Summary
ביצענו זריקה חד-נקודתית, ליפופילית, לאיתור תאי אנדותל, ולאחר מכן טרשת עורקים ותפירה של מפרצות דופן הדופן באבי העורקים של חולדות הבטן. היווצרות ניאו-ינטימה נראתה תלויה בעורק האב במפרצות דה-תאיות וקודמה על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים.
Abstract
חיתוך מיקרו-כירורגי יוצר מחסום נוסף של זרימת הדם למפרצות תוך גולגולתיות, בעוד שהטיפול האנדווסקולרי מסתמך על ניאו-אינטימה והיווצרות פקקת. מקורם של תאי האנדותל המכסים את השכבה האנדולומינלית של הניאו-אינטימה עדיין אינו ברור. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לחקור את מקורם של תאים יוצרי ניאו-אינטימה לאחר הזרקת עוקבים אחר תאים במודל המפרצת המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי, שכבר היה מבוסס היטב.
מפרצות דופן הדופן נוצרו על ידי תפירה של שקיות עורקים נטולות תאים או חיוניות מקצה לקצה באבי העורקים בחולדות לואיס זכריות. לפני טרשת עורקים עם תפר מפרצת, בוצעה הזרקת מעקב אחר תאים המכילה צבע CM-Dil לתוך אבי העורקים המהודק כדי לתייג תאי אנדותל בכלי הסמוך ולעקוב אחר התפשטותם במהלך מעקב (FU). הטיפול ואחריו סליל (n = 16) או סטנטים (n = 15). ב-FU (7 ימים או 21 ימים), כל החולדות עברו אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, ואחריה קצירת מפרצת והערכה מקרוסקופית והיסטולוגית עם ספירת תאים אימונוהיסטולוגית לאזורי עניין ספציפיים.
אף אחת מ-31 המפרצות לא נקרעה במעקב. ארבע חיות מתו בטרם עת. זלוף שיורי מקרוסקופי נצפה ב-75.0% מפותלים וב-7.0% מהחולדות הסטנטיות. כמות התאים החיוביים למעקב אחר תאים עלתה באופן משמעותי בסטנטים דה-תאיים בהשוואה למפרצת מפותלת ביחס לפקקת ביום 7 (p = 0.01) וניאו-ינטימה ביום 21 (p = 0.04). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בפקקת או בניאינטימה במפרצות חיוניות.
ממצאים אלה מאשרים דפוסי ריפוי גרועים יותר במפרצות מפותלות בהשוואה למפרצות סטנטות. נראה כי היווצרות ניאו-ינטימה תלויה במיוחד בעורק האב במפרצות שעברו דה-תאיזציה, בעוד שהיא נתמכת על ידי גיוס מתאי דופן מפרצת בקירות חיוניים עשירים בתאים. במונחים של תרגום, טיפול בסטנט עשוי להיות מתאים יותר למפרצות מנוונות מאוד, בעוד שסליל לבדו עשוי להיות מתאים למפרצות עם דפנות כלי דם בריאות ברובן.
Introduction
דימום תת-עכבישי הנגרם על ידי קרע של מפרצת תוך גולגולתית (IA) הוא מצב נוירוכירורגי הרסני הקשור לתחלואה גבוהה ותמותה 1,2,3,4. בנוסף לחיתוך מיקרו-כירורגי, המספק מגע ישיר בין אנדותל לאנדותל, התקנים אנדווסקולריים זכו לחשיבות גוברת בעשורים האחרונים לטיפול ב-IAs שנקרעו והתגלו כבדרך אגב. תגובת הריפוי ב- IAs המטופלים באנדווסקולרית תלויה בעיקר בהיווצרות ניאו-ינטימה ובארגון פקקת. שניהם תהליכים סינרגטיים, בהתאם לנדידת התאים מכלי השיט הסמוך ולדופן המפרצת. 5 נכון להיום, מקורם של תאי אנדותל בהיווצרות ניאו-ינטימה של מפרצות אנדווסקולריות מטופלות עדיין אינו ברור. יש ויכוח מתמשך בספרות על המקור שממנו מגויסים תאים יוצרי ניאו-אינטימה.
