator av homeostas kommer från studien av medfödda lymfoida celler (ILC), som har framträtt som nyckelaktörer i tarmimmunlandskapet3. ILC är en grupp heterogena medfödda immunceller som reglerar intestinal homeostas och orkestrerar inflammation till stor del genom cytokinmedierad signalering4.

Murin ILC är i stort sett indelade i subtyper baserade på transkriptionsfaktor-, receptor- och cytokinuttrycksprofiler5. Typ 1 ILC, som inkluderar cytotoxiska Natural Killer (NK) -celler och hjälparliknande typ 1 ILC (ILC1s), definieras genom uttryck av transkriptionsfaktorn (eomesodermin) Eomes och T-boxprotein uttryckt i T-celler (T-bet)6, respektive utsöndrar cytokiner associerade med T-hjälpare typ-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) och tumörnekrosfaktor (TNF), som svar på interleukin (IL)-12, IL-15 och IL-187. Under homeostas utsöndrar vävnadsinvånade ILC1:er Transforming Growth Factor β (TGF-β) för att driva epitelproliferation och matrisremodellering8. Typ 2 ILC(2) svarar främst på helminthinfektion via utsöndring av T-hjälpare typ-2 (TH2) associerade cytokiner: IL-4, IL-5 och IL-13, och kännetecknas av uttrycket av retinsyrarelaterad orphan receptor (ROR) α (ROR-α)9 och GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos möss kännetecknas intestinala "inflammatoriska" ILC2s vidare av uttryck av Killer cell lectin-liknande receptor (underfamilj G-medlem 1, KLRG)13 där de svarar på epitelial tuft-cell härledd IL-2514,15. Slutligen är typ 3 ILC, som inkluderar lymfoida vävnadsinducerarceller och hjälparliknande typ-3 ILC (ILC3s), beroende av transkriptionsfaktorn ROR-γt16 och kluster i grupper som utsöndrar antingen granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som svar på lokala IL-1β- och IL-23-signaler17. Lymfoida vävnadsinduceringsceller kluster i Peyers plåster och är avgörande för utvecklingen av dessa sekundära lymfoida organ under utveckling18, medan ILC3 är den vanligaste ILC-subtypen i den vuxna murina tunntarmen lamina propria. Ett av de tidigaste murina intestinala organoida samodlingssystemen med ILC3 utnyttjades för att reta isär effekten av cytokinet IL-22 på signalgivare och aktivator av transkription 3 (STAT-3) medierad leucinrik upprepning innehållande G-protein kopplad receptor 5 (Lgr5) + intestinal stamcellsproliferation19, ett kraftfullt exempel på en regenerativ ILC-epitelinteraktion. ILC uppvisar imprint-heterogenitet mellan organ 20,21 och uppvisar plasticitet mellan delmängder som svar på polariserande cytokiner22. Vad som driver dessa vävnadsspecifika avtryck och plasticitetsskillnader, och vilken roll de spelar i kroniska sjukdomar som IBD23, är fortfarande spännande ämnen som kan hanteras med hjälp av organoida samkulturer.

Tarmorganoider har framträtt som en framgångsrik och pålitlig modell för att studera tarmepitelet24,25. Dessa genereras genom odling av intestinala epiteliala Lgr5 + stamceller, eller hela isolerade krypter, som inkluderar Paneth-celler som en endogen källa till Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Dessa 3D-strukturer upprätthålls antingen i syntetiska hydrogeler26 eller i biomaterial som efterliknar den basala lamina propria, till exempel Termisk tvärbindning Basal Extracellular Matrix (TBEM), och kompletteras ytterligare med tillväxtfaktorer som efterliknar den omgivande nischen, framför allt Epitelial Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP)-hämmaren Noggin och en Lgr5-ligand och Wnt-agonist R-Spondin127 . Under dessa förhållanden upprätthåller organoider epitelial apico-basal polaritet och rekapitulerar krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirande stamcellskrypter som terminalt differentieras till absorberande och sekretoriska celler i mitten av organoiden, som sedan kasta in i den inre pseudolumen med anoikis28. Även om tarmorganoider ensamma har varit enormt fördelaktiga som reduktionistiska modeller av epitelutveckling och dynamik isolerat 29,30, har de en enorm framtida potential för att förstå hur dessa beteenden regleras, påverkas eller till och med störs av immunfacket.

I följande protokoll beskrivs en metod för samodling mellan murina tunntarmsorganoider och lamina propria härledda ILC1s, som nyligen användes för att identifiera hur denna population oväntat minskar tarmsignaturerna av inflammation och istället bidrar till ökad epitelproliferation via TGF-β i detta system8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök måste slutföras i enlighet med och i enlighet med alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer för djuranvändning. Etiskt godkännande för studien som beskrivs i följande artikel och video har förvärvats i enlighet med och i enlighet med alla relevanta regulatoriska och institutionella riktlinjer för djuranvändning.

Alla möss avlivades genom cervikal förskjutning enligt det etiska standardförfarandet, utfört av utbildade individer. Före organ- och vävnadsskörd utfördes skivning av lårbensartären eller halshuggning (beroende på vad som är lämpligt enligt protokollet i handen) som bekräftande bedömningar av dödsfallet. Djur hölls under specifika patogenfria förhållanden (om inte annat anges) vid en ackrediterad kommersiell enhet och King's College London djurenhet i enlighet med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 till september 2018; P9720273E från september 2018).

1. Upprättande av murina tunntarmsorganoider

OBS: Detta avsnitt av protokollet beskriver genereringen av tarmorganoider från den murina tunntarmen. Krypter isoleras först från vävnad, återintas i TBEM och inkuberas sedan med media som innehåller EGF, Noggin och R-Spondin (ENR). Etablering av murina tunntarmsorganoider har också beskrivits väl på andra håll 24,25,27.

