Summary
Мы выполнили одноточечную инъекцию липофильного индикатора клеток для отслеживания эндотелиальных клеток, после чего последовала артериотомия и наложение швов аневризм боковой стенки на брюшную аорту крыс. Образование неоинтимы, по-видимому, зависело от родительской артерии в децеллюляризованных аневризмах и стимулировалось набором из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки.
Abstract
Микрохирургическое обрезание создает последующий барьер кровотока в внутричерепные аневризмы, тогда как эндоваскулярное лечение опирается на образование неоинтимы и тромба. Источник эндотелиальных клеток, покрывающих эндолюминальный слой неоинтимы, остается неясным. Поэтому целью настоящего исследования было исследование происхождения неоинтимообразующих клеток после инъекции клеточного индикатора в уже хорошо зарекомендовавшей себя модели микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки.
Аневризмы боковых стенок были созданы путем наложения швов децеллюляризированных или жизненно важных артериальных мешочков из стороны в сторону к аорте у самцов крыс Льюиса. Перед артериотомией со швом аневризмы в зажатую аорту была выполнена инъекция клеточного индикатора, содержащая краситель CM-Dil, для маркировки эндотелиальных клеток в соседнем сосуде и отслеживания их пролиферации во время наблюдения (FU). Лечение с последующим намоткой (n = 16) или стентированием (n = 15). В FU (7 дней или 21 день) все крысы прошли флуоресцентную ангиографию с последующим сбором аневризмы и макроскопической и гистологической оценкой с иммуногистологическим количеством клеток для конкретных областей, представляющих интерес.
Ни одна из 31 аневризмы не разорвалась при последующем наблюдении. Четыре животных умерли преждевременно. Макроскопически остаточная перфузия наблюдалась у 75,0% спиральных и 7,0% стентированных крыс. Количество клеточно-индикатор-положительных клеток было значительно повышено в децеллюляризированном стентированном стентировании по сравнению с спиральными аневризмами по отношению к тромбу на 7-й день (p = 0,01) и неоинтиме на 21-й день (p = 0,04). Не было обнаружено существенных различий в тромбе или неоинтиме при жизненно важных аневризмах.
Эти результаты подтверждают худшие закономерности заживления в спиральных по сравнению со стентированными аневризмами. Образование неоинтимы, по-видимому, особенно зависит от родительской артерии в децеллюляризированных аневризмах, тогда как оно поддерживается рекрутацией из клеток стенки аневризмы в жизненно важные клеточные стенки. С точки зрения трансляции, лечение стентом может быть более подходящим для сильно дегенеративных аневризм, тогда как одна только спираль может быть адекватной для аневризм с в основном здоровыми стенками сосудов.
Introduction
Субарахноидальное кровоизлияние, вызванное разрывом внутричерепной аневризмы (ИА), является разрушительным нейрохирургическим состоянием, связанным с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2,3,4. В дополнение к микрохирургическому клипированию, которое обеспечивает прямой контакт эндотелия с эндотелием, эндоваскулярные устройства приобретают все большее значение за последние десятилетия для лечения разорванных и случайно обнаруженных МА. Реакция заживления в эндоваскулярно обработанных ИА в основном зависит от образования неоинтимы и организации тромба. Оба являются синергетическими процессами, зависящими от миграции клеток из соседнего сосуда и стенки аневризмы. 5 На сегодняшний день происхождение эндотелиальных клеток в неоинтиме образование эндоваскулярных обработанных аневризм остается неясным. В литературе продолжаются споры об источнике, из которого набираются неоинтимообразующие клетки.
Используя клеточно-индикаторную инъекцию красителя CM-Dil (см. Таблицу материалов) в брюшную аорту крыс, мы стремились проанализировать роль эндотелиальных клеток, происходящих из родительской артерии, в формировании неоинтимы в двух разных точках времени FU (день 7 и день 21) (рисунок 1). Преимуществом модели является прямая локальная инкубация индикатора клеток in vivo в родительской артерии до шва аневризмы, что позволяет FU в более поздние моменты времени. Методы инъекций in vivo , такие как инкубация клеточного индикатора, не были описаны в литературе. Преимуществом этой методики является прямая, одноточечная, интраоперационная, in vivo инъекция, что делает модель надежной и воспроизводимой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ветеринарная поддержка осуществлялась в соответствии с институциональными руководящими принципами. Эксперименты были одобрены Местным комитетом по этике, Швейцария (BE 60/19). Руководящие принципы ARRIVE и принципы 3R строгособлюдаются 6,7. Тридцать один самец крыс Льюиса, 12 недель и весом 492 ± 8 г, были включены. Разводят всех крыс при комнатной температуре 23 °C и 12-часовом цикле свет/темнота. Обеспечьте свободный доступ к воде и пеллетам. Статистический анализ был выполнен с использованием непараметрического теста Уилкоксона-Манна-Уитни U. Значения вероятности (p) ≤ 0,05 и/или ≤ 0,01 были признаны значимыми.