על-ידי שימוש בזריקת מעקב תאים של צבע CM-Dil (ראו טבלת החומרים) באבי העורקים הבטני של חולדות, אנו שואפים לנתח את תפקידם של תאי האנדותל, שמקורם בעורק האב, ביצירת ניאו-אינטימה בשתי נקודות זמן FU שונות (יום 7 ויום 21) (איור 1). יתרון של המודל הוא הדגירה הישירה של עוקבי התאים in vivo בעורק אב לפני תפר המפרצת, המאפשרת FU בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקות הזרקת In vivo , כגון דגירה של תאי מעקב אחר תאים, לא תוארו בספרות. יתרון של טכניקה זו הוא ההזרקה הישירה, החד-פעמית, התוך-ניתוחית, in vivo , מה שהופך את המודל לחזק וניתן לשחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
התמיכה הווטרינרית בוצעה על פי הנחיות המוסד. הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית, שוויץ (BE 60/19). הנחיות ה-ARRIVE ועקרונות ה-3R נשמרו בקפדנותעל 6,7. 31 חולדות לואיס זכרים, בני 12 שבועות ומשקלם 492 ± 8 גרם, נכללו. ביתו את כל החולדות בטמפרטורת חדר של 23 מעלות צלזיוס ומחזור אור/חושך של 12 שעות. ספק גישה חופשית למים ולכדורים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן וילקוקסון-מאן-וויטני U הלא-פאראמטרי. ערכי הסתברות (p) של ≤ 0.05 ו/או ≤ 0.01 נחשבו משמעותיים.
1. הכנה כללית פאזה טרום ניתוחית והיבטים הרדמה
- חלקו את החולדות באופן אקראי לקבוצות טיפול בסלילים או בסטנטים (איור 2) באמצעות מערכת אקראיות מבוססת אינטרנט. כעת, בצע בדיקה קלינית טרום ניתוחית של כל בעלי החיים המתוכננים לניתוח ליד חדר ניתוח שקט, אספטי, תוך שמירה על טמפרטורת חדר של 23 ± 3 מעלות צלזיוס. לנתח את התנהגות בעלי החיים ולבדוק את הריריות והטורגור כחלק מהבדיקה הקלינית שלפני הניתוח.
- רשום את משקלו של כל בעל חיים.
- לפני הניתוח, הדגירה של שקיות העורקים מחולדות תורמות ב-0.1% נתרן דודציל סולפט למשך 10 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לקבל מפרצות דה-תאיות8. אספו את השקיות האלה מבעלי חיים תורמים כמה ימים לפני הניתוח.
- להכין את האורך המלא של אבי העורקים הבטני עם microscissors ומלקחת 6-0 ליגטורות שאינן ניתנות לספיגה במרווח של 3-4 מ"מ.
- ליצור באופן ישיר מפרצות חיוניות תוך ניתוחיות על ידי שקית כלי עורקים קשורה בעבר מהחלק החזי של בעל חיים תורם9. בצעו את בית החזה עם מספריים ומלקחיים כירורגיים בנקודת הזמן FU שצוינה ושחררו את נרתיק כלי השיט באורך הרצוי.
- השתילו ישירות את השקית במקבל וקטפו את המפרצת מבעל החיים התורם להמשך ניתוח מקרוסקופי ועיבוד היסטולוגי.
- להשראת הרדמה, הניחו את כל החולדות בקופסה נקייה המסופקת עם חמצן (O2) עד לאובדן הכרה לאחר 5-10 דקות. מרדימים חולדות עם הזרקה תת עורית (SC) של תערובת של פנטניל 0.005 מ"ג/ק"ג, מדטומידין 0.15 מ"ג/ק"ג ומידזולם 2 מ"ג/ק"ג.
הערה: זה מבטיח מטוס כירורגי של לפחות 45 דקות. - בדוק את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס הגמילה מהדוושה.
- מניחים את החולדות בתנוחת שכיבה ומגלחים את החלק של בית החזה באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
- קבעו את 4 כפותיהן של החולדות בנייר דבק על לוח, המכוסה על ידי כרית חימום המחוברת לבדיקה רקטלית המווסתת אוטומטית. הכנס את הבדיקה הרקטלית בפי הטבעת של החולדה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה של 37 °C (74 °F) בעזרת כרית החימום.