  1. Placera TBEM på is för att tina (40 μL / brunn) och sätt en standard vävnadskultur behandlad (avser plattor med en hydrofil och negativt laddad yta) 24-brunnsplatta i en 37 ° C inkubator för att förvärma.
    OBS: 500 μL TBEM tinar på cirka 2-4 timmar; lämna den inte vid rumstemperatur.
  2. Förbered ~ 4 ml eller 550 ml per brunn av ENR-medium genom att tillsätta EGF, Noggin och R-Spondin till basalmedium (tabell 1) och placera i en 37 ° C inkubator.
  3. Kasta ett 6-12 veckor gammalt djur och dissekera tunntarmen med pincett och mikrodissektionssax. Placera den i 15 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is.
  4. Använd magen och caecum som orienteringspunkter, isolera den önskade regionen i tunntarmen (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum). I detta protokoll isoleras ileumet.
  5. Sänk ner tarmen i PBS på en 10 cm2 petriskål på is. Använd pincett, ta bort fett försiktigt, men helt, från tarmen.
  6. Skär vävnaden i längdriktningen med mikrodissektionssax (helst med rundade spetsar för att undvika perforering). Håll tarmen nedsänkt i PBS, skaka för att ta bort avföring och håll slemhinnan uppåt för att spåra vävnadsorientering.
  7. Överför vävnad till det torra locket på en petriskål på is och placera tarmen slemhinnor / villus sida uppåt. Håll ena änden av tarmen med pincett, skrapa försiktigt bort slem med den vinklade kanten på en ren glasskiva.
  8. Fyll plattan med iskall PBS och skölj vävnaden.
  9. Förbelägga ett 50 ml rör med PBS2 (PBS + 2% FCS; se tabell 1) för att förhindra vidhäftning av vävnaden till plasten och tillsätt 10 ml iskall PBS till detta rör. Skär tarmen i små (~ 2 mm) segment och överför dem till 50 ml röret förbelagt med PBS2.
  10. Använd en 25 ml pipett förbelagd med PBS2, pipettera segmenten upp och ner 5-10 gånger för att rengöra vävnadsfragmenten.
  11. Låt segmenten nöja sig med 15-30 s, ta bort och kassera PBS-supernatanten och upprepa steg 1.10 och 1.11 tills lösningen är klar (ungefär 3-4 gånger).
  12. Låt segmenten lösa sig och kassera PBS-supernatanten. Lägg till 30 ml iskall kryptisoleringsbuffert (tabell 1).
  13. Placera rören på en horisontell rulle eller vippa vid 30–60 varv/min (eller skonsam) i 30 minuter vid 4 °C. Inkubera inte vid snabbare hastigheter, högre temperaturer eller längre varaktighet eftersom krypterna för tidigt kommer att lossna och bli enskilda celler med lägre livskraft och utbyte.
    OBS: Från och med detta skede bör alla procedurer utföras i en aseptisk miljö med sterila material och reagenser.
  14. Låt tarmsegmenten sätta sig vid basen av 50 ml-röret. Ta bort kryptisoleringsbufferten utan att störa de sedimenterade segmenten och överför den till ett 50 ml rör på is.
    OBS: Om kryptisoleringsprocessen var för rigorös kan krypter ses i denna fraktion. Den kan därför behållas som reserv men kommer optimalt att kasseras i slutet av protokollet.
  15. Tillsätt 20 ml iskall PBS till tarmsegmenten. Använd en 25 ml pipett förbelagd med PBS2, pipettera tarmsegment upp och ner 5-8 gånger.
  16. Låt segmenten nöja sig med 30 s. Förbelägg ett 50 ml rör och 25 ml pipett med PBS2. Använd denna pipett, samla supernatanten (fraktion 1) i det förbelagda 50 ml röret och placera röret på is.
    OBS: Denna fraktion tjänar till att skölja bort den återstående kryptisoleringsbufferten. Det fungerar dock också som ett ytterligare kvalitetskontrollsteg; om pipettering var för kraftig kommer krypter att vara rikliga i denna sköljfraktion, och om den var för mild kommer det att finnas mycket lite skräp i denna fraktion. Optimalt kasseras fraktion 1 i slutet av protokollet, men det kan användas för att göra organoider om problem uppstår med fraktioner 2-4 erhållna nedan.
  17. Upprepa steg 1.15 och 1.16 men tillsätt 10 ml iskall PBS i stället för 20 ml och placera supernatanten i ett nytt 50 ml rör förbelagt med PBS2 (fraktion 2).
  18. Upprepa steg 1.17 två gånger till men slå samman den resulterande supernatanten med fraktion 2 (i samma 50 ml rör från steg 1.17) för att erhålla fraktioner 2-4. Detta enda 50 ml rör bör innehålla de lossnade krypterna i 30 ml iskall PBS.
  19. Ta bort en 50 μL alikvot från de sammanförda 2-4 fraktionerna och lägg den på en täckglas. Bedöm för närvaron av epitelkrypter med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop.
    OBS: Om krypter inte finns, upprepa steg 1.17 och 1.18 med mer kraft under pipettering tills krypter har släppts. Kontrollera att krypter inte har lossnat i förtid i kryptisoleringsbufferten från steg 1.14 eller i bråkdel 1 från steg 1.16.
  20. Förbelägg en 100 μm sil och 50 ml rör med PBS2. För de sammanförda kryptfraktionerna genom denna sil och in i det förbelagda 50 ml-röret.
  21. Snurra ner ansträngda kryptfraktioner vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
  22. Kassera supernatanten och återsuspendera kryptorna i 10 ml iskall Advanced DMEM/F12. Flytta kryptorna till ett 15 ml rör.
  23. Snurra ner krypter vid 210 x g i 5 min vid 4 ° C för att avlägsna enskilda celler och lymfocyter.
  24. Resuspend krypter i 1 ml iskall Advanced DMEM/F12.
  25. Ta bort en 10 μL alikvot och lägg den på en täckglas. Använd ett inverterat ljusmikroskop och räkna antalet krypter för att bestämma kryptkoncentrationen.
  26. Beräkna volymen som krävs för ~ 400 och ~ 1 500 krypter. Förbelägg en p1000-spets med PBS2 och använd denna spets för att pipettera de önskade volymerna (innehållande ~ 400 och ~ 1 500 krypter) i separata 1,5 ml rör.
  27. Snurra ner kryptorna vid 300 x g i 5 min vid 4 ° C.
  28. Ta bort så mycket supernatant som möjligt och återsuspendera sedan krypterna i 80 μL TBEM placerad på is (förkylning av pipettspetsar vid 4 ° C för att förhindra matrisgelering, som inträffar vid 12 ° C).
  29. Ta bort 24-brunnsplattan, placerad i steg 1.1, från inkubatorn. Pipettera försiktigt 40 μL krypter i mitten av en brunn i en långsam, cirkulär rörelse för att bilda en platt men 3D-kupolstruktur eller i tre separata små kupoler.
    OBS: Organoidernas livskraft är den lägsta i mitten av kupolen där näringsämnen och gaser tränger mindre effektivt31; således är det viktigt att maximera ytan som utsätts för media samtidigt som man behåller tydliga 3D-strukturer.
  30. Upprepa steg 1.29 för att skapa totalt två brunnar med en densitet på ~ 200 krypter per brunn och ytterligare två brunnar med en densitet på ~ 750 krypter per brunn. Placera plattan direkt i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) i 15-20 minuter, var noga med att inte störa de viskösa men fortfarande flytande matriskupolerna.
  31. Tillsätt 550 μL förvärmda ENR-medier per brunn (från steg 1.2) och inkubera i 24 timmar vid 37 °C och 5 % CO2. I detta skede föreslås att man kompletterar ENR-medium med 5 μM Wnt-agonist (CHIR 99021) och 5 μM Rho-kinashämmare (Y-27632) under de första 24 timmar av odling efter isolering för att förbättra utbytet och effektiviteten av organoidgenerering av krypter som nyligen isolerats från vävnad.
    OBS: Krypter bör stänga för att bilda rundade strukturer inom 24 timmar, och kryptknoppar ska visas inom 2-4 dagar (Figur 1A).
  32. Byt ut mot färskt ENR-medium i slutet av inkubationen i steg 1.31, och sedan var ~ 2: e dag eller när fenolens pH-indikator i odlingsmediet blir blekorange men innan den blir gul.