1. Предоперационная фаза - общая подготовка и анестезиологические аспекты
- Рандомизируйте крыс в группы обработки катушки или стента (рисунок 2) с помощью веб-системы рандомизации. Теперь проведите предоперационное клиническое обследование всех животных, запланированных к операции, рядом с тихой, асептической операционной, поддерживающей комнатную температуру 23 ± 3 °C. Анализ поведения животных и осмотр слизистых оболочек и тургора в рамках предоперационного клинического обследования.
- Запишите вес каждого животного.
- Перед операцией инкубируют артериальные мешочки крыс-доноров в 0,1% додецилсульфата натрия в течение 10 ч при 37 °C для получения децеллюляризованных аневризм8. Соберите эти мешочки с животных-доноров за несколько дней до операции.
- Подготовьте по всей длине брюшную аорту микросубсидами и щипцами и нанесите 6-0 нерассасывающихся лигатур с интервалом 3-4 мм.
- Непосредственно генерировать жизненно важные аневризмы интраоперационно с помощью ранее перевязанного мешочка артериального сосуда из грудной части животного-донора9. Выполните торакотомию ножницами и хирургическими щипцами в указанном моменте времени ФУ и обжарьте сосуд мешочек на нужную длину.
- Непосредственно имплантируйте мешочек в реципиента и соберите аневризму у животного-донора для дальнейшего макроскопического анализа и гистологической обработки.
- Для индукции анестезии поместите всех крыс в чистую коробку, обеспеченную кислородом (О2), до потери сознания через 5-10 мин. Анестезируют крыс подкожной (SC) инъекцией смеси фентанила 0,005 мг/кг, медетомидина 0,15 мг/кг и мидазолама 2 мг/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает хирургическую плоскость не менее 45 минут. - Проверьте глубину анестезии по отсутствию рефлекса снятия педали.
- Поместите крыс в лежачее положение и побрейте торакоабдоминальную часть электробритвой.
- Зафиксируйте 4 лапы крыс лентой на доске, покрытой грелкой, соединенной с авторегуляционным ректальным зондом. Вставьте ректальный зонд в анус крысы для поддержания нужной температуры 37 °C с помощью грелки.
- Теперь установите датчик на правой задней ноге, подключенный к компьютеризированной системе для интраоперационной проверки жизненно важных показателей.
- Накройте нос и рот крысы маской для лица. Если требуется длительная анестезия, начинают изофлуран (1,0-2,0% титруют для эффекта в 100%O2).
- Продезинфицируйте хирургическое поле повидоном-йодом или чередующимися дезинфицирующими средствами и задрапируйте хирургическое поле стерильным способом.
- Для перианестетической помощи нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и накройте их непрозрачной фольгированной маской, чтобы предотвратить высыхание и повреждение от хирургической лампы.
- На протяжении всей операции непрерывно подавайте кислород через маску для лица, контролируйте температуру тела и поддерживайте тепло с помощью грелки, поддерживая нормотермию.
- Непрерывно контролируйте другие жизненно важные показатели (пульс и растяжение дыхания, частоту сердечных сокращений и дыхания, а также насыщение кислородом).
2. Оперативная фаза - инъекция клеточного индикатора
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный хирургический подход в модели9 микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки и методы имплантации катушек и стентов описаны в другом месте 8,10,11.
- Храните флуоресцентный липофильный индикатор клеток при ≤ -20 °C все время, защищенный от света.
- Выполняют операцию путем подготовки аорты крысы и кавальной вены с последующим отделением обоих, а также проксимальным и дистальным временным зажимом аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника была описана ранее9.- Зажмите проксимальную и дистальную части аорты двумя временными титановыми зажимами.
- Поместите один микросваб с фиолетовой прокладкой каждый под проксимальную и дистальную части аорты для лучшей визуализации артерии.
- Теперь защитите живот мокрой марлей.
