Summary
أجرينا حقنة تتبع الخلايا المحبة للدهون من نقطة واحدة لتتبع الخلايا البطانية ، تليها بضع الشرايين وخياطة تمدد الأوعية الدموية في الجدار الجانبي على الشريان الأورطي للفئران البطنية. بدا أن تكوين Neointima يعتمد على الشريان الأم في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا وتم تعزيزه من خلال التوظيف من خلايا جدار تمدد الأوعية الدموية في الجدران الحيوية الغنية بالخلايا.
Abstract
يخلق القطع الجراحي المجهري حاجزا لاحقا لتدفق الدم إلى تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة ، في حين يعتمد العلاج داخل الأوعية الدموية على تكوين النيوينتيما والجلطة. لا يزال مصدر الخلايا البطانية التي تغطي الطبقة الداخلية من neointima غير واضح. لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في أصل الخلايا المكونة للنيوينتيما بعد حقن تتبع الخلايا في نموذج تمدد الأوعية الدموية الجانبي المجهري للفئران في هلسنكي الراسخ بالفعل.
تم إنشاء تمدد الأوعية الدموية على الجدار الجانبي عن طريق خياطة أكياس شريانية ثنائية أو حيوية من طرف إلى آخر في ذكور الفئران لويس. قبل استئصال الشرايين مع خياطة تمدد الأوعية الدموية ، تم إجراء حقن تتبع الخلايا التي تحتوي على صبغة CM-Dil في الشريان الأورطي المثبت لتسمية الخلايا البطانية في الوعاء المجاور وتتبع انتشارها أثناء المتابعة (FU). العلاج يليه اللف (n = 16) أو الدعامات (n = 15). في FU (7 أيام أو 21 يوما) ، خضعت جميع الفئران لتصوير الأوعية الدموية الفلوري ، تليها حصاد تمدد الأوعية الدموية والتقييم العياني والنسيجي مع تعداد الخلايا المناعية النسيجية لمناطق محددة من الاهتمام.
لم يتمزق أي من تمدد الأوعية الدموية ال 31 عند المتابعة. ماتت أربعة قبل الأوان. لوحظ التروية المتبقية عيانية في 75.0٪ ملفوفة و 7.0٪ من الفئران الدعامات. كانت كمية الخلايا الإيجابية لتتبع الخلايا مرتفعة بشكل كبير في الدعامات غير الخلوية مقارنة بتمدد الأوعية الدموية الملفوف فيما يتعلق بالجلطة في اليوم 7 (p = 0.01) و neointima في اليوم 21 (p = 0.04). لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في الجلطة أو neointima في تمدد الأوعية الدموية الحيوية.
تؤكد هذه النتائج أنماط شفاء أسوأ في الملفات مقارنة بتمدد الأوعية الدموية الدعامات. يبدو أن تكوين Neointima يعتمد بشكل خاص على الشريان الأم في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا ، في حين أنه مدعوم بالتجنيد من خلايا جدار تمدد الأوعية الدموية في الجدران الحيوية الغنية بالخلايا. من حيث الترجمة، قد يكون العلاج بالدعامات أكثر ملاءمة لتمدد الأوعية الدموية شديد التدهور، في حين أن اللف وحده قد يكون كافيا لتمدد الأوعية الدموية مع جدران الأوعية الدموية الصحية في الغالب.
Introduction
نزيف تحت العنكبوتية الناجم عن تمزق تمدد الأوعية الدموية داخل الجمجمة (IA) هو حالة جراحية عصبية مدمرة مرتبطة بارتفاع معدلات المراضة والوفيات1،2،3،4. بالإضافة إلى قصاصات الجراحة المجهرية ، التي توفر اتصالا مباشرا من البطانة إلى البطانة ، اكتسبت الأجهزة داخل الأوعية الدموية أهمية متزايدة على مدى العقود الماضية لعلاج IAs الممزقة والمكتشفة بالصدفة. تعتمد استجابة الشفاء في IAs المعالجة داخل الأوعية الدموية بشكل أساسي على تكوين neointima وتنظيم الجلطة. كلاهما عمليتان تآزريتان ، اعتمادا على هجرة الخلايا من الوعاء المجاور وجدار تمدد الأوعية الدموية. 5 حتى الآن ، لا يزال أصل الخلايا البطانية في تكوين neointima من تمدد الأوعية الدموية المعالجة داخل الأوعية الدموية غير واضح. هناك نقاش مستمر في الأدبيات حول المصدر الذي يتم من خلاله تجنيد الخلايا المكونة للنيوينتيما.