2. Underhåll av murina tunntarmsorganoider

OBS: Detta avsnitt av protokollet beskriver underhåll och passering av murina tunntarmsorganoider. Organoider skördas först och störs sedan mekaniskt med en böjd p1000-spets. Denna process bryter stora organoider som består av många krypter i flera mindre fragment för expansion och frigör döda celler som har ackumulerats i pseudolumen. Murin tunntarmsorganoid underhåll har också beskrivits väl någon annanstans 24,25,27. Alla procedurer bör utföras i en aseptisk miljö med sterila material och reagenser. Passage eller expandera organoider en gång var 4-5 dagar, innan organoiderna spricker uppstår från väsentlig ackumulering av skräp i organoidlumen. Organoider kan passera i ett förhållande av 1: 2-1: 3 beroende på organoiddensitet, vilket optimalt kommer att vara mellan 100-200 organoider per brunn.

  1. Som i steg 1.1 och 1.2, tina TBEM på is (40 μL / brunn) och förbered ENR-medium (550 μL per brunn). Placera den medie- och standardvävnadskultur som behandlas med 24 brunnar i en 37 °C inkubator.
  2. Ta bort plattan som innehåller organoider från inkubatorn. Kassera media från brunnen för att passera.
  3. Tillsätt 500 μL iskall Advanced DMEM/F12 till brunnen. Använd en p1000-spets (förbelagd med media för att undvika att organoid fastnar på spetsens inre), skörda organoiderna i ett 15 ml rör.
  4. Skölj botten av brunnen med 250-300 μL iskall Advanced DMEM/F12 så att inga organoider finns kvar i brunnen och poola i 15 ml-röret som innehåller skördade organoider från steg 2.3. Upprepa steg 2.3 och 2.4 när du passerar flera brunnar och samla organoiderna från flera brunnar i samma 15 ml rör.
  5. Snurra ner organoider vid 300 x g i 3 min vid 4 °C.
  6. Vid centrifugering, se till att det finns fyra synliga fraktioner: en basfraktion med friska organoider, en central och klar matrisfraktion, en matrisfraktion innehållande enstaka och döda celler och ett övre supernatantskikt innehållande enstaka och döda celler. Ta bort supernatanten, skräpfraktionen och så mycket av det klara matrisfragmentet som möjligt utan att störa pelletsen av organoider.
  7. Böj försiktigt spetsen på en p1000 pipettspets (ca 2-5 mm böjning). Förbelägg detta tips i PBS2 eller Advanced DMEM/F12. Med hjälp av detta tips pipetterar du organoiderna upp och ner 10-20 gånger för att mekaniskt störa organoiderna och den återstående matrisen.
  8. Snurra ner vid 210 x g i 3 min vid 4 °C.
  9. Som i steg 2.6, ta bort supernatanten, skräpfraktionen och så mycket av det klara matrisfragmentet som möjligt utan att störa pelleten av dissocierade krypter. Om friska krypter eller små organoider inte har bildat en klar pellets, centrifugera igen vid 300 x g i 3 min vid 4 °C.
  10. Beräkna den erforderliga volymen TBEM (80-120 μL per brunn av skördade organoider beroende på om ett 1: 2 eller 1: 3 passageförhållande används).
  11. Resuspend pelletsen i den beräknade volymen av TBEM och applicera 40 μL per brunn på den förvärmda 24-brunnsplattan för att bilda en kupol. Placera plattan direkt i inkubatorn (37 ° C; 5% CO2) i 15-20 min.
  12. Tillsätt 550 μL ENR-medium per brunn och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2. Kontrollera kulturer för organoidbildning efter 24 timmar. Byt ut mot färskt ENR-medium var 2-3:e dag efter passagen.

3. Isolering av tunntarmslamina propria medfödda lymfoida celler

OBS: Detta avsnitt av protokollet beskriver isoleringen av ILC1 från den murina tunntarmen lamina propria hos RORγt GFP-reportermössen. Detta involverar epitelcellsavlägsnande, vävnadsförtunning, densitetsgradientseparation av lymfocyter och ILC1-isolering via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). FACS-isolering enligt grindstrategin i figur 2 kräver den extracellulära färgningsmastermixen (tabell 4), med de ytterligare färgningskontrollerna som beskrivs i tabell 2 och tabell 3 för maskinen (tabell 2) och grinden (tabell 3) inställd. RORγt GFP-reportermössen används för att isolera levande, ren ILC1 och grinda ut RORγtGFP+ ILC3. Vävnadsbehandling för isolering av lamina propria lymfocyter har också beskrivits väl på andra håll32.