- В день операции растворяют 2 мкл индикатора клеток путем пипетирования в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Переложите смесь на шприц объемом 1 мл, снабженный стерильной канюлей весом 27-1/2 г (0,4 x 13 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать воздействия света при выполнении шагов 2.5 и 2.6. - Выключите свет в операционной. Глядя под микроскоп, выполните одноточечную инъекцию в среднюю вентральную часть аорты с помощью микрощипцов и осторожно введите 1 мл гепаринизированного 0,9% физиологического раствора.
- Осторожно введите индикатор клеток (Видео 1) и немедленно выключите работающий микроскоп. Опять же, защитите живот мокрой марлей.
- Дайте красителю инкубировать не менее 15 минут. После инкубационного периода включите микроскоп и подсветку операционной.
- Выполняют продольную артериотомию и наложение швов аневризмы, как описано в другом месте11.
- Используйте микрофорфорсы и микросубчики для выполнения артериотомии так, чтобы ее длина усредняла диаметр собранной аневризмы (шаг 1.3). Чтобы обеспечить правильную длину, поместите аневризму рядом с аортой перед выполнением артериотомии. Зашить аневризму 8-10 одиночными швами с помощью нерассасывающегося шва 10-0 и аккуратно снять временные зажимы, начинающиеся дистально, под непрерывным орошением гепаринизированным физиологическим раствором. Закройте рану послойным способом. Следует отметить, что используйте катушку плотности упаковки 1 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Методика спиральной или стент-имплантации была описана в другом месте 8,10.
- Используйте микрофорфорсы и микросубчики для выполнения артериотомии так, чтобы ее длина усредняла диаметр собранной аневризмы (шаг 1.3). Чтобы обеспечить правильную длину, поместите аневризму рядом с аортой перед выполнением артериотомии. Зашить аневризму 8-10 одиночными швами с помощью нерассасывающегося шва 10-0 и аккуратно снять временные зажимы, начинающиеся дистально, под непрерывным орошением гепаринизированным физиологическим раствором. Закройте рану послойным способом. Следует отметить, что используйте катушку плотности упаковки 1 см.
3. Послеоперационный фазовый мониторинг и обезболивающий уход
- В конце операции отмените анестезию инъекционной смесью SC бупренорфина 0,05 мг/кг, атипамезола 0,75 мг/кг и флумазенила 0,2 мг/кг. Пусть каждое эксплуатируемое животное выздоровеет в чистой клетке до полного бодрствования и тепла, по мере необходимости, с помощью нагревательной лампы.
- В течение 3 дней вводят 1 мг/кг мелоксикама (одна инъекция или пероральное применение в день) и бупренорфин (0,05 мг/кг четыре раза в день) SC. На ночь вводят бупренорфин непрерывно в питьевую воду с той же дозировкой: 6 мл бупренорфина 0,3 мг/мл, 360 мл питьевой воды, 10 мл 5% глюкозы.
- В непосредственной послеоперационной фазе поместите каждое животное в одну клетку для защиты. Перегруппируйте животных через 24 ч.
- Если какая-либо крыса демонстрирует дистрессное или агрессивное поведение после инъекции СК, вводите бупренорфин в питьевую воду в течение дня.
- Обеспечьте мягкое кормление на полу клетки для поддержки кормления и восстановления после операции.
- Наблюдайте и ухаживайте за всеми животными в соответствии с таблицей оценки благополучия и боли.
- При необходимости вводят спасательную анальгезию SC (мелоксикам 1 мг/кг и 0,05 мг/кг бупренорфина).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В лабораторных условиях было включено в общей сложности 31 животное: 27 крыс были включены в окончательный статистический анализ; 4 крысы умерли преждевременно (смертность 12,9%). Интраоперационно растяжение дыхания было значительно снижено (p = 0,03) у стент- (12,9 мкм ± 0,7) по сравнению с крысами, обработанными катушками (13,5 мкм ± 0,6). Флуоресцентная ангиография проводилась для каждой крысы в конце финального FU. Реперфузия была показана у всех 6 животных, обработанных катушками, тогда как реперфузия наблюдалась только у 12,5% из 8 животных, обработанных стентом.
Объединенные исходные объемы аневризмы для 7-го и 21-го дней существенно не различались (ни для децеллюляризованных (p = 0,9), ни для жизненно важных (p = 0,1) аневризм) между группами спирального или стент-лечения (рисунок 3). Объединенные объемы FU для децеллюляризованных аневризм показали незначительный рост аневризмы в спиральных по сравнению со стентированными аневризмами (p = 0,28), значительно больший в жизненной спиральной, чем в стентированной группе (60,1 мм3 ± 31,1 мм3 против 20,5 мм3 ± 20,6 мм3; p = 0,002).