- כעת, התקינו חיישן ברגל האחורית הימנית המחובר למערכת ממוחשבת לבדיקת סימנים חיוניים תוך ניתוחי.
- כסו את אפה ופיה של החולדה במסכת פנים. אם אתם זקוקים להרדמה ממושכת, התחילו באיזופלורן (1.0-2.0% ב-100% O2).
- יש לחטא את השדה הכירורגי באמצעות פובידון-יוד או חומרי חיטוי מתחלפים ולעטוף את שדה הניתוח בצורה סטרילית.
- לטיפול פריאנסתטי, יש למרוח חומר סיכה אופתלמי סטרילי על העיניים ולכסות אותן במסכת נייר כסף אטומה כדי למנוע ייבוש ונזק מהמנורה הכירורגית.
- במהלך הניתוח, ספקו חמצן באופן רציף דרך מסכת הפנים, עקבו אחר טמפרטורת הגוף וספקו חום באמצעות כרית חימום, תוך שמירה על נורמותרמיה.
- עקוב אחר סימנים חיוניים אחרים באופן רציף (התנפחות דופק ונשימה, קצב לב ונשימה וריווי חמצן).
2. שלב ניתוחי - הזרקת מעקב תאים
הערה: הגישה הכירורגית המפורטת במפרצת הדופן המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי מודל9 והטכניקות להשתלת סליל וסטנטים מתוארות במקום אחר 8,10,11.
- אחסן את עוקב התאים הליפופיליים הפלואורסצנטיים בטמפרטורה של ≤ -20 מעלות צלזיוס כל הזמן, מוגן מפני אור.
- בצע את הניתוח על ידי הכנת אבי העורקים של החולדה וווריד החזיר, ולאחר מכן ההפרדה של שניהם, כמו גם הידוק זמני פרוקסימלי ודיסטלי של אבי העורקים.
הערה: טכניקה זו תוארה בעבר9.- הידקו את החלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של אבי העורקים באמצעות שני קליפים זמניים של טיטאן.
- שים מיקרוסוואב אחד עם ריפוד סגול כל אחד מתחת לחלקים הפרוקסימליים והדיסטליים של אבי העורקים להדמיה טובה יותר של העורק.
- עכשיו, להגן על הבטן עם גזה רטובה.
- ביום הניתוח, ממיסים 2 μL של עוקב התאים על ידי צנרת ב-1 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
- מעבירים את התערובת למזרק של 1 מ"ל המצויד בצינורית סטרילית בגודל 27-1/2 גרם (0.4 x 13 מ"מ).
הערה: היזהרו להימנע מחשיפה לאור בעת ביצוע שלבים 2.5 ו-2.6. - כבו את האור בחדר הניתוח. תוך כדי התבוננות מתחת למיקרוסקופ, בצעו את ההזרקה החד-פעמית בחלק הגחוני האמצעי של אבי העורקים באמצעות מיקרו-מלקחיים והזיקו בזהירות 1 מ"ל של תמיסת מלח של 0.9% הפריניזציה.
- הזריקו את עוקב התאים בזהירות (וידאו 1) וכבו מיד גם את המיקרוסקופ הפועל. שוב, להגן על הבטן עם גזה רטובה.
- תנו לצבע לדגום לפחות 15 דקות. לאחר תקופת הדגירה, הדליקו את אורות המיקרוסקופ וחדר הניתוח.
- לבצע את העורק האורכי ואת התפירה של המפרצת, כפי שתואר במקום אחר11.
- השתמש במיקרו-כוחפים ובמיקרו-חתכים כדי לבצע את העורקים כך שאורכו ממוצע את קוטר המפרצת שנקטפה (שלב 1.3). כדי להבטיח את האורך הנכון, הניחו את המפרצת לצד אבי העורקים לפני ביצוע טרשת עורקים. תפרו את המפרצת עם 8-10 תפרים בודדים באמצעות תפר 10-0 שאינו ניתן לספיגה, והסירו בזהירות את המהדקים הזמניים - המתחילים באופן דיסטלי - תחת השקיה רציפה עם מי מלח הפרין. סגרו את הפצע בצורה מרובדת. שימו לב, השתמשו בצפיפות אריזת סליל של 1 ס"מ.