  1. Vävnad bearbetning
    OBS: Vävnad från enskilda biologiska djurreplikat hålls åtskild i detta protokoll. Dessa prover bör märkas på lämpligt sätt och förvaras på is när så är möjligt. Alla reagenser utom matsmältningsenzymer bör tillåtas att nå rumstemperatur för att säkerställa snabb vävnadsförtunning.
    1. Lägg TBEM på is för att tina (40 μL /brunn). Förvara en vanlig vävnadsodlingsbehandlad 24-brunnsplatta i en 37 ° C inkubator för att förvärma.
    2. Förbered färsk epitelborttagningsbuffert och matsmältningsbuffert (se tabell 1). Förbered isotoniskt gradientmedium med låg viskositetsdensitet (LVDGM) (90% LVDGM och 10% 10x PBS), 40% isotonisk LVDGM och 80% isotonisk LVDGM i neutraliserande buffert (tabell 1).
    3. Kasta ett 6-12 veckor gammalt djur, dissekera tunntarmen med hjälp av pincett och mikrodissektionssax och placera tarmen i 15 ml PBS på is.
    4. Sänk ner tarmen i PBS på en 10 cm2 petriskål på is och använd pincett för att ta bort fett försiktigt men helt från tarmen.
    5. Ta bort Peyers fläckar (~ 5-10; kör i en linje mittemot fettvävnadslinjen) med hjälp av mikrodissektionssax för att tömma lymfoida vävnadsinduceringsceller och B-celler.
      OBS: Peyers fläckar saknas i Rag-/- och andra härstamningsutarmade djur. Till skillnad från luftbubblor kommer Peyers lappar att förbli på plats om de knuffas.
    6. Skär vävnaden i längdriktningen med mikrodissektionssax (helst med rundade spetsar för att undvika perforering). Håll tarmen nedsänkt i PBS, skaka för att ta bort fekal materia.
    7. Skär vävnaden i 2-4 cm långa bitar och överför dem till ett 50 ml rör.
    8. Tillsätt cirka 20-40 ml iskall PBS och skaka kraftigt i 5-15 s för att ta bort slem och skräp.
    9. Kasta innehållet i röret på en färsk petriskål och byt ut tarmfragment i samma 50 ml rör med pincett.
    10. Upprepa steg 3.1.8 och 3.1.9 3-4 gånger, eller tills PBS är klart.
  2. Epitel borttagning
    1. Lägg tarmfragment i en färsk petriskål på is. Använd pincett, plocka upp tarmsegment och ta bort överflödig vätska genom att knacka på en torr yta.
    2. Skär vävnaden i ~ 0,75-1 cm bitar och överför dem till ett nytt 50 ml rör. Tillsätt 5-7 ml epitelborttagningsbuffert (tabell 1). Virvla röret och se till att alla tarmsegment är nedsänkta i bufferten.
    3. Inkubera proverna vid 37 °C med gungning (100–150 varv/min) i 12–15 min. Vortex röret i 20-30 s.
    4. Upprepa steg 3.2.1-3.2.3 en gång till, kassera den grumliga supernatanten (fraktion innehåller epitel- och intraepitelceller) och ersätt den med färsk epitelborttagningsbuffert.
  3. Digestion av vävnaden
    1. Tippa innehållet på en färsk petriskål. Använd pincett, plocka upp tarmsegmenten och knacka på en torr yta för att kassera överflödig vätska. Lägg segmenten i en färsk petriskål på is.
    2. Kluster segmenten i mitten av petriskålen i en tät massa. Använd antingen två skalpeller eller vass sax, strimla vävnaden fint tills den når en viskös konsistens som kan passera genom en p1000 pipettspets.
    3. Placera malet vävnad i ett rent 50 ml rör med pincett. Skölj petriskålen med 1-2 ml matsmältningsbuffert (tabell 1) för att samla eventuell kvarvarande vävnad och poola den i 50 ml-röret med den strimlade vävnaden.
    4. Tillsätt 5-7 ml matsmältningsbuffert till den strimlade vävnaden och se till att all vävnad samlas i botten av röret.
    5. Inkubera proverna vid 37 °C, med medelhög gungning (~100-150 rpm) i 15 min. Vortex röret i 20-30 s var 5: e minut för att underlätta matsmältningen.
    6. Medan proverna inkuberar, placera en 40 μm cellsil ovanpå ett nytt 50 ml rör för varje prov. Belägg filtren med 1-2 ml neutraliserande buffert (tabell 1).
    7. Vortex proverna i 20-30 s efter att inkubationen är klar.
    8. Filtrera den delvis smälta vävnaden genom det belagda 40 μm-filtret i 50 ml-röret som innehåller neutraliserande buffert.
    9. Använd pincett för att samla osmält vävnad från 40 μm-filtret och placera det tillbaka i 50 ml-röret som matsmältningen utfördes i, för den andra omgången av matsmältningen. Ta bort filter och skölj dem med matsmältningsbuffert för att lossa eventuell osmält vävnad som fäster vid filtret.
    10. När så mycket osmält vävnad som möjligt har tagits bort från filtret och placerats tillbaka i 50 ml-röret som matsmältningen utfördes i, skölj filtret med 1-2 ml neutraliserande buffert över 50 ml-röret som innehåller den filtrerade supernatanten.
    11. Tillsätt 20-25 ml neutraliserande buffert till den filtrerade supernatanten och placera den på is för att bibehålla livskraften hos isolerade celler under den andra omgången av vävnadsförtunning.
    12. Tillsätt ytterligare 5-10 ml matsmältningsbuffert till den osmälta vävnaden och upprepa steg 3.3.5-3.3.10, se till att filtrera den smälta vävnaden i samma rör som används i steg 3.3.8 (samma filter kan också återanvändas). Skölj filtret med neutraliserande buffert tills 50 ml-linjen har uppnåtts och kassera sedan eventuell kvarvarande osmält vävnad.
  4. Lymfocytisolering genom densitetsgradient
    1. Snurra de uppsamlade supernatanterna för varje biologiskt replikat vid 500 x g i 10 min.
    2. Under steg 3.4.1, tillsätt 5 ml 80% isotonisk LVDGM till ett 15 ml rör för varje biologiskt replikat.
    3. Efter centrifugering, kassera supernatanten från den filtrerade, smälta vävnaden. Resuspend pelletsen i 10 ml av 40% isotonisk LVDGM, vilket säkerställer att pelletsen är väl homogeniserad och inga stora bitar kvarstår.
    4. Ställ in pipetthjälpmedlet till sin långsammaste inställning, luta 15 ml-röret som innehåller 80% isotoniskt LVDGM och lägg mycket försiktigt över 10 ml cellsuspension i 40% isotonisk LVDGM så att cellsuspensionen inte blandas med 80% fraktionen.
      OBS: Om fraktionerna någonsin skulle blandas av misstag, distribuera snabbt lymfocyter som nådde 80% -fraktionen mellan två 50 ml rör fyllda med PBS och centrifug i 10 min vid 500 x g. Kassera sedan supernatanten och upprepa steg 3.4.3-3.4.4.
    5. Snurra rören vid 900 x g och 20 °C, med accelerationen och retardationen inställd på den lägsta inställningen för att säkerställa att fraktionerna inte störs. Centrifug i 20 min (exklusive paustid).