باستخدام حقن تتبع الخلايا من صبغة CM-Dil (انظر جدول المواد) في الشريان الأورطي البطني للفئران ، كنا نهدف إلى تحليل دور الخلايا البطانية ، التي تنشأ في الشريان الأم ، في تكوين neointima في نقطتين زمنيتين مختلفتين FU (اليوم 7 واليوم 21) (الشكل 1). ميزة النموذج هي حضانة تتبع الخلايا المحلية المباشرة في الجسم الحي في الشريان الأم قبل خياطة تمدد الأوعية الدموية ، مما يسمح ب FU في نقاط زمنية لاحقة. لم يتم وصف تقنيات الحقن في الجسم الحي ، مثل حضانة تتبع الخلايا ، في الأدبيات. ميزة هذه التقنية هي الحقن المباشر ، من نقطة واحدة ، أثناء العملية الجراحية ، في الجسم الحي ، مما يجعل النموذج قويا وقابلا للتكرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ الدعم البيطري وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تمت الموافقة على التجارب من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية ، سويسرا (BE 60/19). تم اتباع إرشادات REACH ومبادئ 3R بدقة 6,7. تم تضمين واحد وثلاثين من ذكور فئران لويس ، يبلغ عمرها 12 أسبوعا وتزن 492 ± 8 جم. إيواء جميع الفئران في درجة حرارة الغرفة 23 درجة مئوية ودورة الضوء / الظلام 12 ساعة. توفير حرية الوصول إلى المياه والكريات. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار Wilcoxon-Mann-Whitney U غير البارامتري. واعتبرت القيم الاحتمالية (p) ≤ 0.05 و/أو ≤ 0.01 ذات أهمية.
1. مرحلة التحضير العام قبل الجراحة وجوانب التخدير
- قم بتوزيع الفئران عشوائيا إما إلى مجموعات معالجة لفائف أو دعامات (الشكل 2) عبر نظام عشوائي قائم على الويب. الآن ، قم بإجراء فحص سريري قبل الجراحة لجميع الحيوانات المخطط لها للجراحة بجوار غرفة عمليات هادئة ومعقمة تحافظ على درجة حرارة الغرفة من 23 ± 3 درجات مئوية. تحليل سلوك الحيوانات وفحص الأغشية المخاطية والتورجور كجزء من الفحص السريري قبل الجراحة.
- سجل وزن كل.
- قبل الجراحة ، احتضن الحقائب الشريانية من الفئران المانحة في 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم لمدة 10 ساعات عند 37 درجة مئوية للحصول على تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا8. اجمع هذه الحقائب من الحيوانات المانحة قبل أيام قليلة من الجراحة.
- تحضير الطول الكامل للشريان الأورطي البطني باستخدام مقص مجهري وملقط وتطبيق 6-0 أربطة غير قابلة للامتصاص بفاصل زمني يتراوح بين 3-4 مم.
- توليد تمدد الأوعية الدموية الحيوية مباشرة أثناء العملية الجراحية عن طريق كيس الأوعية الشريانية المربوطة مسبقا من الجزء الصدري من مانح9. قم بإجراء بضع الصدر باستخدام المقص والملقط الجراحي في النقطة الزمنية FU المشار إليها وقم بربط حقيبة الوعاء بالطول المطلوب.
- زرع الحقيبة مباشرة في المتلقي وحصاد تمدد الأوعية الدموية من الحيوان المتبرع لمزيد من التحليل العياني والمعالجة النسيجية.
- لتحريض التخدير ، ضع جميع الفئران في صندوق نظيف مزود بالأكسجين (O2) حتى فقدان الوعي بعد 5-10 دقائق. تخدير الفئران عن طريق حقن تحت الجلد (SC) من خليط من الفنتانيل 0.005 ملغم / كغم ، ميديتوميدين 0.15 ملغ / كغ ، وميدازولام 2 ملغ / كغ.
ملاحظة: هذا يضمن طائرة جراحية لا تقل عن 45 دقيقة. - تحقق من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس سحب الدواسة.
- ضع الفئران في وضع ضعيف واحلق الجزء الصدري البطني باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
- تثبيت الكفوف 4 من الفئران مع شريط على لوحة ، مغطاة بوسادة التدفئة المتصلة بمسبار المستقيم ذاتي التنظيم. أدخل مسبار المستقيم في فتحة الشرج للفئران للحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة البالغة 37 درجة مئوية بمساعدة وسادة التدفئة.