הערה: הטכניקה של השתלת סליל או סטנטים תוארה במקום אחר 8,10.
- השתמש במיקרו-כוחפים ובמיקרו-חתכים כדי לבצע את העורקים כך שאורכו ממוצע את קוטר המפרצת שנקטפה (שלב 1.3). כדי להבטיח את האורך הנכון, הניחו את המפרצת לצד אבי העורקים לפני ביצוע טרשת עורקים. תפרו את המפרצת עם 8-10 תפרים בודדים באמצעות תפר 10-0 שאינו ניתן לספיגה, והסירו בזהירות את המהדקים הזמניים - המתחילים באופן דיסטלי - תחת השקיה רציפה עם מי מלח הפרין. סגרו את הפצע בצורה מרובדת. שימו לב, השתמשו בצפיפות אריזת סליל של 1 ס"מ.
3. ניטור פאזה לאחר הניתוח וטיפול בשיכוך כאבים
- בסוף הניתוח, הפכו את ההרדמה עם תערובת הזרקת SC של בופרנורפין 0.05 מ"ג/ק"ג, אטיפאמזול 0.75 מ"ג/ק"ג, ופלומאזניל 0.2 מ"ג/ק"ג. תנו לכל חיה המופעלת להתאושש בכלוב נקי עד שתהיה ערה לחלוטין וחמה, לפי הצורך, עם מנורת חימום.
- במשך 3 ימים, מתן 1 מ"ג /ק"ג meloxicam (זריקה אחת או מריחה דרך הפה ליום) ו buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג ארבע פעמים ביום) SC. לילה, לספק buprenorphine ברציפות במי השתייה עם אותו מינון: 6 מ"ל buprenorphine 0.3 מ"ג / מ"ל, 360 מ"ל מי שתייה, 10 מ"ל של גלוקוז 5%.
- בשלב המיידי שלאחר הניתוח, ישכנו כל בעל חיים בכלוב אחד להגנה. ארגנו מחדש את החיות לאחר 24 שעות.
- אם חולדה כלשהי מראה התנהגות מצוקה או אגרסיבית לאחר הזרקת SC, יש לתת בופרנורפין במי השתייה במהלך היום.
- ספקו הזנה רכה על רצפת הכלוב כדי לתמוך בהאכלה ובהתאוששות לאחר הניתוח.
- להתבונן ולטפל בכל בעלי החיים על פי גיליון הרווחה והכאב.
- נהלו משכך כאבים להצלה SC (מלוקסיקם 1 מ"ג/ק"ג ו-0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין) בעת הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בסך הכל נכללו 31 בעלי חיים בסביבת המעבדה: 27 חולדות נכללו בניתוח הסטטיסטי הסופי; 4 חולדות מתו בטרם עת (שיעור תמותה של 12.9%). באופן תוך ניתוחי, התנפחות הנשימה הופחתה באופן משמעותי (p = 0.03) בסטנטים (12.9 מיקרומטר ± 0.7) בהשוואה לחולדות שטופלו בסליל (13.5 מיקרומטר ± 0.6). אנגיוגרפיה פלואורסצנטית בוצעה עבור כל חולדה בסוף ה-FU הסופי. רפרפוזיה נצפתה בכל 6 בעלי החיים שטופלו בסלילים, ואילו רפרפוזיה נצפתה רק ב-12.5% מתוך 8 בעלי החיים שטופלו בסטנטים.
נפחי המפרצת הבסיסית במאגר ליום 7 וליום ה-21 לא היו שונים באופן משמעותי (לא עבור מפרצות שעברו דה-תאיזציה (p = 0.9) ולא חיוניות (p = 0.1) בין קבוצות הטיפול בסלילים או בסטנטים (איור 3). נפחי FU מרוכזים עבור מפרצות דה-תאיות הראו צמיחה לא משמעותית של מפרצת מפותלת במפרצות מפותלות בהשוואה למפרצות הסטנטליות (p = 0.28), גדול משמעותית במפצלת החיונית מאשר בקבוצת הסטנטים (60.1 מ"מ3 ± 31.1 מ"מ3 לעומת 20.5 מ"מ3 ± 20.6 מ"מ3; p = 0.002).