Количества клеточно-индикатор-положительных клеток в неоинтиме децеллюляризованных аневризм не существенно различались между группами, обработанными стентом или катушками на 7-й день FU (p = 0,8), но были значительно выше у стентированных крыс на 21-й день FU (рисунок 4; p = 0,04). У крыс, ушедших в жизненно важные аневризмы, не было отмечено значимых различий ни через 7 дней (p = 1,0), ни через 21 день (рисунок 5) FU (p = 0,66). При децеллюляризованных аневризмах через 7 дней FU в тромбе стент-обработанного стентом оставалось значительно больше клеточно-индикатор-положительных клеток по сравнению с группой, обработанной катушкой (p = 0,01). Эта разница не наблюдалась при жизненно важных аневризмах через 7 дней FU. См. Таблицу 1 для пропорции клеточно-индикатор-положительных клеток для децеллюляризированных, а также жизненно важных спиральных и стентированных аневризм для 7-го и 21-го дня FU. Контрокрашивание по фактору фон Виллебранда (F8) проводили в эндотелиальных клетках неоинтимы каждой крысы (рисунок 6).
Средняя продолжительность хирургической процедуры составила 119,1 ± 21,3 мин для группы намотки по сравнению с 154,1 ± 30,2 мин для группы стента (p = 0,001). Количество швов для швов аневризмы также существенно различалось (p = 0,000002) для змеевика (15,6 ± 2,9 шва) и стентных групп (11,3 ± 1,1).
Рисунок 1: Блок-схема экспериментальной установки. В общей сложности 35 животных были прооперированы и рандомизированы в группы свертывания или стентирования. Два животных группы стентов скончались в непосредственном послеоперационном течении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интраоперационные фотографии аневризм во время эмболизации катушки и стента. (А) изображена боковина-аневризма (#), наложенная на брюшную аорту крысы (*). Обратите внимание на спиральное устройство, введенное в аневризму, прежде чем выполнить последний одиночный стежок для завершения шва аневризмы. Обратите внимание на розоватое окрашивание (стрелку) с левой стороны артериотомии, указывающее на правильное распределение индикатора клеток. (B) Та же настройка, что и в A, показывающая устройство стента, уже находящееся на месте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Макроскопические посмертные измерения у 31 животного. Объемы аневризмы (мм3) были задокументированы до имплантации и при последующем наблюдении, представленные вдоль оси Y. (A) Исходный (децеллюляризованный), (B) последующий (децеллюляризованный), (C) исходный (жизненно важный), (D) последующий (жизненно важный). Данные за 7-й и 21-й день объединяются. ** p < 0,01. Значения выражаются в виде медиан с межквартильными диапазонами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примерное изображение децеллюляризованной аневризмы, обработанной стентом, на 21-й день. Справа показан обзор изображения моноклональной антиα-СМА, истощенной клетками аневризмы (2-кратное увеличение); шкала бар = 150 мкм. Слева, с помощью DAPI; красные клетки являются клеточно-индикаторно-положительными (A) в стенке аневризмы, (B) в тромбе, (C) остаточными окрашенными, но блеклыми клетками-индикатор-положительными клетками в неоинтиме и (D) в соседнем сосудистом комплексе. Шкала стержней = 100 мкм (A-D). Одинарная стрелка отмечает стенку аневризмы, двойная стрелка — родительную артерию. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; α-СМА = актин α гладкой мускулатуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примерное изображение обработанной спиралью жизненной аневризмы на 21-й день. Справа, показано изображение обзора моноклональной антиα-СМА, богатой клетками аневризмы (2-кратное увеличение); шкала бар = 150 мкм. Левая сторона, покрытая DAPI; красные клетки являются клеточно-индикаторно-положительными (A) в стенке аневризмы, (B) в тромбе, (C) множественными положительными клетками в неоинтиме и (D) в соседнем сосудистом комплексе. Шкала стержней = 100 мкм (A-D). Одинарная стрелка отмечает стенку аневризмы, двойная стрелка — родительную артерию. Сокращения: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; α-СМА = актин α гладкой мускулатуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: 40-кратное увеличение от окрашивания F8. # изображает образование тромба, * неоинтиму и § эндолюминальную сторону ниже отверстия аневризмы. Обратите внимание на эндотелиальное наслоение, показанное как фиолетовое окрашивание в эндолюминальном слое неоинтимы. Шкала = 175 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Краситель DAPI/CM-Dil (%) | Виток | Стент | |||
| День 7 | День 21 | День 7 | День 21 | ||
| Децеллюляризированные пакеты | Неоинтима | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Родительская артерия | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Тромб | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Стенка аневризмы | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Жизненно важные сумки | Неоинтима | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Родительская артерия | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Тромб | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Стенка аневризмы | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Таблица 1: Доля клеточно-индикаторных положительных клеток в неоинтиме, родительской артерии, тромбе и стенке аневризмы. Значения отображаются в процентах для децеллюляризованных и жизненно важных пакетов для обработки катушками и стентами на 7-й и 21-й день. Аббревиатура: DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол.