- الآن ، قم بتثبيت مستشعر على الساق الخلفية اليمنى متصلا بنظام محوسب للتحقق من العلامات الحيوية أثناء الجراحة.
- قم بتغطية أنف الفئران وفمها بقناع الوجه. إذا كنت تتطلب تخديرا مطولا ، فابدأ الأيزوفلوران (1.0-2.0٪ معايرة للتأثير في 100٪ O2).
- تطهير المجال الجراحي باستخدام البوفيدون اليود أو المطهرات المتناوبة ولف المجال الجراحي بطريقة معقمة.
- للعناية بالفترة المحيطة بالتخدير، ضع مادة تشحيم عيون معقمة على العينين وقم بتغطيتها بقناع رقائق غير شفاف لمنع الجفاف والتلف الناتج عن المصباح الجراحي.
- طوال الجراحة ، قم بتوفير الأكسجين باستمرار عبر قناع الوجه ، ومراقبة درجة حرارة الجسم ، وتوفير الحرارة باستخدام وسادة التدفئة ، والحفاظ على normothermia.
- راقب العلامات الحيوية الأخرى باستمرار (انتفاخ النبض والتنفس، ومعدل ضربات القلب والتنفس، وتشبع الأكسجين).
2. المرحلة الجراحية - حقن تتبع الخلايا
ملاحظة: يتم وصف النهج الجراحي المفصل في نموذج تمدد الأوعية الدموية الجانبي المجهري للفئران في هلسنكينموذج 9 وتقنيات زرع الملف والدعامات في مكان آخر8،10،11.
- قم بتخزين متتبع الخلايا الفلورية المحبة للدهون في ≤ -20 درجة مئوية طوال الوقت ، محميا من الضوء.
- قم بإجراء الجراحة عن طريق إعداد الشريان الأورطي للفئران والوريد التجويف ، يليه فصل كليهما ، بالإضافة إلى التثبيت المؤقت القريب والبعيد للشريان الأورطي.
ملاحظة: تم وصف هذه التقنية سابقا9.- قم بتثبيت الأجزاء القريبة والبعيدة من الشريان الأورطي بمقطعين مؤقتين من تيتان.
- ضع مسحة صغيرة واحدة مع حشوة أرجوانية لكل منها تحت الأجزاء القريبة والبعيدة من الشريان الأورطي للحصول على تصور أفضل للشريان.
- الآن ، حماية البطن مع الشاش الرطب.
- في يوم العملية ، قم بإذابة 2 ميكرولتر من مقتفي الخلايا عن طريق سحب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- انقل الخليط إلى حقنة سعة 1 مل مزودة بقنية معقمة 27-1/2 جم (0.4 × 13 مم).
ملاحظة: احرص على تجنب التعرض للضوء أثناء تنفيذ الخطوتين 2.5 و2.6. - أطفئ الضوء في غرفة العمليات. أثناء النظر تحت المجهر ، قم بإجراء الحقن من نقطة واحدة في الجزء البطني الأوسط من الشريان الأورطي باستخدام ملقط دقيق وحقن 1 مل بعناية من محلول ملحي هيبارين بنسبة 0.9٪.
- حقن متتبع الخلايا بعناية (فيديو 1) وقم بإيقاف تشغيل المجهر التشغيلي على الفور أيضا. مرة أخرى ، حماية البطن مع الشاش الرطب.
- دع الصبغة تحضن لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد فترة الحضانة ، قم بتشغيل المجهر وأضواء غرفة العمليات.
- إجراء بضع الشرايين الطولي وخياطة تمدد الأوعية الدموية ، كما هو موضح في مكان آخر11.
- استخدم الملقط الدقيق والمقص الدقيق لإجراء بضع الشرايين بحيث يبلغ طوله متوسط قطر تمدد الأوعية الدموية الذي تم حصاده (الخطوة 1.3). لضمان الطول الصحيح، ضع تمدد الأوعية الدموية بجانب الشريان الأورطي قبل إجراء بضع الشرايين. قم بخياطة تمدد الأوعية الدموية باستخدام 8-10 غرز مفردة باستخدام خياطة 10-0 غير قابلة للامتصاص ، وقم بإزالة المشابك المؤقتة بعناية - التي تبدأ بعيدا - تحت الري المستمر باستخدام محلول ملحي هيبارين. أغلق الجرح بطريقة طبقات. من الجدير بالذكر ، استخدم كثافة تعبئة لفائف تبلغ 1 سم.
ملاحظة: تم وصف تقنية زرع اللفائف أو الدعامات في مكان آخر 8,10.