כמויות התאים החיוביים למעקב אחר תאים בניאו-אינטימה של מפרצות דה-תאיות לא היו שונות באופן משמעותי בין הקבוצות שטופלו בסטנטים או בסלילים ביום 7 FU (p = 0.8), אך היו גבוהות משמעותית בחולדות סטנטות ביום 21 FU (איור 4; p = 0.04). בחולדות חיוניות עם תפירת מפרצת, לא נצפו הבדלים משמעותיים ב-7 ימים (p = 1.0) או ב-21 ימים (איור 5) FU (p = 0.66). במפרצות שעברו דה-תאיזציה ב-7 ימי FU, נשארו הרבה יותר תאים חיוביים למעקב אחר תאים בפקקת של הסטנטים שטופלו בהשוואה לקבוצה שטופלה בסליל (p = 0.01). הבדל זה לא נצפה במפרצות חיוניות ב 7 ימים FU. ראה טבלה 1 עבור שיעור התאים החיוביים למעקב אחר תאים עבור דה-תאיזציה, כמו גם מפרצות מפותלות וסטנטליות חיוניות ליום 7 וליום 21 FU. צביעה נגדית עבור גורם פון וילברנד (F8) בוצעה בתאי האנדותל של הניאו-אינטימה של כל חולדה (איור 6).
משך הזמן הממוצע של ההליך הכירורגי היה 119.1 ± 21.3 דקות עבור קבוצת הסלילים לעומת 154.1 ± 30.2 דקות בקבוצת הסטנטים (p = 0.001). גם מספר התפרים לתפרים של מפרצת היה שונה באופן משמעותי (p = 0.000002) עבור הסליל (15.6 ± 2.9 תפרים) וקבוצות הסטנטים (11.3 ± 1.1).
איור 1: תרשים זרימה של הגדרת הניסוי. בסך הכל נותחו 35 בעלי חיים וחולקו באקראי לקבוצות סליל או סטנטים. שתי חיות מקבוצת הסטנטים מתו במהלך הניתוח המיידי שלאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תצלומים תוך ניתוחיים של מפרצות במהלך אמבוליזציה של סליל וסטנטים. (A) מתאר מפרצת דופן (#), הנתפרת על אבי העורקים של חולדה בבטן (*). שימו לב למכשיר הסליל שהוצג במפרצת לפני ביצוע התפר היחיד האחרון להשלמת תפר המפרצת. שימו לב לצביעה הוורדרדה (חץ) בצד שמאל של העורק, המציינת את ההתפלגות הנכונה של עוקב התאים. (B) אותה הגדרה כמו ב-A, המציגה את מכשיר הסטנטים שכבר נמצא באתרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מדידות מקרוסקופיות לאחר המוות ב-31 בעלי חיים. נפחי המפרצת (מ"מ3) תועדו לפני ההשתלה ובמעקב, המיוצגים לאורך ציר ה-y. (A) קו בסיס (דה-תאיזציה), (B) מעקב (דה-תאיזציה), (C) בסיס (חיוני), (D) מעקב (חיוני). הנתונים עבור היום ה-7 והיום ה-21 נאספים. ** עמ' < 0.01. ערכים מבוטאים כחציון עם טווחים בין-קוויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תמונה מופתית של מפרצת שעברה דה-תאיזציה שטופלה בסטנטים ביום ה-21. נכון, מוצגת סקירה כללית של תמונה של מפרצת חד-שבטית אנטי-SMA, מדולדלת של תאים (הגדלה של פי 2); סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. שמאלה, נגדית עם DAPI; תאים אדומים הם תאים חיוביים לעקוב אחר תאים (A) בדופן המפרצת, (B) בפקקת, (C) תאים מוכתמים שיורית אך דהויים עם עקבות תאים חיוביים בניאוינטימה, ו-(D) במתחם כלי הדם הסמוך. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-D). חץ יחיד מסמן את דופן המפרצת, חץ כפול את עורק האב. קיצורים: DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; α-SMA = אקטין שרירי חלק α. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונה מופתית של מפרצת חיונית שטופלה בסלילים ביום ה-21. בצד ימין, מוצגת סקירת תמונה של אנטי-SMA חד-שבטי, מפרצת עשירה בתאים (הגדלה של פי 2); סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. צד שמאל, נגדי עם DAPI; תאים אדומים הם תאים-עוקבים-חיוביים (A) בדופן המפרצת, (B) בפקקת, (C) תאים חיוביים מרובים בניאואינטימה, ו-(D) בקומפלקס כלי הדם הסמוך. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר (A-D). חץ יחיד מסמן את דופן המפרצת, חץ כפול את עורק האב. קיצורים: DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; α-SMA = אקטין שרירי חלק α. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: הגדלה של פי 40 מכתם F8. # מתאר את היווצרות הפקקת, * את הניאוינטימה, ו- § את הצד האנדולומינלי מתחת לפתח המפרצת. שימו לב לשכבות האנדותל המוצגות ככתמים סגולים בשכבה האנדולומינלית של הניאו-אינטימה. סרגל קנה מידה = 175 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| צבע DAPI/CM-דיל (%) | סליל | סטנט | |||
| יום 7 | יום 21 | יום 7 | יום 21 | ||
| שקיות נטולות תאים | נאואינטימה | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| עורק אב | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| פקקת | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| קיר מפרצת | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| שקיות חיוניות | נאואינטימה | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| עורק אב | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| פקקת | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| קיר מפרצת | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
טבלה 1: שיעור התאים החיוביים של עוקבי התאים בניאו-אינטימה, עורק האב, הפקקת וקיר המפרצת. הערכים מתוארים כאחוזים עבור שקיות דה-תאיות וחיוניות לטיפול בסלילים ובסטנטים ליום 7 וליום ה-21. קיצור: DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול.
וידאו 1: הזרקת מעקב תאים בחלק הבטן של אבי העורקים של החולדה. טכניקה זו מבוצעת באמצעות זריקה של נקודה אחת לתוך אבי העורקים של חולדה מהודקת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר זה מדגים כי היווצרות ניאו-אנטימה מתווכת באמצעות תאי אנדותל שמקורם בעורק האב של קומפלקס המפרצת, אך נתמכת על ידי גיוס תאים שמקורם בדופן המפרצת במפרצות חיוניות. עם זאת, תפקידם של תאי אב במחזור הדם בריפוי מפרצת נותר שנוי במחלוקת12,13. בסך הכל, 31 חולדות לואיס זכרים נכללו בחקירה זו; רק 4 מתו בטרם עת (12.9% תמותה).
בניגוד לגזירה כירורגית, המקדמת מגע בין אנדותל לאנדותל, הצלחת הטיפול האנדווסקולרי מסתמכת על תגובות ביולוגיות מושהות. טכניקות שפותחו לאחרונה, כגון הסטת זרימה, התקנים אנדווסקולריים ביו-אקטיביים או טיפולים מבוססי תאים אינטראלומינליים, ראויות לציון ביחס למכשירי טיפול אנדווסקולריים14,15. בהקשר זה, הראיות מראות כי הצלחת הטיפול במיגור מפרצת מוצלח קשורה באופן נוסף לתגובה הביולוגית מקיר המפרצתעצמו 5,16,17.
מחקרים אחרונים הציעו כי ארגון פקקת ויצירת ניאו-אינטימה הם תהליכים מקבילים בריפוי מפרצת לאחר טיפולים אנדווסקולריים. שני התהליכים המעורבים בריפוי מפרצת מסתמכים על תאים נעים מהכלי הסמוך של קומפלקס המפרצת ועל דופן המפרצת עצמה. יתר על כן, שני התהליכים מקלים על ידי נוכחות של התקנים endovascular כגון סלילים או סטנטים. כפי שהדגימו Grüter et al. ,5 תאים המארגנים פקקת נובעים בעיקר מכלי הדם הסמוך עבור שני סוגי הגישות לטיפול אנדווסקולרי. כאן, היווצרות neointima במפרצות שטופלו בסלילים מסתמכת בעיקר על נדידת תאים מדופן הכלי, בעוד שהכלי הסמוך שימש כתורם העיקרי במפרצות שטופלו בסטנטים.
