Summary
Endotel hücrelerini izlemek için tek noktalı, lipofilik hücre izleyici enjeksiyonu, ardından arteriyotomi ve abdominal sıçan aortunda yanak duvar anevrizmalarının dikilmesi yapıldı. Neointima oluşumu, desellülarize anevrizmalarda ana artere bağımlı görünüyordu ve hayati hücre bakımından zengin duvarlardaki anevrizma duvarı hücrelerinden işe alım ile desteklendi.
Abstract
Mikrocerrahi kırpma, intrakraniyal anevrizmalara kan akışının daha sonra bir bariyerini oluştururken, endovasküler tedavi neointima ve trombüs oluşumuna dayanır. Neointimanın endoluminal tabakasını kaplayan endotel hücrelerinin kaynağı belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, halihazırda köklü Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizma modelinde hücre izleyici enjeksiyonu sonrası neointima oluşturan hücrelerin kökenini araştırmaktır.
Yanak anevrizmaları, erkek Lewis sıçanlarında desellülarize veya vital arteriyel poşetlerin aortla uçtan yana dikilmesi ile oluşturuldu. Anevrizma sütürü ile arteriyotomiden önce, komşu damardaki endotel hücrelerini etiketlemek ve takip sırasında proliferasyonlarını izlemek için kelepçeli aort içine CM-Dil boyası içeren bir hücre izleyici enjeksiyonu yapıldı (FU). Tedavi sonrasında sarma (n = 16) veya stent (n = 15) uygulanır. FU'da (7 gün veya 21 gün), tüm sıçanlara floresan anjiyografi, ardından anevrizma hasadı ve belirli ilgi alanları için immünohistolojik hücre sayımları ile makroskopik ve histolojik değerlendirme yapıldı.
31 anevrizmanın hiçbiri takipte yırtılmamıştı. Dört hayvan erken öldü. Stentli sıçanların %75.0'ında ve %7.0'ında makroskopik olarak rezidüel perfüzyon gözlendi. Desellülarize stentlerde hücre izleyici pozitif hücre miktarı, 7. günde trombüs (p=0.01) ve 21. günde neointima (p=0.04) açısından sarmal anevrizmalara göre anlamlı derecede artmıştır. Vital anevrizmalarda trombüs veya neointimada anlamlı fark saptanmadı.
Bu bulgular, stentli anevrizmalara kıyasla sarmallarda daha kötü iyileşme paternlerini doğrulamaktadır. Neointima oluşumu özellikle desellülerize anevrizmalarda ana artere bağımlı görünürken, vital hücre bakımından zengin duvarlarda anevrizma duvarı hücrelerinden işe alım ile desteklenmektedir. Translasyon açısından, stent tedavisi yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalar için daha uygun olabilirken, çoğunlukla sağlıklı damar duvarlarına sahip anevrizmalar için tek başına sarma yeterli olabilir.
Introduction
İntrakraniyal anevrizmanın (İA) rüptürü sonucu gelişen subaraknoid kanama, yüksek morbidite ve mortaliteile ilişkili yıkıcı bir nöroşirürjik durumdur 1,2,3,4. Endotelden endotele doğrudan temas sağlayan mikrocerrahi kırpmaya ek olarak, endovasküler cihazlar son yıllarda rüptüre olmuş ve tesadüfen keşfedilen İA'ların tedavisinde giderek artan bir önem kazanmıştır. Endovasküler olarak tedavi edilen İA'larda iyileşme yanıtı esas olarak neointima oluşumuna ve trombüs organizasyonuna bağlıdır. Her ikisi de bitişik damardan ve anevrizma duvarından hücre göçüne bağlı olarak sinerjik süreçlerdir. 5 Endovasküler tedavi edilen anevrizmaların neointima oluşumunda endotel hücrelerinin kökeni bugüne kadar belirsizliğini korumaktadır. Literatürde, neointima oluşturan hücrelerin işe alındığı kaynak hakkında devam eden bir tartışma vardır.