- استخدم الملقط الدقيق والمقص الدقيق لإجراء بضع الشرايين بحيث يبلغ طوله متوسط قطر تمدد الأوعية الدموية الذي تم حصاده (الخطوة 1.3). لضمان الطول الصحيح، ضع تمدد الأوعية الدموية بجانب الشريان الأورطي قبل إجراء بضع الشرايين. قم بخياطة تمدد الأوعية الدموية باستخدام 8-10 غرز مفردة باستخدام خياطة 10-0 غير قابلة للامتصاص ، وقم بإزالة المشابك المؤقتة بعناية - التي تبدأ بعيدا - تحت الري المستمر باستخدام محلول ملحي هيبارين. أغلق الجرح بطريقة طبقات. من الجدير بالذكر ، استخدم كثافة تعبئة لفائف تبلغ 1 سم.
3. مراقبة المرحلة بعد العملية الجراحية والرعاية الأنثالية
- في نهاية الجراحة ، عكس التخدير بمزيج حقن SC من البوبرينورفين 0.05 مجم / كجم ، أتيباميزول 0.75 مجم / كجم ، و flumazenil 0.2 مجم / كجم. دع كل يعمل يتعافى في قفص نظيف حتى يستيقظ تماما ويدفئ ، حسب الحاجة ، باستخدام مصباح تدفئة.
- لمدة 3 أيام ، قم بإعطاء 1 ملغم / كغم ميلوكسيكام (حقنة واحدة أو تطبيق عن طريق الفم يوميا) والبوبرينورفين (0.05 مجم / كجم أربع مرات كل يوم) SC. بين عشية وضحاها ، قم بتزويد البوبرينورفين باستمرار في مياه الشرب بنفس الجرعات: 6 مل من البوبرينورفين 0.3 مجم / مل ، 360 مل من مياه الشرب ، 10 مل من الجلوكوز بنسبة 5٪.
- في مرحلة ما بعد الجراحة مباشرة ، ضع كل في قفص واحد للحماية. أعد تجميع الحيوانات بعد 24 ساعة.
- إذا أظهر أي فأر سلوكا مضطربا أو عدوانيا بعد حقن SC ، فقم بإعطاء البوبرينورفين في مياه الشرب خلال النهار.
- توفير تغذية ناعمة على أرضية القفص لدعم التغذية والانتعاش بعد العملية الجراحية.
- مراقبة ورعاية جميع الحيوانات وفقا لورقة درجة الرفاهية والألم.
- إدارة مسكن الإنقاذ SC (ميلوكسيكام 1 مغ / كغ و 0.05 مغ / كغ بوبرينورفين) عند الحاجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأدرج ما مجموعه 31 حيوانا في بيئة المختبر: 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل الإحصائي النهائي؛ و 27 فأرا في التحليل ال توفي 4 فئران قبل الأوان (معدل وفيات 12.9٪). أثناء العملية الجراحية ، انخفض انتفاخ التنفس بشكل كبير (p = 0.03) في الدعامات - (12.9 ميكرومتر ± 0.7) مقارنة بالفئران المعالجة باللفائف (13.5 ميكرومتر ± 0.6). تم إجراء تصوير الأوعية الفلوري لكل فأر في نهاية FU. تمت الإشارة إلى إعادة التروية في جميع الحيوانات ال 6 المعالجة باللفائف ، في حين لوحظ إعادة التروية في 12.5٪ فقط من الحيوانات ال 8 المعالجة بالدعامات.
لم تختلف أحجام تمدد الأوعية الدموية الأساسية المجمعة لليوم 7 واليوم 21 اختلافا كبيرا (لا بالنسبة لتمدد الأوعية الدموية المزيل للخلايا (p = 0.9) ولا الحيوية (p = 0.1) تمدد الأوعية الدموية) بين مجموعات علاج الملف أو الدعامات (الشكل 3). أظهرت أحجام FU المجمعة لتمدد الأوعية الدموية غير الخلوي نموا غير كبير في تمدد الأوعية الدموية الملفوف مقارنة بتمدد الأوعية الدموية العمودي (p = 0.28) ، أكبر بكثير في الملف الحيوي من المجموعة الدعامات (60.1 مم 3 ± 31.1 مم 3 مقابل 20.5 مم 3 ± 20.6 مم 3 ؛ p = 0.002).