לאורך השנים ניתן היה להבחין בחוט מקשר בקביעת והרחבת שאלות מחקר באמצעות מודל המפרצת של דופן הדופן המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי. ראשית, מפרצות נטולות תאים, ולכן גם מנוונות, מועדות יותר לצמיחה ולקרע מאשר מפרצות חיוניות עשירות בתאים9. יתר על כן, טיפול סליל הראה הצלחה רבה יותר בטיפול במפרצת עם שקיות חיוניות מאשר אלה מנוונות מאוד8. יתר על כן, השתלת תאים סיפקה ריפוי מפרצת מספק אפילו במפרצות מנוונות מאוד14. בהשוואה בין מכשירים אנדווסקולריים שונים במודל מפרצת זה, הטיפול בסטנטים היה עדיף בבירור על טיפול בסליל בלבד11. לפיכך, מתוך הערכה של מצבי גיוס התאים השונים במפרצות מפותלות ומצודדות מעורק האב ומקיר המפרצת5, השאלות העיקריות נותרו האם היווצרות ניאו-ינטימה מופעלת בעיקר על ידי תאי אנדותל מעורק האב, תאים מדופן המפרצת, או אפילו תאי אב מסתובבים. הממצאים האחרונים על תאי אב במחזור הדם המפעילים היווצרות ניאו-אינטימה שנויים במחלוקת 12,13,15,18.
רק חולדות זכרים נכללו בסדרה זו כדי למנוע את ההשפעות המבלבלות של אסטרוגן על צמיחת מפרצת, היווצרות פקקת ודלקת דופן, כפי שדווח בעבר19. בנוסף לניטור הרב-מודאלי המתוחכם עם אנגיוגרפיה פלואורסצנטית20 וניטור סימנים חיוניים, השתמשנו במעקב תאים ספציפי כדי לתייג את עורק האב כדי להבדיל בין תאים שמקורם בתאים במחזור הדם לבין אלה שמקורם בנדידה אמיתית של תאים שכנים. עם זאת, איננו יכולים לשלול דעיכה קלה של עוצמת האות של תאי האנדותל עם חלוקת זמן ותא, אם כי מחקרים הראו עוצמת אות חזקה של מיופיברובלסטים בנקודות זמן אלה (יום 7 ויום 21)14. לבסוף, מודל מפרצת זה השתמש בהמודינמיקה ובתהליכים ביולוגיים שבאו בעקבותיה, כגון קצב הפקקת הספונטנית או ריפוי מפרצת, המושפעים מאוד מקבוצת הכוכבים של הדופן הצדדית של המפרצת21.
כפי שהודגם בממצאים אלה, נותר ברור כי הכלי הסמוך של קומפלקס המפרצת משמש כמקור חשוב לתאים ביצירת ניאו-ינטימה. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו לאחרונה על ידי Kallmes et al., המראה כי עובי היתד הוא גם גורם מכריע של התפשטות הדופן במסיטי זרימה, המהווה גורם חשוב לאנדותליזציה יעילה. כאן, הגדלת עובי התמוכת מפחיתה את ההסתברות לתקלה, משפרת את המגע עם דופן עורק האב, ולכן מייעלת את שחזור התאים באמצעות תמוכות22. בחולדות עם מפרצות שעברו דה-תאיזציה, נצפתה כמות גבוהה יותר באופן משמעותי של תאי אנדותל חיוביים לתאים במעקב אחר תאים בקבוצת הסטנטים ביום ה-21 מאשר בקבוצה המפותלת באותה נקודת זמן (טבלה 1).