Видео 1: Инъекция клеточного индикатора в брюшную часть аорты крысы. Эта техника выполняется с помощью одноточечной инъекции в зажатую аорту крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование показывает, что образование неоинтимы опосредовано эндотелиальными клетками, происходящими из родительской артерии комплекса аневризмы, но поддерживается набором клеток, полученных из стенки аневризмы в жизненно важных аневризмах. Тем не менее, роль циркулирующих клеток-предшественников в заживлении аневризмы остается спорной12,13. В целом, 31 самец крысы Льюиса был включен в это исследование; только 4 умерли преждевременно (12,9% смертности).
В отличие от хирургического клипирования, которое способствует последующему контакту эндотелия с эндотелием, успех эндоваскулярного лечения зависит от отсроченных биологических реакций. Недавно разработанные методы, такие как отвод потока, биологически активные эндоваскулярные устройства или внутрипросветная клеточная терапия, заслуживают внимания в отношении эндоваскулярных лечебных устройств14,15. В этом контексте данные показывают, что успех лечения в успешной эрадикации аневризмы аддитивно связан с биологическим ответом от самой стенки аневризмы 5,16,17.
Недавние исследования показали, что организация тромба и образование неоинтимы являются параллельными процессами в заживлении аневризмы после эндоваскулярной терапии. Оба процесса, участвующие в заживлении аневризмы, зависят от перемещения клеток из соседнего сосуда комплекса аневризмы и самой стенки аневризмы. Кроме того, оба процесса облегчаются наличием эндоваскулярных устройств, таких как катушки или стенты. Как показали Grüter et al., 5 тромбоорганизующие клетки в основном происходят из соседнего сосуда для обоих типов эндоваскулярного подхода к лечению. Здесь образование неоинтимы в аневризмах, обработанных спиралью, в основном зависит от миграции клеток из стенки сосуда, тогда как соседний сосуд служил основным донором в аневризмах, обработанных стентом.
На протяжении многих лет можно было наблюдать общую нить в установлении и расширении исследовательских вопросов с использованием модели микрохирургической аневризмы боковой стенки крыс в Хельсинки. Во-первых, децеллюляризованные и, следовательно, дегенеративные аневризмы более склонны к росту и разрыву, чем богатые клетками жизненно важные аневризмы9. Кроме того, лечение катушками показало больший успех в лечении аневризмы жизненно важными мешочками, чем сильно дегенеративными8. Кроме того, трансплантация клеток обеспечила достаточное заживление аневризмы даже при сильно дегенерированных аневризмах14. Сравнивая различные эндоваскулярные устройства в этой модели аневризмы, лечение стентом явно превосходило лечение одной только катушкой11. Таким образом, оценивая различные режимы рекрутирования клеток в спиральных и стентированных аневризмах родительской артерии и стенки аневризмы5, остаются основные вопросы, вызывается ли образование неоинтимы в основном эндотелиальными клетками из родительской артерии, клетками из стенки аневризмы или даже циркулирующими клетками-предшественниками. Недавние результаты по циркулирующим клеткам-предшественникам, вызывающим образование неоинтимы, являются спорными 12,13,15,18.
Только самцы крыс были включены в эту серию, чтобы избежать смешанного воздействия эстрогена на рост аневризмы, образование тромбов и воспаление стенки, как сообщалось ранее19. В дополнение к сложному мультимодальному мониторингу с флуоресцентной ангиографией20 и мониторингом жизненно важных показателей, мы использовали специфический индикатор клеток для маркировки родительской артерии, чтобы дифференцировать клетки, полученные из циркулирующих клеток в кровотоке, от клеток, полученных из истинной миграции соседних клеток. Тем не менее, нельзя исключать незначительного затухания интенсивности сигналов эндотелиальных клеток со временем и делением клеток, хотя исследования показали сильную интенсивность сигнала миофибробластов в эти моменты времени (7 день и 21 день)14. Наконец, эта модель аневризмы использовала гемодинамику и последующие биологические процессы, такие как скорость спонтанного тромбоза или заживления аневризмы, на которые сильно влияет созвездие боковой стенки аневризмы21.