لم تختلف كميات الخلايا الإيجابية المقتفية للخلايا في neointima من تمدد الأوعية الدموية المنزوعة الخلايا اختلافا كبيرا بين المجموعات المعالجة بالدعامات أو الملفات في اليوم 7 FU (p = 0.8) ولكنها كانت أعلى بكثير في الفئران ذات الدعامات في اليوم 21 FU (الشكل 4; p = 0.04). في الفئران الحيوية التي تم خياطة تمدد الأوعية الدموية ، لم تلاحظ أي اختلافات كبيرة في 7 أيام (p = 1.0) أو 21 يوما (الشكل 5) FU (p = 0.66). في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا في 7 أيام FU ، بقيت خلايا إيجابية تتبع الخلايا بشكل ملحوظ في خثرة الدعامة المعالجة مقارنة بالمجموعة المعالجة باللفائف (p = 0.01). لم يلاحظ هذا الاختلاف في تمدد الأوعية الدموية الحيوية في 7 أيام FU. انظر الجدول 1 للاطلاع على نسبة الخلايا الإيجابية المتتبعة للخلايا لتمدد الأوعية الدموية الملفوف والدعامات الحيوية لليوم 7 واليوم 21 FU. تم إجراء تلطيخ مضاد لعامل فون ويلبراند (F8) في الخلايا البطانية للنيوينتيما لكل فأر (الشكل 6).
كان متوسط مدة العملية الجراحية 119.1 ± 21.3 دقيقة لمجموعة اللف مقارنة ب 154.1 ± 30.2 دقيقة لمجموعة الدعامات (p = 0.001). كما اختلف عدد غرز تمدد الأوعية الدموية اختلافا كبيرا (p = 0.000002) للفائف (15.6 ± 2.9 غرز) ومجموعات الدعامات (11.3 ± 1.1).
الشكل 1: مخطط انسيابي للإعداد التجريبي. تم تشغيل ما مجموعه 35 حيوانا وتوزيعها عشوائيا على مجموعات اللف أو الدعامات. توفي حيوانان من مجموعة الدعامة في دورة ما بعد الجراحة مباشرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور فوتوغرافية أثناء العملية الجراحية لتمدد الأوعية الدموية أثناء انصمام الملف والدعامات. (A) تصور تمدد الأوعية الدموية الجانبي (#) ، مخيط على الشريان الأورطي للفئران البطنية (*). لاحظ جهاز الملف الذي تم إدخاله في تمدد الأوعية الدموية قبل إجراء آخر غرزة واحدة لإكمال خياطة تمدد الأوعية الدموية. لاحظ التلطيخ الوردي (السهم) على الجانب الأيسر من بضع الشرايين ، مما يشير إلى التوزيع الصحيح لمقتفي الخلايا. (B) نفس الإعداد كما في A، يظهر جهاز الدعامة الموجود بالفعل في الموقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياسات ما بعد الوفاة العيانية في 31 حيوانا. تم توثيق أحجام تمدد الأوعية الدموية (مم3) قبل الزرع وعند المتابعة ، ممثلة على طول المحور y. (أ) خط الأساس (منزوع الخلايا)، (ب) المتابعة (منزوع الخلايا)، (ج) خط الأساس (حيوي)، (دال) المتابعة (حيوي). يتم تجميع بيانات اليوم 7 واليوم 21. ** ص < 0.01. يتم التعبير عن القيم كوسيطات ذات نطاقات ربع سنوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صورة مثالية لتمدد الأوعية الدموية المزيل للخلايا المعالج بالدعامات في اليوم 21. على اليمين ، يتم عرض نظرة عامة على صورة مضاد وحيد النسيلة مضاد α-SMA ، تمدد الأوعية الدموية المستنفد للخلايا (تكبير 2 ضعف) ؛ شريط المقياس = 150 ميكرومتر. اليسار ، معاكسة مع DAPI ؛ الخلايا الحمراء هي إيجابية تتبع الخلايا (A) في جدار تمدد الأوعية الدموية ، (B) في الجلطة ، (C) الخلايا الإيجابية الملطخة المتبقية ولكن الباهتة في neointima، و (D) في مجمع الأوعية المجاورة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A-D). سهم واحد يمثل جدار تمدد الأوعية الدموية ، سهم مزدوج الشريان الأم. الاختصارات: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; α-SMA = أكتين العضلات الملساء α. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صورة مثالية لتمدد الأوعية الدموية الحيوي المعالج باللفائف في اليوم 21. الجانب الأيمن ، يتم عرض نظرة عامة على صورة مضاد وحيد النسيلة مضاد α-SMA ، تمدد الأوعية الدموية الغني بالخلايا (تكبير 2 ضعف) ؛ شريط المقياس = 150 ميكرومتر. الجانب الأيسر ، ملطخة مع DAPI ؛ الخلايا الحمراء هي إيجابية تتبع الخلايا (A) في جدار تمدد الأوعية الدموية ، (B) في الجلطة ، (C) خلايا إيجابية متعددة في neointima، و (D) في مجمع الأوعية المجاورة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A-D). سهم واحد يمثل جدار تمدد الأوعية الدموية ، سهم مزدوج الشريان الأم. الاختصارات: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; α-SMA = أكتين العضلات الملساء α. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تكبير 40 ضعفا من تلطيخ F8 . # يصور تكوين الجلطة ، * النيوينتيما ، و § الجانب الداخلي أسفل فتحة تمدد الأوعية الدموية. لاحظ الطبقات البطانية الموضحة على شكل تلطيخ أرجواني في الطبقة الداخلية من النيوتينيما. شريط المقياس = 175 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| DAPI / CM-ديل صبغة (٪) | لف | الدعامه | |||
| اليوم 7 | اليوم 21 | اليوم 7 | اليوم 21 | ||
| الحقائب الخالية من الخلايا | نيوينتيما | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| الشريان الأموي | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| خثره | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| جدار تمدد الأوعية الدموية | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| الحقائب الحيوية | نيوينتيما | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| الشريان الأموي | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| خثره | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| جدار تمدد الأوعية الدموية | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
الجدول 1: نسبة الخلايا الإيجابية المتتبعة للخلايا في النيوينتيما والشريان الأم والجلطة وجدار تمدد الأوعية الدموية. يتم تصوير القيم كنسب مئوية للحقائب الخالية من الخلايا والحيوية لعلاج الملفات والدعامات لليوم 7 واليوم 21. اختصار: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole.
فيديو 1: حقن تتبع الخلايا في الجزء البطني من الشريان الأورطي للفئران. يتم تنفيذ هذه التقنية باستخدام حقن من نقطة واحدة في الشريان الأورطي للفئران المشدودة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه الدراسة أن تكوين neointima يتم بوساطة الخلايا البطانية التي تنشأ في الشريان الأم لمجمع تمدد الأوعية الدموية ولكن يتم دعمها من خلال توظيف الخلايا المشتقة من جدار تمدد الأوعية الدموية في تمدد الأوعية الدموية الحيوي. ومع ذلك ، فإن دور الخلايا السلفية المتداولة في شفاء تمدد الأوعية الدموية لا يزال مثيرا للجدل12,13. وإجمالا، أدرج في هذا التحقيق 31 من ذكور فئران لويس. توفي 4 فقط قبل الأوان (12.9٪ من الوفيات).
وعلى النقيض من القصاصات الجراحية، التي تعزز الاتصال اللاحق من البطانة إلى البطانية، يعتمد نجاح العلاج داخل الأوعية الدموية على الاستجابات البيولوجية المتأخرة. التقنيات المطورة حديثا ، مثل تحويل التدفق ، أو الأجهزة النشطة بيولوجيا داخل الأوعية الدموية ، أو العلاجات القائمة على الخلايا داخل اللمعان ، جديرة بالملاحظة فيما يتعلق بأجهزة العلاج داخل الأوعية الدموية14,15. في هذا السياق ، تظهر الأدلة أن نجاح العلاج في القضاء الناجح على تمدد الأوعية الدموية يرتبط بشكل إضافي بالاستجابة البيولوجية من جدار تمدد الأوعية الدموية نفسه5،16،17.
وقد أشارت الدراسات الحديثة إلى أن تنظيم الجلطة وتشكيل نيوينتيما هي عمليات متزامنة في شفاء تمدد الأوعية الدموية بعد العلاجات داخل الأوعية الدموية. تعتمد كلتا العمليتين المتورطتين في شفاء تمدد الأوعية الدموية على تحريك الخلايا من الوعاء المجاور لمجمع تمدد الأوعية الدموية وجدار تمدد الأوعية الدموية نفسه. علاوة على ذلك ، يتم تسهيل كلتا العمليتين من خلال وجود أجهزة داخل الأوعية الدموية مثل الملفات أو الدعامات. وكما أوضح غروتر وآخرون،5 فإن الخلايا المنظمة للخثرة مستمدة أساسا من الوعاء المجاور لكلا النوعين من أساليب العلاج داخل الأوعية الدموية. هنا ، يعتمد تكوين neointima في تمدد الأوعية الدموية المعالج باللفائف بشكل أساسي على هجرة الخلايا من جدار الوعاء ، في حين أن الوعاء المجاور كان بمثابة المتبرع الرئيسي في تمدد الأوعية الدموية المعالج بالدعامات.