ניתן לייחס ממצא זה לעובדה שסטנטים, המיושמים באזור עשיר בתאים של עורק האב במפרצות מנוונות אפילו מאוד, משמשים כמבנים מנחים לתנועות תאים, ומאפשרים רירית אנדותל רציפה של השכבה האנדולומינלית של הניאו-ינטימה ומספקים ריפוי מפרצת מתקדם. בנוסף, בהשוואה בין סטנטים וסלילים ביום 7 FU, נצפתה כמות גבוהה יותר באופן משמעותי של תאים חיוביים למעקב אחר תאים בפקקת של בעלי חיים סטנטים מאשר בתאים מפותלים. לכן, הסבר סביר הוא שתמיכות סטנטים מאפשרות בקלות את נדידת התאים מהכלי הסמוך בפקקת. במפרצות חיוניות המשווה סליל לעומת סטנטים, לא עבור ניאו-אינטימה לאחר 21 יום, ולא עבור היווצרות פקקת ביום 7, נצפו הבדלים משמעותיים בתאים חיוביים למעקב אחר תאים. בהתאם לממצא קודם5, ניתן לייחס זאת לתמיכה בהיווצרות ניאו-ינטימה באמצעות גיוס תאים בקירות כלי בריאים.
היעדרם של הבדלים משמעותיים בכמויות התאים החיוביים לעוקבים אחר תאים בפקקת לאחר 21 יום במפרצות מפותלות או חיוניות מסוללות וסטוצות, נובע מכך שהניאואינטימה הייתה אטומה כמעט לחלוטין23. לכן, אפילו באמצעות סטנטים, נדידת תאים לתוך הפקקת אינה אפשרית יותר. נקודות קריטיות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע השתלת סטנט כוללות קרע אפשרי בכלי הדם האיטרוגני במהלך מריחת סטנט או היווצרות היצרות קריטית באזור העורקים, עם התפתחות איסכמיה פוטנציאלית בגפיים התחתונות. כדי למנוע איסכמיה, בחרו באתר העורקים שליד ביפורקציה של כלי הדם להחדרת הסטנט קטן מספיק כדי למנוע היצרות איטרוגנית לאחר השתלת סטנט וטרשת עורקי תפירה. יתר על כן, לפני הסגירה, לשטוף את האזור הזה עם מלח heparinized כדי למזער את ההובלה הדיסטלית של כל emboli פוטנציאלי בשל נוכחות של כל מרכיב טרומבוגני.
החומרים הנדרשים להליכים אלה הם בדרך כלל עתירי עלויות ונדירים ביותר, וזמינותם חיונית עבור תושבים צעירים בתחום הנוירוכירורגיה24,25. עם זאת, בנוסף לעושר המידע המתקבל ממודל זה, תרגול ניתוח זה יסייע לשפר את הכישורים הכירורגיים.
לסיכום, תגובת הריפוי הביולוגית של מפרצות שטופלו באנדווסקולרית במודל מפרצת הדופן המיקרו-כירורגית של חולדות הלסינקי תלויה בנדידת תאים ממתחם כלי הדם הסמוך. הוא נתמך גם על ידי גיוס תאים מקיר מפרצת חיוני ובריא. עם זאת, ב מפרצת דה-תאית, ולכן מנוונת מאוד, העורק העשיר בתאי האב הוא המקור החשוב ביותר לתאים להיווצרות ניאו-אינטימה, המתאפשרת על ידי מכשירים אנדווסקולריים, כגון סטנטים, המחברים את הרקמות העשירות בתאים הסמוכים לפתח המפרצת. כדי לסייע בתרגום ממצא זה למסגרות קליניות, ניתן היה לטפל במפרצות מנוונות מאוד באמצעות פיגומים הממוקמים באזורי כלי דם בריאים עשירים בתאים. אמבוליזציה של סליל לבדה עשויה להספיק למפרצות עם דפנות כלי דם בריאות ברובן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים הם האחראים הבלעדיים על העיצוב וההתנהלות של המחקר המוצג ומצהירים על היעדר אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לאלסנדרה ברגאדנו, DVM, PhD, על הפיקוח המסור על בריאות בעלי חיים לטווח ארוך. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות המחקר של מועצת המחקר, Kantonsspital Aarau, Aarau, שוויץ, וקרן המדע הלאומית השוויצרית SNF (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