      OBS: Alla procedurer från detta steg och framåt bör utföras i en aseptisk vävnadsodlingshuva med sterila material och reagenser.
    6. Förbelägg ett 50 ml rör för varje prov med PBS2 och tillsätt 45 ml iskall PBS.
    7. Efter centrifugering, ta försiktigt bort det övre skräpskiktet från 15 ml-röret. Täck en p1000-spets med PBS2 och använd den för att samla upp den lymfocytbelastade interfasen mellan 40% -80% gradienterna i 50 ml-röret som innehåller 45 ml iskall PBS.
    8. Snurra rören vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    9. Kassera supernatanten och återspäd pelletsen i 500 μL FACS-buffert (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA och 10 mM HEPES; se tabell 1). Förbelägg ett 40 μm filter med FACS-buffert och använd det för att filtrera cellsuspensionen i ett flödesrör. Skölj 50 ml-röret med ytterligare 500 μL FACS-buffert och filtrera i samma flödesrör.
    10. Ta bort en 10 μL alikvot från den resulterande 1 ml cellsuspensionen. Räkna lymfocytutbytet med hjälp av en cellräknare eller hemocytometer och beräkna cellkoncentrationen för varje prov.
  5. Provberedning för sortering - extracellulär färgning
    OBS: Antikropparna som används i den extracellulära färgningsmastermixen, liksom reagenserna för att bereda det fixerbara viabilitetsfärgämnet och Fc-blocklösningen, används i koncentrationer som är tillräckliga för upp till 5 x 106 celler per 100 μL. Volymerna bör justeras i enlighet därefter. För FACS-maskinkompensation för att sortera ILC1 krävs enfärgskontroller för var och en av fluoroforerna i den extracellulära färgningsmastermixen. För antikropparna kan kompensationspärlor som innehåller en positiv antikroppsbindande pärlpopulation och en negativ antikropps icke-bindande pärlpopulation användas. För ultraviolett (UV) fixerbart viabilitetsfärgämne enfärgskontroll kan kompensationspärlor som innehåller aminreaktiva (för positiv signal) och icke-reaktiva (för negativ signal) populationer användas. Det rekommenderas inte att använda celler från RORγtGFPreporter möss för UV fixable viability dye enfärgad kontroll, eftersom dessa celler kommer att innehålla en GFP+ signal.
    1. Ta bort en liten alikvot på ~ 10 μL från varje prov och poola den i ett separat flödesrör som innehåller 250 μL FACS-buffert. Placera röret på is. Detta kommer att användas för den ofärgade kontrollen.
    2. Tillsätt 1 ml PBS till den återstående volymen i provrören. Centrifug vid 300-400 x g i 3-5 min.
    3. Förbered 200 μL UV-fixbar viabilitetsfärglösning per prov. Utspätt UV-fixbart viabilitetsfärgämne (återsuspenderat i DMSO enligt tillverkarens instruktioner) 1:500 i PBS (eller enligt tillverkarens instruktioner).
    4. Kassera supernatanten och resuspendera proverna i 200 μL UV-fixbar viabilitetsfärglösning. Virvla rören och inkubera i mörkret vid 4 ° C i 10-15 min.
    5. Tillsätt 2 ml FACS-buffert till rören för att släcka uv-fixerbart viabilitetsfärgämne, virvel i 10 s och centrifugera rören vid 300-400 x g i 3-5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten från de centrifugerade rören.
    6. Förbered 200 μL Fc-blocklösning per prov (0,25 mg/ml Fc-block i FACS-bufferten).
    7. Tillsätt 200 μL Fc-blocklösning till vart och ett av proverna från steg 3.5.5, virvel i 10 s, och inkubera i mörkret vid 4 °C i 10 min.
    8. Tillsätt 500 μL FACS-buffert till ett nytt flödesrör. Ta bort en 2-5 μL alikvot från varje prov och poola den i röret för fluorescens minus en (FMO) kontroller.
    9. Virvla FMO-röret i 10 s och fördela jämnt (100 μL per rör) i färskflödesrör märkta för var och en av FMO-kontrollerna (Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO och NK1.1 FMO; se tabell 3). Tillsätt alla antikroppar utom den antikropp som är av intresse för varje rör (enligt beskrivningen i tabell 3) och virvel i 10 s. Placera FMO-kontrollerna åt sidan i mörkret vid 4 °C.
    10. Centrifugera proverna (ej FMO-kontroller) vid 300-400 x g i 3-5 min vid 4 °C.
    11. Förbered extracellulär färgning mastermix (200 μL per prov) med de slutliga antikroppsutspädningarna enligt beskrivningen i tabell 4. Justera färgningsvolymen för lämplig cellkoncentration (upp till 5 x 106 celler per 100 μL) beroende på cellantalet från steg 3.4.10.
    12. Tillsätt extracellulär färgning mastermix till proverna, virvel i 10 s, och lägg dem åt sidan i mörkret vid 4 °C.
    13. Förbered en ny enfärgskontroll för varje antikropp som är avsedd att användas i gatingstrategin (figur 2). Vortexantikroppskompensationspärlor i 20 s, tillsätt 1 droppe pärlor till ett flödesrör, fläck med 0,5 μL antikropp (som visas i tabell 2 eller enligt tillverkarens instruktioner) och virvel i 10 s.
    14. Förbered en UV-fixbar livskraft färgämne enfärgad kontroll med hjälp av en amin-reaktiv kompensation pärlsats. Virvelaminreaktiva kompensationspärlor för 20 s, tillsätt 1 μL levande / dött UV-färgämne (som visas i tabell 2 eller enligt tillverkarens instruktioner) och virvel i 10 s.
    15. Inkubera proverna, FMO: erna och enfärgskontrollerna i mörkret i 30 minuter vid 4 ° C.
    16. Under denna tid, förbered rör för att samla de sorterade cellerna. Tillsätt 400-500 μL 10% FBS i Advanced DMEM /F12 till 1,5 ml rör för varje prov.
    17. Efter inkubationen tillsätt 2 ml PBS2 till var och en av proverna, FMO-kontrollerna och enfärgskontrollerna.
    18. Centrifugera proverna, FMO-kontrollerna och enfärgskontrollerna vid 300-400 x g i 3-5 minuter vid 4 ° C.
    19. Kassera supernatanten från alla centrifugerade rör. Återutnyttja proverna och FMO-kontrollerna i 250 μL FACS-buffert och virvel i 10 s.
    20. Resuspend de enfärgade kontrollerna i 250 μL PBS2. Tillsätt 1 droppe amin icke-reaktiva pärlor till UV-fixbar viabilitet färgämne enfärgad kontroll endast. Vortex alla kontroller i 10 s.
    21. Cellerna är nu redo att sorteras. Förvara prover, FMO-kontroller och enfärgskontroller på is i mörkret när det är möjligt för att förbättra cellens livskraft och förhindra förlust av signal från fotoblekning.