يمكن ملاحظة وجود خيط مشترك في إنشاء وتوسيع الأسئلة البحثية باستخدام نموذج تمدد الأوعية الدموية الجانبي المجهري للفئران في هلسنكي على مر السنين. أولا ، تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا ، وبالتالي ، تمدد الأوعية الدموية المنحط أكثر عرضة للنمو والتمزق من تمدد الأوعية الدموية الحيوية الغنية بالخلايا9. علاوة على ذلك ، أظهر علاج الملف نجاحا أكبر في علاج تمدد الأوعية الدموية باستخدام الحقائب الحيوية مقارنة بالحقائب شديدة الانحطاط8. علاوة على ذلك ، وفرت زراعة الخلايا شفاء كافيا من تمدد الأوعية الدموية حتى في تمدد الأوعية الدموية المنحط للغاية14. بمقارنة الأجهزة المختلفة داخل الأوعية الدموية في نموذج تمدد الأوعية الدموية هذا ، كان علاج الدعامة متفوقا بشكل واضح على علاج الملف وحده11. وبالتالي ، مع تقدير أنماط تجنيد الخلايا المختلفة في تمدد الأوعية الدموية الملفوف والدعامات من الشريان الأم وجدار تمدد الأوعية الدموية5 ، تظل الأسئلة الرئيسية هي ما إذا كان تكوين neointima يتم تشغيله بشكل رئيسي بواسطة الخلايا البطانية من الشريان الأم ، أو الخلايا من جدار تمدد الأوعية الدموية ، أو حتى الخلايا السلفية المتداولة. النتائج الأخيرة حول الخلايا السلفية المنتشرة التي تؤدي إلى تكوين neointima مثيرة للجدل12،13،15،18.
تم تضمين الفئران الذكور فقط في هذه السلسلة لتجنب الآثار المربكة للإستروجين على نمو تمدد الأوعية الدموية ، وتشكيل الجلطة ، والتهاب الجدار ، كما ذكر سابقا19. بالإضافة إلى المراقبة المتطورة متعددة الوسائط مع تصوير الأوعية الدموية الفلوري20 ومراقبة العلامات الحيوية ، استخدمنا مقتفي خلايا محدد لتسمية الشريان الأم لتمييز الخلايا المشتقة من الخلايا المتداولة في مجرى الدم عن تلك المشتقة من الهجرة الحقيقية للخلايا المجاورة. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد تلاشي طفيف لشدة إشارة الخلايا البطانية مع مرور الوقت وانقسام الخلايا ، على الرغم من أن الدراسات أظهرت كثافة إشارة قوية للخلايا الليفية العضلية في هذه النقاط الزمنية (اليوم 7 واليوم 21)14. وأخيرا، استخدم نموذج تمدد الأوعية الدموية هذا ديناميكا الدم والعمليات البيولوجية اللاحقة، مثل معدل الجلطة التلقائية أو شفاء تمدد الأوعية الدموية، والتي تتأثر بشدة بكوكبة الجدار الجانبي لتمدد الأوعية الدموية21.
كما هو موضح في هذه النتائج ، لا يزال من الواضح أن الوعاء المجاور لمجمع تمدد الأوعية الدموية يعمل كمصدر مهم للخلايا في تشكيل neointima. تتماشى هذه النتائج بقوة مع النتائج التي نشرها مؤخرا Kallmes et al. ، والتي تبين أن سمك الدعامة هو أيضا محدد لتعيين الجدار في محولات التدفق ، وهو محرك مهم للبطانة الفعالة. هنا ، تقلل زيادة سمك الدعامة من احتمال سوء الوضع ، وتحسن الاتصال بجدار الشريان الأم ، وبالتالي ، تعمل على تحسين إعادة بناء الخلايا عبر الدعامات22. في الفئران المصابة بتمدد الأوعية الدموية المنزوعة الخلايا ، لوحظت كمية أعلى بكثير من الخلايا البطانية الإيجابية لتتبع الخلايا في المجموعة الدعامات في اليوم 21 مقارنة بالمجموعة الملفوفة في نفس النقطة الزمنية (الجدول 1).