Sıçanların abdominal aortunda CM-Dil boyasının hücre izleyici enjeksiyonunu kullanarak ( Materyal Tablosuna bakınız), iki farklı FU zaman noktasında (gün 7 ve gün 21) neointima oluşumunda ana arterden kaynaklanan endotel hücrelerinin rolünü analiz etmeyi amaçladık (Şekil 1). Modelin bir avantajı, anevrizma sütüründen önce bir ebeveyn arterinde in vivo olarak doğrudan lokal hücre izleyici inkübasyonudur ve daha sonraki zaman noktalarında FU'ya izin verir. Hücre izleyici inkübasyonu gibi in vivo enjeksiyon teknikleri literatürde tanımlanmamıştır. Bu tekniğin bir avantajı, modeli sağlam ve tekrarlanabilir kılan doğrudan, tek noktalı, intraoperatif, in vivo enjeksiyondur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Veteriner desteği kurumsal kılavuzlara göre yapıldı. Deneyler İsviçre Yerel Etik Komitesi (BE 60/19) tarafından onaylanmıştır. ARRIVE yönergeleri ve 3R ilkeleri sıkı bir şekilde takip edilmiştir 6,7. 12 haftalık ve 492 ± 8 g ağırlığında otuz bir erkek Lewis sıçanı dahil edildi. Tüm sıçanları 23 ° C'lik bir oda sıcaklığında ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde barındırın. Suya ve peletlere ücretsiz erişim sağlayın. İstatistiksel analizler parametrik olmayan Wilcoxon-Mann-Whitney U testi kullanılarak yapılmıştır. 0.05 ve/veya 0.01 ≤ ≤ olasılık değerleri (p) anlamlı kabul edildi.
1. Preoperatif faz-genel hazırlık ve anesteziyolojik yönler
- Web tabanlı randomizasyon sistemi aracılığıyla sıçanları bobin veya stent tedavi gruplarına randomize edin (Şekil 2). Şimdi, 23 ± 3 ° C'lik bir oda sıcaklığını koruyan sessiz, aseptik bir ameliyathanenin yanında ameliyat için planlanan tüm hayvanların ameliyat öncesi klinik muayenesini yapın. Hayvanların davranışlarını analiz edin ve ameliyat öncesi klinik muayenenin bir parçası olarak mukoza zarlarını ve turgoru inceleyin.
- Her hayvanın ağırlığını kaydedin.
- Ameliyattan önce, desellülarize anevrizmalar elde etmek için donör sıçanlardan arteriyel poşetleri 37 ° C'de 10 saat boyunca% 0.1 sodyum dodesil sülfat içinde inkübe edin8. Bu keseleri ameliyattan birkaç gün önce donör hayvanlardan toplayın.
- Abdominal aortun tam uzunluğunu mikromakas ve forseps ile hazırlayın ve 3-4 mm aralıklarla 6-0 emilemeyen ligatür uygulayın.
- Bir donör hayvanın torasik kısmından daha önce bağlanmış bir arteriyel damar kesesi tarafından intraoperatif olarak doğrudan hayati anevrizmalar üretir9. Belirtilen FU zaman noktasında makas ve cerrahi forseps ile torakotomi yapın ve damar kesesini istenen uzunlukta yaslanın.
- Poşeti doğrudan alıcıya implante edin ve daha fazla makroskopik analiz ve histolojik işlem için anevrizmayı donör hayvandan toplayın.
- Anestezi indüksiyonu için, tüm sıçanları 5-10 dakika sonra bilinç kaybına kadar oksijen (O2) ile donatılmış temiz bir kutuya yerleştirin. Sıçanları, 0.005 mg / kg, medetomidin 0.15 mg / kg ve midazolam 2 mg / kg karışımının deri altı (SC) enjeksiyonu ile anestezi altına alın.
NOT: Bu, en az 45 dakikalık bir cerrahi düzlem sağlar. - Pedal çekilme refleksinin yokluğunda anestezi derinliğini kontrol edin.
- Sıçanları sırtüstü pozisyona yerleştirin ve torakoabdominal kısmı elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edin.