4. Samodling av tunntarmsorganoider med medfödda lymfoida celler

OBS: I detta avsnitt beskrivs samodlingen av sorterad murin tunntarmS-ILC1 (isolerad enligt protokollet i avsnitt 3) med murina tunntarmsorganoider (beskrivs i avsnitt 1 och 2). Organoider bör optimalt användas 1-2 dagar efter passage. Samodling innebär att man skördar organoiderna, lägger till lämpligt antal ILC1, centrifugerar till pelletsorganoider och ILC1 tillsammans och återanvänder i TBEM. Slutför det här avsnittet så snart som möjligt när ILC1 har isolerats. Alla procedurer bör utföras i en aseptisk miljö med sterila material och reagenser.

  1. Kontrollera att TBEM från steg 3.1.1 har tinats upp.
  2. Skörda 1-2 dagar gamla organoider enligt beskrivningen i steg 2.3 och 2.4.
  3. Återsuspendera organoidpelleten i 1 ml kall iskall Advanced DMEM/F12. Böj inte p1000-spetsen som gjort när du passerar organoiderna, eftersom avsikten här är att upprätthålla organoidstrukturen för samkultur. Placera vid behov organoiderna i separata PBS2-belagda 1,5 ml rör på is under en kort period som ska fördelas mellan olika samodlingsförhållanden.
    OBS: Börja bara beredning av organoider när ILC-prover är redo för samodling; arbeta på is och snabbt så snart organoider har skördats för att minimera epitelcellsdöd.
  4. Förbelägg ett 1,5 ml rör med PBS2 per ILC-replikatprov. Fördela ~ 100-200 organoider (ungefär 1 brunn av en 24-brunnsplatta) i varje rör.
  5. Förbelägg en p1000-spets i PBS2 och använd den för att bedöma volymen av ILC1s efter FACS-rening (250-300 μL + sorterad volym). Bestäm koncentrationen av ILC1 per ml med hjälp av antalet celler som registrerats från sorteringen och bestäm den önskade volymen.
  6. Använd samma PBS2-belagda p1000-spets och tillsätt inte mindre än 500 ILC1s till det PBS2-belagda 1,5 ml-röret som innehåller organoiderna. Om antalet ILC1 som ges från sorteringen är mindre än 500, tillsätt organoiden direkt till röret som innehåller den ursprungliga sorteringen för att minimera förlusten av celler från överföringen.
  7. Snurra ner ILC1 och organoider vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. Om möjligt, undvik bordscentrifuger med liten diameter, eftersom dessa kommer att samla cellerna längs kanten av rörets inre i motsats till att skapa en pellets vid rörets spets. Eftersom cellantalet är mycket lågt är det absolut nödvändigt att minimera förlusten av celler under dessa steg.
  8. Ta långsamt och försiktigt bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa pelletsen (som kanske inte syns för ögat, särskilt i kontroller utan organoid ILC). Lägg provet på is.
  9. Resuspend den kalla pelletsen i 30 μL per brunn av TBEM. Medan du håller röret på en kall yta (t.ex. en liten låda med is placerad i vävnadsodlingshuven), blanda organoiderna och ILC minst 10-15 gånger för att säkerställa jämn fördelning. Triturera ofta men försiktigt, för att undvika att skada organoiderna och bildandet av bubblor.
  10. Applicera 30 μL per brunn av ILC-organoider i TBEM på en förvärmd 24- eller 48-brunnsplatta för att bilda en enda kupol. Placera plattan direkt i inkubatorn (37 ° C och 5% CO2) i 10-20 min.
    OBS: Det rekommenderas starkt att ILC-endast och organoid-endast kontroller ställs in för nedströms analys. ILC1 är sällsynta, men GFP-ILC2 kan ersättas med immunofluorescens eller FSC/SSC-flödescytometrikontroller där det är vetenskapligt lämpligt.
  11. Tillsätt 550 μL (per brunn) fullständigt ILC1-medium (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-merkaptoetanol; se tabell 1) med önskade experimentella cytokiner eller blockerande antikroppar och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 24 timmar.
  12. Efter 24 timmar, ta försiktigt bort plattan från inkubatorn och låt plattan sitta i en vävnadsodlingskåpa i 1 min för att säkerställa att lymfocyterna löses.
  13. Ta bort 200-250 μL media och placera det i en tom brunn på en 24-brunnsplatta. Kontrollera denna supernatant med ett inverterat mikroskop för att säkerställa att inga lymfocyter avlägsnades.
    1. Om supernatanten är klar, tillsätt 300 μL färskt ILC1-medium till samkulturen i den ursprungliga brunnen. Om lymfocyter finns i supernatanten, centrifugera vid 300-400 x g i 3-5 min vid 4 ° C och återsuspendera i 300 μL färskt ILC1-medium och tillsätt detta till de återstående 200-250 μL media i den ursprungliga brunnen. Se till att fylla på media var 1-2: e dag eller när media blir blekorange / gul.
      OBS: Låt inte media avdunsta tillräckligt för att matriskupolens spets bryter ytan på mediet. Se alltid till att matrisen är helt nedsänkt. Överdriven avdunstning kan undvikas genom att använda centrala brunnar i vävnadsodlingsplattorna och tillsätta ~ 600 μL PBS till de omgivande brunnarna. Samkulturer med vuxen ILC är stabila i 1-4 dagar, varefter organoiderna som såddes utan större störningar kommer att brista och återställas som nya krypter. Om man analyserar epitelet rekommenderas att kulturer analyseras inom 1-4 dagar efter upprättandet av samkulturer.
    2. Utföra nedströmsanalys med immunofluorescens, flödescytometri eller FACS-rening av målpopulationer till lysbuffert för genuttrycksanalys med encells- eller bulk-RNA-seq eller RT-qPCR, enligt beskrivningen i referens8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När de är framgångsrikt färdiga bör nyisolerade krypter bilda spirande kryptstrukturer inom 2-4 dagar (figur 1A). Friska och robusta organoidkulturer bör växa aktivt och kan passeras och utvidgas enligt vad som beskrivs i protokollet.