Как показано в этих выводах, остается очевидным, что соседний сосуд комплекса аневризмы служит важным источником клеток в формировании неоинтимы. Эти результаты полностью согласуются с недавно опубликованными результатами Kallmes et al., показывающими, что толщина стойки также является определяющим фактором аппозиции стенок в диверторах потока, что является важным фактором эффективной эндотелиализации. Здесь увеличение толщины стойки снижает вероятность неправильного положения, улучшает контакт со стенкой родительской артерии и, следовательно, оптимизирует клеточную реконструкцию с помощью стоек22. У крыс с децеллюляризованными аневризмами в стентированной группе на 21-й день наблюдалось значительно большее количество клеточно-индикаторно-положительных эндотелиальных клеток, чем в спиральной группе в тот же момент времени (таблица 1).
Этот вывод можно объяснить тем фактом, что стенты, применяемые в богатой клетками области родительской артерии даже при сильно дегенерированных аневризмах, служат направляющими структурами для клеточных движений, позволяя непрерывно эндотелиальную выстилку эндолюминального слоя неоинтимы и обеспечивая прогрессирующее заживление аневризмы. Аддитивно, сравнивая стентирование и обмотку на 7-й день FU, в тромбе стентированных животных наблюдалось значительно большее количество клеточно-индикатор-положительных клеток, чем у спиральных. Поэтому разумным объяснением является то, что стентирующие стойки легко облегчают миграцию клеток из соседнего сосуда в тромб. При жизненно важных аневризмах, сравнивающих свертывание и стентирование, ни для неоинтимы через 21 день, ни для образования тромба на 7-й день, не наблюдалось значительных различий в клетках, положительных на индикатор клеток. В соответствии с предыдущим выводом5, это можно объяснить поддержкой образования неоинтимов путем набора клеток в здоровых стенках сосудов.
Отсутствие каких-либо существенных различий в количестве клеточно-индикатор-положительных клеток в тромбе через 21 день в децеллюляризованных или жизненно важных спиральных и стентированных аневризмах объясняется тем, что неоинтима была почти полностью запечатана23. Поэтому даже через стенты миграция клеток в тромб уже невозможна. Критические моменты, которые следует учитывать при выполнении имплантации стента, включают возможный разрыв ятрогенного сосуда во время применения стента или образование критического стеноза в области артериотомии с потенциальным развитием ишемии в нижних конечностях. Чтобы предотвратить ишемию, выберите место артериотомии рядом с бифуркацией сосуда для введения стента, достаточно маленького, чтобы избежать ятрогенного стеноза после имплантации стента и ушивания артериотомии. Кроме того, перед закрытием промыть эту область гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы свести к минимуму дистальный транспорт любых потенциальных эмболов из-за присутствия любого тромбогенного компонента.
Материалы, необходимые для этих процедур, как правило, чрезвычайно затратны и редки, и их доступность имеет решающее значение для молодых жителей в нейрохирургии24,25. Однако, в дополнение к богатству информации, полученной из этой модели, практика этой операции поможет улучшить хирургические навыки.
В заключение, биологическая реакция заживления эндоваскулярных аневризм в модели микрохирургической аневризмы боковой стенки хельсинкской крысы зависит от миграции клеток из комплекса соседних сосудов. Это дополнительно поддерживается набором клеток из жизненно важной, здоровой стенки аневризмы. Однако при децеллюляризованных и, следовательно, сильно дегенерированных аневризмах богатая родительскими клетками артерия является наиболее важным источником клеток для образования неоинтимы, чему способствуют эндоваскулярные устройства, такие как стенты, соединяющие соседние богатые клетками ткани с отверстием аневризмы. Чтобы помочь перевести этот вывод в клинические условия, сильно дегенерированные аневризмы можно лечить с помощью каркасов, размещенных в богатых клетками здоровых областях сосудов. Одной только эмболизации катушки может быть достаточно для аневризм с преимущественно здоровыми стенками сосудов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы несут единоличную ответственность за разработку и проведение представленного исследования и заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Алессандру Бергадано, DVM, PhD, за целенаправленный надзор за долгосрочным здоровьем животных. Эта работа была поддержана исследовательскими фондами Исследовательского совета, Kantonsspital Aarau, Aarau, Швейцария, и Швейцарского национального научного фонда SNF (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