- Sıçanların 4 pençesini, otomatik düzenleyici bir rektal proba bağlı bir ısıtma yastığı ile kaplanmış bir tahta üzerine bantla sabitleyin. Isıtma yastığı yardımıyla istenen sıcaklığı 37 ° C'de tutmak için rektal probu sıçanın anüsüne yerleştirin.
- Şimdi, intraoperatif olarak hayati belirtileri kontrol etmek için bilgisayarlı bir sisteme bağlı sağ arka bacağa bir sensör takın.
- Sıçanın burnunu ve ağzını bir yüz maskesi ile örtün. Uzun süreli anestezi gerekiyorsa, izofluranı başlatın (% 1.0-2.0,O2'de etkili olmak için% 1.0-2.0 titre edilmiştir).
- Cerrahi alanı povidon-iyot veya alternatif dezenfektanlarla dezenfekte edin ve cerrahi alanı steril bir şekilde örtün.
- Perianestezik bakım için, gözlere steril bir oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın ve cerrahi lambanın kurumasını ve zarar görmesini önlemek için opak bir folyo maskesi ile örtün.
- Ameliyat boyunca, yüz maskesi aracılığıyla sürekli oksijen sağlayın, vücut ısısını izleyin ve normotermiyi koruyarak bir ısıtma yastığı kullanarak ısı sağlayın.
- Diğer hayati belirtileri sürekli izleyin (nabız ve nefes darlığı, kalp ve nefes hızı ve oksijen doygunluğu).
2. Operatif faz - hücre izleyici enjeksiyonu
NOT: Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizması model9'daki ayrıntılı cerrahi yaklaşım ve bobin ve stent implantasyonu teknikleri başka bir yerde açıklanmıştır 8,10,11.
- Floresan lipofilik hücre izleyiciyi her zaman ≤ -20 ° C'de ışıktan korunarak saklayın.
- Sıçan aortunu ve kaval venini hazırlayarak, ardından her ikisinin ayrılmasının yanı sıra aortun proksimal ve distal geçici kelepçelenmesiyle ameliyatı gerçekleştirin.
NOT: Bu teknik daha önce9 olarak tanımlanmıştır.- Aortun proksimal ve distal kısımlarını iki geçici titan klipsle kelepçeleyin.
- Arterin daha iyi görselleştirilmesi için aortun proksimal ve distal kısımlarının altına her biri mor dolgulu bir mikrosürüntü koyun.
- Şimdi, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
- Operasyon gününde, hücre izleyicinin 2 μL'sini, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde pipetleme yaparak çözün.
- Karışımı 27-1/2 G (0,4 x 13 mm) steril kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın.
NOT: Adım 2.5 ve 2.6'yı uygularken ışığa maruz kalmaktan kaçınmaya dikkat edin. - Ameliyathanedeki ışığı kapatın. Mikroskop altında bakarken, mikro forseps kullanarak aortun orta ventral kısmına tek noktalı enjeksiyonu gerçekleştirin ve 1 mL heparinize % 0.9 salin çözeltisini dikkatlice enjekte edin.
- Hücre izleyiciyi dikkatlice enjekte edin (Video 1) ve hemen çalışma mikroskobunu da kapatın. Yine, karnı ıslak gazlı bezle koruyun.
- Boyanın en az 15 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçka döneminden sonra mikroskop ve ameliyathane ışıklarını açın.
- Başka bir yerde tarif edildiği gibi uzunlamasına arteriyotomi ve anevrizmanın dikişini gerçekleştirin11.
- Arteriyotomi yapmak için mikroforseps ve mikromakas kullanın, böylece uzunluğu hasat edilen anevrizmanın çapının ortalamasını alır (adım 1.3). Doğru uzunluğu sağlamak için, arteriyotomi yapmadan önce anevrizmayı aortun yanına yerleştirin. Anevrizmayı emilemeyen 10-0 dikiş kullanarak 8-10 tek dikişle dikişin ve heparinize salin ile sürekli sulama altında distal olarak başlayan geçici kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Yarayı katmanlı bir şekilde kapatın. Not olarak, 1 cm'lik bir bobin ambalaj yoğunluğu kullanın.