Detta protokoll beskriver isoleringen av tunntarmen ILC1 från RORγtGFP murin transgen reporterlinje, vilket möjliggör isolering av levande ILC1 av FACS (Figur 2). Med hjälp av protokollet som beskrivs här är det förväntade ILC1-räkningsområdet 350-3 500 isolerade celler.

Efter sådd med organoider kan samkulturer visualiseras genom immunocytokemi (figur 3A-B). ILC och epitelceller kan också analyseras med flödescytometri, vilket demonstreras i figur 3C. ILC1 uppreglerar epitelial CD44, som kännetecknas av flödescytometri (figur 4A-B) och immunocytokemi (figur 4C). Specifikt inducerar ILC1 uttryck av CD44 v6-skarvvarianten i organoider, vilket demonstreras av RT-qPCR (figur 4D).

Tabell 1: Medie- och buffertkompositioner. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Enfärgskontroller. Sammansättning av enfärgskontroller för att isolera tunntarmen lamina propria ILC1 med hjälp av den gatingstrategi som definieras i figur 2. Detaljer om antikroppar som används finns i materialförteckningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Fluorescens minus en (FMO) mastermixer. Sammansättning av FMO-mastermixer för Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO och NK1.1 FMO. FMO-masterblandningar innehåller alla antikroppar som används utom antikroppen av intresse och används för att färga ett prov alikvot. Lineage cocktail definieras som CD19, CD3e, CD5, Ly-6G / Ly-6C. Detaljer om antikroppar som används finns i materialförteckningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Extracellulär färgning mastermix. Koncentrationerna justeras för färgning upp till 5 x 106 celler i 200 μL FACS-buffert. Detaljer om antikroppar som används finns i materialförteckningen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 1
Figur 1: Murina tunntarmsorganoider. Representativ bild av (A) framgångsrikt genererade tunntarmsorganoider 2-3 dagar efter passage och (B) misslyckad kultur. Skala bar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi för att isolera ILC1 från tunntarmen lamina propria hos de transgena RORγtGFP reporter möss. Representativt flödescytometriskt diagram över ILC1-isolering från tunntarmen lamina propria hos de transgena RORγt GFP-reportermössen av FACS. ILC1 definieras som live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ och NK1.1+. Representant från N = >50 möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Organoid- och ILC1-samkulturer. Ljusfältsbilder (A), konfokala mikroskopibilder (B) och FACS-plottar (C) av tunntarmsorganoider (SIO) odlade ensamma (överst) eller med ILC1 (botten) (representativa för experiment med ILC1s från N = 3 möss). (B) Färgning med CD45 illustrerar ILC1s och Zonula occludens protein 1 (ZO-1) markerar epitelceller i organoider. Skalstänger: 50 μm. (C) Tidigare gated på enstaka, levande celler. Epitelial cellulär vidhäftningsmolekyl (EpCAM) markerar tarmepitelceller (IEC) i organoider och CD45-märken ILC1. Figuren är anpassad från referens8. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: ILC1 i samodling med tunntarmsorganoider driver uppreglering av CD44 i tarmepitelceller. (A) En representativ cytometrisk plot av CD44-uttryck i epitelcellulär vidhäftningsmolekyl (EpCAM) positiva epitelceller (levande, CD45-, EpCAM +) från tunntarmsorganoider (SIO) odlade ensamma (vänster) eller med ILC1 i 4 dagar (höger). (B) Flödeskvantifiering av CD44-uttryck i tarmepitelceller (IEC) (ILC1s från N = 5 möss). (C) Representativ konfokalmikroskopibild av CD44-lokalisering i d4 SIO ensam (vänster) eller samodlade med ILC1 (höger) (representativ för N = 3 möss). Skalstänger: 50 μm. (D) RT-qPCR med exonspecifika primers för CD44-skarvvarianter v4 och v6 (N = 3). Denna siffra är anpassad från referens8. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver metoderna för att etablera murina tunntarmsorganoider, isolera sällsynta ILC1 genom att minimera förlusten av lymfocyter under tarmdissociationsprotokollet och etablera samkulturer mellan dessa två fack. Det finns många steg i detta protokoll, och medan vissa är specifika för ILC1, kan detta tillvägagångssätt tillämpas på andra intestinala immuncellstyper, och samodlingsinställningar kan anpassas modulärt för att passa enskilda forskningsfrågor. Flera kritiska steg (som rekommenderas att inte avvikas från), liksom felsökningsriktlinjer för de mer tekniskt utmanande elementen i detta protokoll, markeras här.

Användningen av murina tunntarmsorganoider från enstaka Lgr5+-eGFP tarmstamceller blir alltmer väletablerad33,34; I detta protokoll föreslås det dock att isolera intakta, hela krypter av Lieberkuehn från CD45.1-djur. Intakta krypter återhämtar sig inte bara snabbare än enskilda Lgr5+ -celler, men användningen av CD45.1-djur utan GFP-reporter säkerställer att ingen korsförorenande CD45.2 + ILC analyseras från organoidkulturerna och är kompatibel med användningen av immunceller som innehåller en GFP-baserad reporter. Enligt författarnas erfarenhet överförs inga mesenkymala eller immunceller efter 1-3 passager av organoiderna. Användningen av CD45.2 eller andra djur för att etablera organoider är därför helt acceptabel. Under organoidetablering, om krypter inte finns i steg 1.1.19, kan mer rigorös manuell skakning vara nödvändig för att avlägsna de intakta krypterna. Miljöfaktorer som rumstemperatur (t.ex. om proceduren utförs på sommaren eller vintern) kan lägga till viss variation i inkubationstider under dissociation. Krypternas sådddensitet kommer att påverka det initiala organoidbildningsutbytet; Det rekommenderas därför att sådda minst två olika densiteter för att säkerställa framgång (t.ex. 200-750 som föreslås här, men detta intervall kan anpassas utifrån individuella behov).