يمكن أن يعزى هذا الاكتشاف إلى حقيقة أن الدعامات ، المطبقة في منطقة غنية بالخلايا من الشريان الأم حتى في تمدد الأوعية الدموية شديد الانحطاط ، تعمل كهياكل توجيهية لحركات الخلايا ، مما يسمح بالبطانة البطانية المستمرة للطبقة الداخلية من neointima وتوفير الشفاء التدريجي لتمدد الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة الدعامات واللفائف في اليوم 7 FU ، لوحظت كمية أعلى بكثير من الخلايا الإيجابية لتتبع الخلايا في خثرة الحيوانات ذات الدعامات مقارنة بالخلايا الملفوفة. لذلك ، فإن التفسير المعقول هو أن دعامات الدعامات تسهل بسهولة هجرة الخلايا من الوعاء المجاور في الجلطة. في تمدد الأوعية الدموية الحيوي الذي يقارن بين اللف والدعامات ، لا بالنسبة للنيوينتيما بعد 21 يوما ، ولا لتشكيل الجلطة في اليوم 7 ، لوحظت اختلافات كبيرة في الخلايا الإيجابية لتتبع الخلايا. تمشيا مع النتيجة السابقة5 ، يمكن أن يعزى ذلك إلى دعم تكوين neointima عن طريق تجنيد الخلايا في جدران الأوعية الصحية.
إن عدم وجود أي اختلافات كبيرة في كميات الخلايا الإيجابية لتتبع الخلايا في الجلطة بعد 21 يوما في تمدد الأوعية الدموية الملفوف والدوار الخلوي أو الحيوي هو أن neointima كانت مغلقة بالكامل تقريبا23. لذلك ، حتى عن طريق الدعامات ، لم تعد هجرة الخلايا إلى الجلطة ممكنة بعد الآن. تشمل النقاط الحرجة التي يجب مراعاتها أثناء إجراء عملية زرع الدعامة تمزقا محتملا للأوعية علاجية المنشأ أثناء تطبيق الدعامة أو تكوين تضيق حرج في منطقة بضع الشرايين ، مع تطور نقص تروية محتمل في الأطراف السفلية. لمنع نقص التروية، اختر موقع بضع الشرايين بجوار تشعب الوعاء لإدخال الدعامة الصغيرة بما يكفي لتجنب التضيق علاجي المنشأ بعد زرع الدعامة وخياطة بضع الشرايين. علاوة على ذلك ، قبل الإغلاق ، اغسل هذه المنطقة بالمحلول الملحي الهيباريني لتقليل النقل البعيد لأي صمة محتملة بسبب وجود أي مكون من مكونات الجلطة.
عادة ما تكون المواد المطلوبة لهذه الإجراءات كثيفة التكلفة ونادرة للغاية ، وتوافرها أمر بالغ الأهمية للشباب المقيمين في جراحة المخ والأعصاب24،25. ومع ذلك ، بالإضافة إلى ثروة المعلومات التي تم الحصول عليها من هذا النموذج ، فإن ممارسة هذه الجراحة ستساعد في تعزيز المهارات الجراحية.
في الختام ، تعتمد استجابة الشفاء البيولوجي لتمدد الأوعية الدموية المعالج داخل الأوعية الدموية في نموذج تمدد الأوعية الدموية المجهري للجدار الجانبي لفئران هلسنكي على هجرة الخلايا من مجمع الأوعية المجاورة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعمه من خلال تجنيد الخلايا من جدار تمدد الأوعية الدموية الحيوي والصحي. ومع ذلك ، في تمدد الأوعية الدموية المنزوع الخلايا ، وبالتالي ، المنحط للغاية ، يعد الشريان الغني بالخلايا الأم أهم مصدر للخلايا لتشكيل neointima، والذي يتم تسهيله بواسطة أجهزة الأوعية الدموية الداخلية ، مثل الدعامات ، التي تربط الأنسجة الغنية بالخلايا المجاورة بفتحة تمدد الأوعية الدموية. للمساعدة في ترجمة هذه النتيجة إلى إعدادات سريرية ، يمكن علاج تمدد الأوعية الدموية شديد الانحطاط عن طريق السقالات الموضوعة في مناطق الأوعية الصحية الغنية بالخلايا. قد يكون انصمام الملف وحده كافيا لتمدد الأوعية الدموية مع جدران الأوعية الدموية الصحية في الغالب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفون هم وحدهم المسؤولون عن تصميم وإجراء الدراسة المقدمة ولا يعلنون عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون أليساندرا بيرجادانو ، DVM ، دكتوراه ، على الإشراف المتفاني على صحة الحيوان على المدى الطويل. تم دعم هذا العمل من قبل صناديق البحوث التابعة لمجلس البحوث ، Kantonsspital Aarau ، Aarau ، سويسرا ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم SNF (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