NOT: Bobin veya stent implantasyonu tekniği başka bir yerdetanımlanmıştır 8,10.
- Arteriyotomi yapmak için mikroforseps ve mikromakas kullanın, böylece uzunluğu hasat edilen anevrizmanın çapının ortalamasını alır (adım 1.3). Doğru uzunluğu sağlamak için, arteriyotomi yapmadan önce anevrizmayı aortun yanına yerleştirin. Anevrizmayı emilemeyen 10-0 dikiş kullanarak 8-10 tek dikişle dikişin ve heparinize salin ile sürekli sulama altında distal olarak başlayan geçici kelepçeleri dikkatlice çıkarın. Yarayı katmanlı bir şekilde kapatın. Not olarak, 1 cm'lik bir bobin ambalaj yoğunluğu kullanın.
3. Postoperatif faz izleme ve analjik bakım
- Ameliyatın sonunda, buprenorfin 0.05 mg / kg, atipamezol 0.75 mg / kg ve flumazenil 0.2 mg / kg'lık bir SC enjeksiyon karışımı ile anesteziyi tersine çevirin. Çalıştırılan her hayvanın, bir ısıtma lambası ile tamamen uyanık ve gerektiğinde ısınana kadar temiz bir kafeste iyileşmesine izin verin.
- 3 gün boyunca, 1 mg / kg meloksikam (günde bir enjeksiyon veya oral uygulama) ve buprenorfin (günde dört kez 0.05 mg / kg) SC. Gece boyunca, içme suyunda sürekli olarak aynı dozda buprenorfin sağlayın: 6 mL buprenorfin 0.3 mg / mL, 360 mL içme suyu, 10 mL% 5 glikoz.
- Ameliyat sonrası hemen sonrasında, her hayvanı korunmak için tek bir kafeste barındırın. Hayvanları 24 saat sonra yeniden gruplandırın.
- SC enjeksiyonundan sonra herhangi bir sıçan sıkıntılı veya agresif davranış gösterirse, gün boyunca içme suyunda buprenorfin uygulayın.
- Ameliyat sonrası beslenmeyi ve iyileşmeyi desteklemek için kafes tabanında yumuşak besleme sağlayın.
- Tüm hayvanları refah ve ağrı puan tablosuna göre gözlemleyin ve bakımını yapın.
- Gerektiğinde kurtarma analjezi SC'yi (meloksikam 1 mg / kg ve 0.05 mg / kg buprenorfin) uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laboratuvar ortamına toplam 31 hayvan dahil edildi: Son istatistiksel analize 27 sıçan dahil edildi; 4 sıçan erken öldü (%12.9 mortalite oranı). İntraoperatif olarak, solunum distansiyonu stent- (12.9 μm ± 0.7) stent- (12.9 μm ± 0.7) ile tedavi edilen sıçanlarda anlamlı olarak azaldı (p = 0.03). Son FU'nun sonunda her sıçan için floresan anjiyografi yapıldı. Reperfüzyon, bobinle tedavi edilen 6 hayvanın hepsinde endikeyken, stentle tedavi edilen 8 hayvanın sadece% 12.5'inde reperfüzyon gözlendi.
7. gün ve 21. gün için havuzlanmış başlangıç anevrizması hacimleri, bobin veya stent tedavisi grupları arasında anlamlı olarak farklılık göstermedi (ne desellülarize (p = 0.9) ne de vital (p = 0.1) anevrizmalar için) (Şekil 3). Desellülarize anevrizmalar için havuzlanmış FU hacimleri, stentlenmiş anevrizmalara kıyasla bobinlerde anlamlı olmayan bir anevrizma büyümesi gösterdi (p = 0.28), vital sarmallı grupta stentli gruba göre anlamlı derecede daha fazla (60.1 mm 3 ± 31.1 mm3'e karşı 20.5 mm 3 ± 20.6 mm 3; p = 0,002).
Desellülarize anevrizmaların neointimasındaki hücre izleyici-pozitif hücre miktarları, 7. FU gününde stent veya bobin ile tedavi edilen gruplar arasında anlamlı farklılık göstermedi (p = 0.8), ancak 21. gün FU'da stent sıçanlarda anlamlı derecede yüksekti (Şekil 4; p = 0.04). Vital anevrizma dikişli sıçanlarda, 7 gün (p = 1.0) veya 21 gün (Şekil 5) FU'da (p = 0.66) anlamlı bir fark görülmedi. 7 günlük FU'da desellülarize anevrizmalarda, bobin ile tedavi edilen gruba kıyasla stent ile tedavi edilen trombüste anlamlı derecede daha fazla hücre izleyici-pozitif hücre kalmıştır (p = 0.01). Bu fark 7 günlük FU'da vital anevrizmalarda gözlenmedi. Desellülarize için hücre izleyici-pozitif hücrelerin yanı sıra 7. gün ve 21. gün FU için hayati sarmal ve stentli anevrizmaların oranı için Tablo 1'e bakınız. Von Willebrand faktörü (F8) için karşı boyama her sıçanın neointimasının endotel hücrelerinde yapıldı (Şekil 6).
Cerrahi işlemin ortalama süresi bobin grubu için 119.1 ± 21.3 dakika iken, stent grubu için 154.1 ± 30.2 dakika idi (p = 0.001). Anevrizma sütürleri için dikiş sayısı da bobin (15.6 ± 2.9 dikiş) ve stent grupları (11.3 ± 1.1) için anlamlı olarak farklılık gösterdi (p = 0.000002).
Şekil 1: Deney ortamının akış şeması. Toplam 35 hayvan ameliyat edildi ve sarma veya stent gruplarına randomize edildi. Stent grubundaki iki hayvan hemen postoperatif seyirde öldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bobin ve stent embolizasyonu sırasındaki anevrizmaların intraoperatif fotoğrafları. (A), abdominal sıçan aortuna dikilmiş bir yanak anevrizmasını (#) göstermektedir (*). Anevrizma sütürünü tamamlamak için son tek dikişi yapmadan önce anevrizmaya verilen bobin cihazına dikkat edin. Arteriyotominin sol tarafındaki pembemsi boyamaya (ok) dikkat edin, bu da hücre izleyicisinin doğru dağılımını gösterir. (B) A'dakiyle aynı ayar, stent cihazını zaten in situ olarak gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: 31 hayvanda makroskopik postmortem ölçümler. Anevrizma hacimleri (mm3) implantasyondan önce ve takipte y ekseni boyunca temsil edilen belgelenmiştir. (A) Taban çizgisi (desellülarize), (B) takip (desellülarize), (C) bazal (vital), (D) takip (vital). 7. gün ve 21. güne ait veriler bir araya getirilir. ** p < 0,01. Değerler, çeyrekler arası aralıklara sahip medyanlar olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 21. günde stent ile tedavi edilen desellülarize anevrizmanın örnek görüntüsü. Sağda, monoklonal antia-SMA, hücre tükenmiş anevrizmanın (2 kat büyütme) görüntüsüne genel bakış gösterilmiştir; ölçek çubuğu = 150 μm. Solda, DAPI ile karşı lekeli; kırmızı hücreler anevrizma duvarında hücre izleyici-pozitif (A), trombüste (B), (C) neointimada rezidüel boyalı ancak solmuş hücre izleyici-pozitif hücreler ve (D) komşu damar kompleksinde bulunur. Ölçek çubukları = 100 μm (A-D). Tek ok anevrizma duvarını işaretler, çift ok ana arteri işaretler. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = α-düz kas aktini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 21. günde bobin ile tedavi edilen hayati anevrizmanın örnek görüntüsü. Sağ tarafta, monoklonal antia-SMA, hücre bakımından zengin anevrizmanın (2 kat büyütme) görüntüsüne genel bakış gösterilmiştir; ölçek çubuğu = 150 μm. Sol taraf, DAPI ile karşı lekeli; kırmızı hücreler anevrizma duvarında hücre izleyici-pozitif (A), trombüste (B), neointimada (C) çoklu pozitif hücreler ve (D) bitişik damar kompleksinde bulunur. Ölçek çubukları = 100 μm (A-D). Tek ok anevrizma duvarını işaretler, çift ok ana arteri işaretler. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; α-SMA = α-düz kas aktini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: F8 boyamasından 40 kat büyütme . # trombüs oluşumunu, * neointimayı ve § anevrizma deliğinin altındaki endoluminal tarafı gösterir. Neointimanın endoluminal tabakasında mor boyama olarak gösterilen endotel tabakasına dikkat edin. Ölçek çubuğu = 175 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| DAPI/CM-Dil boya (%) | Bobin | Stent | |||
| 7. Gün | 21. Gün | 7. Gün | 21. Gün | ||
| Desellülarize poşetler | Neointima | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Ebeveyn arteri | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Trombüs | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Anevrizma duvarı | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Hayati poşetler | Neointima | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Ebeveyn arteri | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Trombüs | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Anevrizma duvarı | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Tablo 1: Neointima, ebeveyn arter, trombüs ve anevrizma duvarındaki hücre izleyici pozitif hücrelerin oranı. Değerler, 7. gün ve 21. gün için bobin ve stent tedavisi için desellülarize ve hayati poşetler için yüzdeler olarak gösterilmektedir. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.
Video 1: Sıçan aortunun karın kısmına hücre izleyici enjeksiyonu. Bu teknik, kelepçelenmiş sıçan aortuna tek noktalı bir enjeksiyon kullanılarak gerçekleştirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, neointima oluşumuna anevrizma kompleksinin ana arterinden köken alan endotel hücreleri aracılığıyla aracılık edildiğini, ancak vital anevrizmalarda anevrizma duvarından türetilen hücrelerin işe alınması ile desteklendiğini göstermektedir. Bununla birlikte, dolaşımdaki progenitör hücrelerin anevrizma iyileşmesindeki rolü tartışmalı olmaya devam etmektedir12,13. Genel olarak, 31 erkek Lewis sıçanı bu araştırmaya dahil edildi; sadece 4 kişi erken öldü (%12.9 mortalite).
Daha sonraki endotelden endotele teması teşvik eden cerrahi kırpmanın aksine, endovasküler tedavinin başarısı gecikmiş biyolojik yanıtlara dayanır. Akım saptırma, biyoaktif endovasküler cihazlar veya intraluminal hücre bazlı tedaviler gibi yeni geliştirilen teknikler, endovasküler tedavi cihazları açısından dikkat çekicidir14,15. Bu bağlamda, kanıtlar başarılı anevrizma eradikasyonunda tedavi başarısının anevrizma duvarının kendisinden gelen biyolojik yanıt ile ilave olarak ilişkili olduğunu göstermektedir 5,16,17.
Son yıllarda yapılan çalışmalar, endovasküler tedaviler sonrası anevrizma iyileşmesinde trombüs organizasyonu ve neointima oluşumunun eş zamanlı süreçler olduğunu ileri sürmüştür. Anevrizma iyileşmesinde yer alan her iki süreç de, anevrizma kompleksinin bitişik damarından ve anevrizma duvarının kendisinden hareket eden hücrelere dayanır. Ayrıca, her iki işlem de bobin veya stent gibi endovasküler cihazların varlığı ile kolaylaştırılmıştır. Grüter ve ark.'nın gösterdiği gibi,5 trombüs düzenleyici hücre esas olarak her iki tip endovasküler tedavi yaklaşımı için bitişik damardan türemiştir. Burada, bobin ile tedavi edilen anevrizmalarda neointima oluşumu esas olarak damar duvarından hücre göçüne dayanırken, bitişik damar stent ile tedavi edilen anevrizmalarda birincil donör olarak görev yapmıştır.
Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizma modelini kullanarak araştırma sorularının oluşturulmasında ve genişletilmesinde ortak bir konu yıllar içinde gözlemlenebilir. İlk olarak, desellülarize ve dolayısıyla dejenere anevrizmalar, hücre bakımından zengin hayati anevrizmalardan daha fazla büyümeye ve rüptüre eğilimlidir9. Ayrıca, bobin tedavisi, hayati torbalarla anevrizma tedavisinde, yüksek oranda dejenere olanlardan daha fazla başarı göstermiştir8. Ayrıca, hücre nakli yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalarda bile yeterli anevrizma iyileşmesini sağlamıştır14. Bu anevrizma modelinde farklı endovasküler cihazlar karşılaştırıldığında, stent tedavisi tek başına bobin tedavisinden açıkça üstündü11. Bu nedenle, ana arterden ve anevrizma duvarı5'ten sarmal ve stentli anevrizmalardaki farklı hücre işe alım modlarını takdir ederek, neointima oluşumunun esas olarak ana arterden endotel hücreleri, anevrizma duvarından hücreler veya hatta dolaşımdaki progenitör hücreler tarafından tetiklenip tetiklenmediği ana sorular devam etmektedir. Neointima oluşumunu tetikleyen dolaşımdaki progenitör hücrelerle ilgili son bulgular tartışmalıdır12,13,15,18.
Daha önce bildirildiği gibi, östrojenin anevrizma büyümesi, trombüs oluşumu ve duvar iltihabı üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerinden kaçınmak için bu seriye sadece erkek sıçanlar dahil edildi19. Floresan anjiyografi20 ve vital bulguların izlenmesi ile sofistike multimodal izlemeye ek olarak, kan dolaşımındaki dolaşımdaki hücrelerden türetilen hücreleri komşu hücrelerin gerçek göçünden türetilenlerden ayırt etmek için ana arteri etiketlemek için spesifik bir hücre izleyici kullandık. Bununla birlikte, endotel hücrelerinin sinyal yoğunluğunun zaman ve hücre bölünmesi ile hafifçe solmasını dışlayamayız, ancak çalışmalar bu zaman noktalarında (7. gün ve 21. gün) miyofibroblastların güçlü bir sinyal yoğunluğunu göstermiştir14. Son olarak, bu anevrizma modeli, hemodinamiği ve anevrizmanın yan duvar takımyıldızından oldukça etkilenen spontan tromboz veya anevrizma iyileşmesi gibi müteakip biyolojik süreçleri kullandı21.
Bu bulgularda gösterildiği gibi, anevrizma kompleksinin bitişik damarının bir neointima oluşturmada önemli bir hücre kaynağı olarak hizmet ettiği açıktır. Bu bulgular, Kallmes ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan sonuçlarla güçlü bir şekilde uyumludur ve gergi kalınlığının, etkili endotelizasyonun önemli bir itici gücü olan akış saptırıcılarında duvar appozisyonunun bir belirleyicisi olduğunu göstermektedir. Burada, gergi kalınlığının arttırılması malappozisyon olasılığını azaltır, ana arter duvarı ile teması iyileştirir ve bu nedenle dikmeler22 aracılığıyla hücresel rekonstrüksiyonu optimize eder. Desellülarize anevrizması olan sıçanlarda, 21. günde stent uygulanan grupta, aynı zaman noktasında sarmal gruba göre anlamlı derecede daha yüksek miktarda hücre izleyici-pozitif endotel hücresi gözlenmiştir (Tablo 1).
Bu bulgu, yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalarda bile ana arterin hücre bakımından zengin bir bölgesine uygulanan stentlerin, hücre hareketleri için yol gösterici yapılar olarak hizmet etmesi, neointimanın endoluminal tabakasının sürekli endotel astarına izin vermesi ve ilerleyici anevrizma iyileşmesi sağlaması gerçeğine bağlanabilir. Ek olarak, 7. gün FU'da stent ve sarma karşılaştırıldığında, stentli hayvanların trombüsünde, sarmal olanlardan önemli ölçüde daha yüksek miktarda hücre izleyici-pozitif hücre gözlenmiştir. Bu nedenle, makul bir açıklama, stent desteklerinin trombüsteki bitişik damardan hücre göçünü kolayca kolaylaştırmasıdır. Bobinleme ile stenti karşılaştıran vital anevrizmalarda, ne 21 gün sonra neointima ne de 7. günde trombüs oluşumu için, hücre izleyici pozitif hücrelerde anlamlı farklılıklar gözlendi. Önceki bir bulgu5 ile uyumlu olarak, bu, sağlıklı damar duvarlarında hücre alımı yoluyla neointima oluşumunun desteklenmesine bağlanabilir.
Desellülarize veya vital sarmal ve stent anevrizmalarda 21 gün sonra trombüsteki hücre izleyici-pozitif hücrelerin miktarlarında anlamlı bir farklılık olmaması, neointimanın neredeyse tamamen mühürlenmiş olmasından kaynaklanmaktadır23. Bu nedenle stentle bile trombüs içine hücre göçü artık mümkün değildir. Stent implantasyonu yapılırken dikkat edilmesi gereken kritik noktalar arasında stent uygulaması sırasında olası bir iyatrojenik damar rüptürü veya arteriyotomi bölgesinde kritik darlık oluşumu ve alt ekstremitelerde potansiyel iskemi gelişimi sayılabilir. İskemiyi önlemek için, stent implantasyonu ve dikiş arteriyotomisi sonrası iyatrojenik darlığı önleyecek kadar küçük stent yerleştirilmesi için damar bifurkasyonunun yanındaki arteriyotomi bölgesini seçin. Ayrıca, kapatmadan önce, herhangi bir trombojenik bileşenin varlığına bağlı olarak herhangi bir potansiyel embolinin distal taşınmasını en aza indirmek için bu bölgeyi heparinize salin ile yıkayın.
Bu prosedürler için gerekli malzemeler tipik olarak son derece maliyet yoğun ve nadirdir ve bunların mevcudiyeti nöroşirürjideki genç sakinler için çok önemlidir24,25. Bununla birlikte, bu modelden elde edilen bilgi zenginliğine ek olarak, bu ameliyatı uygulamak cerrahi becerilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Sonuç olarak, Helsinki sıçan mikrocerrahi yanak anevrizma modelinde endovasküler olarak tedavi edilen anevrizmaların biyolojik iyileşme yanıtı, komşu damar kompleksinden hücre göçüne bağlıdır. Ek olarak, canlı, sağlıklı bir anevrizma duvarından hücrelerin alınması ile desteklenir. Bununla birlikte, desellülarize ve dolayısıyla yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalarda, ana hücre bakımından zengin arter, bitişik hücre bakımından zengin dokuları anevrizma deliğine bağlayan stentler gibi endovasküler cihazlar tarafından kolaylaştırılan bir neointima oluşumu için en önemli hücre kaynağıdır. Bu bulguyu klinik ortamlara çevirmeye yardımcı olmak için, yüksek oranda dejenere olmuş anevrizmalar, hücre bakımından zengin sağlıklı damar bölgelerine yerleştirilen iskeleler aracılığıyla tedavi edilebilir. Bobin embolizasyonu tek başına çoğunlukla sağlıklı damar duvarlarına sahip anevrizmalar için yeterli olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, sunulan çalışmanın tasarımından ve yürütülmesinden yalnızca kendileri sorumludur ve rakip çıkarlar beyan etmezler.
Acknowledgments
Yazarlar, uzun vadeli hayvan sağlığının özel denetimi için DVM, PhD, Alessandra Bergadano'ya teşekkür eder. Bu çalışma, Araştırma Konseyi, Kantonsspital Aarau, Aarau, İsviçre ve İsviçre ulusal bilim vakfı SNF'nin (310030_182450) araştırma fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
- Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
- Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
- Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638 (2014).
- Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
- Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
- Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
- Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
- Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
- Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