När de väl är etablerade är tarmorganoidkulturer heterogena både mellan linjer etablerade från samma musstam, längs mag-tarmkanalen (t.ex. tolvfingertarmen kontra ileum) och till och med inom samma brunn av organoidkulturer35,36. Även om detta protokoll befanns vara robust över många olika partier av organoider, kan denna heterogenitet bidra till datavariabilitet. Det är god praxis att vara konsekvent med organoidunderhåll (passage och medieförändringar) för att minska tekniskt brus från fenotypiskt irrelevanta data. Detta inkluderar att överensstämma med tidslinjen för pre-seeding passaging och med den kraft som används för att dissociera organoider. Det rekommenderas också att man använder samma basalmatris för experiment som jämförs och för experiment som ska utföras med biologiska replikat av organoider som härrör från olika djur (när det är ekonomiskt och tekniskt genomförbart) för att säkerställa att resultaten är robust reproducerbara.

Vid upprättandet av samkulturer är förhållandet mellan immun och epitelceller ett kritiskt övervägande som kommer att kräva optimering baserat på forskningsfrågorna. Om effekten av epitelceller på ILC undersöks, måste antalet organoider sådda vara tillräckliga för att mätta all ILC. Omvänt, vid bedömning av ILC: s inverkan på epitelet, kan olika ILC / epitelförhållanden resultera i olika fenotypiska utgångar, vilket återspeglar differentiella tillstånd av ILC-delmängdsanrikning i slemhinnan. ILC1-livskraften är väl bibehållen i kulturen, och befolkningen kommer att genomgå en mild expansion, med ~ 500 ILC1 och 100 tunntarmsorganoider (SIO) som genomgår en 2-3-faldig expansion i genomsnitt. Detta utbyte kommer dock att påverkas av ytterligare behandlingar, där TGF-neutralisering förbättras och p38-hämning minskar det absoluta antalet ILC1 efter samkultur8. Varje oväntad förlust av mer än 50 % av de sådda ILC1-numren kan vara resultatet av antingen ett obalanserat förhållande mellan ILC1 och SIO (ökning av antalet sådda krypter), SIO-kontaminering (se till att antibiotikacocktail fungerar och testa supernatanten för mykoplasma) eller av kvalitetsproblem i cytokinlagren, där ILC1 är särskilt känslig för brist på IL-2 eller IL-15. Samodlingssupernatanter från koncentrerade 96- eller 48-brunnsplattor har framgångsrikt använts för ELISA. Vid dissociering av samkulturer rekommenderas att inkubera celler med DNase efter en 20 minuters mild trypsinersättning eller utföra EDTA-baserad dissociation till enskilda celler för att förhindra cellklumpning från skadade epitelceller.

En styrka med detta protokoll är att det balanserar reduktionistiska odlingsförhållanden med komplexa celltyper. Beteendet hos andra ILC-delmängder i dessa kulturer kan dock vara beroende av faktorer som inte finns i just detta protokoll. Till exempel, i Lindemans protokoll som används för ILC3-samkulturer, kompletterades IL-23 dessutom till samkulturmedia för att stödja ILC3-underhåll och aktivering8. IL-15 befanns vara särskilt viktigt vid upprätthållandet av ILC1 i det samodlingssystem som beskrivs i detta protokoll, vilket var kongruent med tidigare rapporter om ILC1 som krävde detta cytokin för homeostas, men inte utveckling6. För att aktivera ILC, eller för att upprätthålla ILC2, kan tillväxtmediet kräva ytterligare optimering. Dessutom reglerar andra cellulära fack i tarmen, bortsett från epitelet, ILC. Till exempel är tarmneuroner kända för att modulera ILC2s delvis genom aktiviteten hos utsöndrade neuropeptider37. Mikrobiella faktorer påverkar också ILC-fenotyp38. Denna begränsning kan övervinnas genom tillsats av dessa element, t.ex. cytokiner, peptider eller mikrobiella faktorer, i samodlingssystemet. Detta kan till och med möjliggöra förhör av interaktionen mellan ILC och flera cellulära fack i en reduktionistisk miljö. Enligt denna logik är det viktigt att antibiotiska / anti-mykotiska reagenser tillsätts och ofta fylls på organoidmedier innan samkulturer etableras. Det är också viktigt att alla kulturer utförs i aseptiska miljöer eftersom eventuell odlingskontaminering (t.ex. svamptillväxt eller mykoplasma) sannolikt skulle aktivera antigenet icke-specifika ILC, vilket skapar betydande fenotyper som kanske inte finns i icke-förorenade kulturer. Av denna anledning rekommenderas inte uttag av antibiotiska /-mykotiska reagenser, inte ens i samkulturerna, eftersom de inte befanns orsaka negativ inverkan på epitelet eller ILC.

Denna metod ger ett unikt sätt att karakterisera signalmoduler mellan ILC och tarmepitelet, vilket gör det möjligt att undersöka biologin hos båda facken. I jämförelse med andra in vitro-metoder som består av en enda celltyp är det system som presenteras här mer jämförbart med in vivo-fysiologi och gör det möjligt att förhöra flera potentiella signalmekanismer mellan epitelceller och ILC. Andra metoder för in vitro ILC-odling är huvudsakligen beroende av stromamatarcellinjer, såsom OP9 eller OP9-DL139. Denna linje härrör från nyfödd muskalvaria, som inte är representativ för tarmmiljön. Även om dessa hittills har tillhandahållit guldstandarden för att upprätthålla ILC in vitro , lider de av betydande begränsningar i sin tillämpning för att förstå effekterna av ILC på epitelet.

Samodlingsprotokollet som beskrivs här mellan murina tunntarmsorganoider och lamina propria-härledda ILC har betydande forskningstillämpningar. Detta system av samkultur har redan använts för att bestämma rollen av ILC1-härledda TGF-β i expansionen av CD44 + epitelkrypter8, vilket bidrar till förståelsen av epiteldynamik vid inflammatorisk tarmsjukdom. Dessa studier bidrar till en ökande litteratur som ligger till grund för den kritiska betydelsen av epitel-ILC-signalering vid intestinal homeostas och inflammation3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

E.R. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. erkänner ett Ph.D. stipendium från Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). DC erkänner en doktorsexamen från NIHR GSTT BRC. J.F.N. erkänner ett Marie Skłodowska-Curie Fellowship, ett King's Prize-stipendium, ett RCUK/UKRI Rutherford Fund-stipendium (MR/R024812/1) och ett Seed Award in Science från Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi tackar också BRC-flödescytometrikärnteamet baserat på Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermöss var en generös gåva från G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). CD45.1 C57BL/6 möss gavs vänligt av T. Lawrence (King's College London, London) och P. Barral (King's College London, London).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 181
Samodling av murina tunntarmsepitelorganoider med medfödda lymfoida celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter