Summary
Abbiamo eseguito un'iniezione di tracciante cellulare lipofila a un punto per tracciare le cellule endoteliali, seguita da un'arteriotomia e sutura degli aneurismi della parete laterale sull'aorta addominale del ratto. La formazione di Neointima sembrava dipendente dall'arteria madre negli aneurismi decellularizzati ed è stata promossa dal reclutamento da cellule della parete dell'aneurisma in pareti vitali ricche di cellule.
Abstract
Il clipping microchirurgico crea una successiva barriera del flusso sanguigno negli aneurismi intracranici, mentre il trattamento endovascolare si basa sulla formazione di neointima e trombo. La fonte delle cellule endoteliali che coprono lo strato endoluminale del neointima rimane poco chiara. Pertanto, lo scopo del presente studio era quello di studiare l'origine delle cellule che formano neointima dopo l'iniezione di tracciante cellulare nel già consolidato modello di aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki.
Gli aneurismi laterali sono stati creati suturando sacche arteriose decellularizzate o vitali end-to-side all'aorta nei ratti Lewis maschi. Prima dell'arteriotomia con sutura dell'aneurisma, è stata eseguita un'iniezione di tracciante cellulare contenente colorante CM-Dil nell'aorta bloccata per etichettare le cellule endoteliali nel vaso adiacente e tracciare la loro proliferazione durante il follow-up (FU). Trattamento seguito da avvolgimento (n = 16) o stenting (n = 15). Al FU (7 giorni o 21 giorni), tutti i ratti sono stati sottoposti ad angiografia a fluorescenza, seguita da raccolta di aneurisma e valutazione macroscopica e istologica con conta cellulare immunoistologica per specifiche regioni di interesse.
Nessuno dei 31 aneurismi si era rotto al follow-up. Quattro animali sono morti prematuramente. La perfusione macroscopicamente residua è stata osservata nel 75,0% dei ratti a spirale e nel 7,0% dei ratti stentati. La quantità di cellule tracer-positive era significativamente elevata negli aneurismi stentati decellularizzati rispetto agli aneurismi a spirale rispetto al trombo il giorno 7 (p = 0,01) e neointima al giorno 21 (p = 0,04). Non sono state riscontrate differenze significative nel trombo o nella neointima negli aneurismi vitali.
Questi risultati confermano modelli di guarigione peggiori in spirale rispetto agli aneurismi stentati. La formazione di Neointima sembra particolarmente dipendente dall'arteria madre negli aneurismi decellularizzati, mentre è supportata dal reclutamento da cellule della parete dell'aneurisma in pareti vitali ricche di cellule. In termini di traduzione, il trattamento con stent potrebbe essere più appropriato per gli aneurismi altamente degenerati, mentre l'avvolgimento da solo potrebbe essere adeguato per gli aneurismi con pareti dei vasi per lo più sane.
Introduction
L'emorragia subaracnoidea causata dalla rottura di un aneurisma intracranico (IA) è una condizione neurochirurgica devastante associata ad alta morbilità e mortalità 1,2,3,4. Oltre al clipping microchirurgico, che fornisce un contatto diretto tra endotelio ed endotelio, i dispositivi endovascolari hanno acquisito un'importanza crescente negli ultimi decenni per il trattamento delle IA rotte e scoperte incidentalmente. La risposta di guarigione nelle IA trattate endovascolarmente dipende principalmente dalla formazione di neointima e dall'organizzazione del trombo. Entrambi sono processi sinergici, a seconda della migrazione cellulare dal vaso adiacente e dalla parete dell'aneurisma. 5 Ad oggi, l'origine delle cellule endoteliali nella formazione neointima degli aneurismi trattati endovascolari rimane poco chiara. C'è un dibattito in corso in letteratura sulla fonte da cui vengono reclutate le cellule che formano neointima.
Utilizzando un'iniezione cell-tracer di colorante CM-Dil (vedi tabella dei materiali) nell'aorta addominale dei ratti, abbiamo mirato ad analizzare il ruolo delle cellule endoteliali, originarie dell'arteria madre, nella formazione di neointima in due diversi punti temporali FU (giorno 7 e giorno 21) (Figura 1). Un vantaggio del modello è l'incubazione diretta del tracciante cellulare locale in vivo in un'arteria genitore prima della sutura dell'aneurisma, consentendo la FU in punti temporali successivi. Le tecniche di iniezione in vivo , come l'incubazione cell-tracer, non sono state descritte in letteratura. Un vantaggio di questa tecnica è l'iniezione diretta, a un punto, intraoperatoria, in vivo , che rende il modello robusto e riproducibile.
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Protocol
Il supporto veterinario è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico locale, Svizzera (BE 60/19). Le linee guida ARRIVE e i principi 3R sono stati rigorosamente seguiti 6,7. Trentuno ratti Lewis maschi, di 12 settimane di età e del peso di 492 ± 8 g, sono stati inclusi. Ospitare tutti i ratti a una temperatura ambiente di 23 °C e un ciclo luce/buio di 12 ore. Fornire l'accesso gratuito ad acqua e pellet. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il test non parametrico Wilcoxon-Mann-Whitney U. I valori di probabilità (p) di ≤ 0,05 e/o ≤ 0,01 sono stati considerati significativi.
1. Preparazione generale di fase preoperatoria e aspetti anestesiologici
- Randomizzare i ratti in gruppi di trattamento a bobina o stent (Figura 2) tramite un sistema di randomizzazione basato sul web. Ora, esegui un esame clinico preoperatorio di tutti gli animali previsti per l'intervento chirurgico accanto a una sala operatoria silenziosa e asettica mantenendo una temperatura ambiente di 23 ± 3 ° C. Analizzare il comportamento degli animali e ispezionare le mucose e il turgore come parte dell'esame clinico preoperatorio.
- Registra il peso di ogni animale.
- Prima dell'intervento chirurgico, incubare le sacche arteriose da ratti donatori in 0,1% di sodio dodecil solfato per 10 ore a 37 °C per ottenere aneurismi decellularizzati8. Raccogli queste buste dagli animali donatori pochi giorni prima dell'intervento.
- Preparare l'intera lunghezza dell'aorta addominale con microscissori e pinze e applicare 6-0 legature non assorbibili ad un intervallo di 3-4 mm.
- Generare direttamente aneurismi vitali per via intraoperatoria da una sacca del vaso arterioso precedentemente legata dalla parte toracica di un animale donatore9. Eseguire la toracotomia con forbici e pinze chirurgiche nel punto temporale FU indicato e legare la sacca del vaso alla lunghezza desiderata.
- Impiantare direttamente la sacca nel ricevente e raccogliere l'aneurisma dall'animale donatore per ulteriori analisi macroscopiche ed elaborazione istologica.
- Per l'induzione dell'anestesia, mettere tutti i ratti in una scatola pulita fornita di ossigeno (O2) fino alla perdita di coscienza dopo 5-10 minuti. Anestetizzare i ratti con un'iniezione sottocutanea (SC) di una miscela di fentanil 0,005 mg/kg, medetomidina 0,15 mg/kg e midazolam 2 mg/kg.
NOTA: Questo garantisce un piano chirurgico di almeno 45 min. - Controllare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di prelievo del pedale.
- Posizionare i ratti in posizione supina e radere la parte toraco-addominale con un rasoio elettrico.
- Fissare le 4 zampe dei ratti con del nastro adesivo su una tavola, coperta da una piastra riscaldante collegata a una sonda rettale autoregolante. Inserire la sonda rettale nell'ano del ratto per mantenere la temperatura desiderata di 37 °C con l'aiuto della piastra riscaldante.
- Ora, installare un sensore sulla zampa posteriore destra collegato a un sistema computerizzato per il controllo intraoperatorio dei segni vitali.
- Coprire il naso e la bocca del ratto con una maschera per il viso. Se si richiede un'anestesia prolungata, iniziare l'isoflurano (1,0-2,0% titolato per effetto in 100% O2).
- Disinfettare il campo chirurgico con povidone-iodio o disinfettanti alternati e drappeggiare il campo chirurgico in modo sterile.
- Per la cura perianestetica, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e coprirli con una maschera di alluminio opaco per evitare l'essiccazione e il danneggiamento della lampada chirurgica.
- Durante l'intervento chirurgico, fornire ossigeno continuamente attraverso la maschera facciale, monitorare la temperatura corporea e fornire calore utilizzando una piastra riscaldante, mantenendo la normotermia.
- Monitorare continuamente altri segni vitali (distensione del polso e del respiro, frequenza cardiaca e respiratoria e saturazione di ossigeno).
2. Fase operativa - iniezione di cell-tracer
NOTA: L'approccio chirurgico dettagliato nell'aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki modello9 e le tecniche per l'impianto di bobine e stent sono descritti altrove 8,10,11.
- Conservare il tracciante cellulare lipofilo fluorescente a ≤ -20 °C per tutto il tempo, al riparo dalla luce.
- Eseguire l'intervento chirurgico preparando l'aorta del ratto e la vena cavale, seguita dalla separazione di entrambi, nonché dal bloccaggio temporaneo prossimale e distale dell'aorta.
NOTA: Questa tecnica è stata descritta in precedenza9.- Blocca le parti prossimali e distali dell'aorta con due clip titan temporanee.
- Metti una microswab con imbottitura viola ciascuna sotto le parti prossimale e distale dell'aorta per una migliore visualizzazione dell'arteria.
- Ora, proteggi l'addome con una garza bagnata.
- Il giorno dell'operazione, sciogliere 2 μL del tracciante cellulare mediante pipettaggio in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Trasferire la miscela in una siringa da 1 mL dotata di una cannula sterile da 27-1/2 G (0,4 x 13 mm).
NOTA: prestare attenzione a evitare l'esposizione alla luce durante l'esecuzione dei passaggi 2.5 e 2.6. - Spegnere la luce in sala operatoria. Mentre si guarda al microscopio, eseguire l'iniezione di un punto nella parte ventrale centrale dell'aorta utilizzando micro pinze e iniettare con attenzione 1 mL di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.
- Iniettare accuratamente il cell-tracer (Video 1) e spegnere immediatamente anche il microscopio operatorio. Ancora una volta, proteggere l'addome con una garza bagnata.
- Lasciare incubare il colorante per almeno 15 minuti. Dopo il periodo di incubazione, accendere il microscopio e le luci della sala operatoria.
- Eseguire l'arteriotomia longitudinale e la sutura dell'aneurisma, come descritto altrove11.
- Utilizzare microforze e microscissori per eseguire l'arteriotomia in modo che la sua lunghezza sia la media del diametro dell'aneurisma raccolto (fase 1.3). Per garantire la lunghezza corretta, posizionare l'aneurisma accanto all'aorta prima di eseguire l'arteriotomia. Suturare l'aneurisma con 8-10 punti singoli utilizzando una sutura 10-0 non assorbibile e rimuovere con cura i morsetti temporanei - a partire distalmente - sotto irrigazione continua con soluzione salina eparinizzata. Chiudi la ferita in modo stratificato. Da notare, utilizzare una densità di imballaggio della bobina di 1 cm.
NOTA: La tecnica di impianto di bobina o stent è stata descritta altrove 8,10.
- Utilizzare microforze e microscissori per eseguire l'arteriotomia in modo che la sua lunghezza sia la media del diametro dell'aneurisma raccolto (fase 1.3). Per garantire la lunghezza corretta, posizionare l'aneurisma accanto all'aorta prima di eseguire l'arteriotomia. Suturare l'aneurisma con 8-10 punti singoli utilizzando una sutura 10-0 non assorbibile e rimuovere con cura i morsetti temporanei - a partire distalmente - sotto irrigazione continua con soluzione salina eparinizzata. Chiudi la ferita in modo stratificato. Da notare, utilizzare una densità di imballaggio della bobina di 1 cm.
3. Monitoraggio della fase postoperatoria e cura analgetica
- Alla fine dell'intervento chirurgico, invertire l'anestesia con una miscela di iniezione SC di buprenorfina 0,05 mg / kg, atipamezolo 0,75 mg / kg e flumazenil 0,2 mg / kg. Lasciare che ogni animale operato si riprenda in una gabbia pulita fino a quando non è completamente sveglio e riscaldato, se necessario, con una lampada riscaldante.
- Per 3 giorni, somministrare 1 mg/kg di meloxicam (un'iniezione o un'applicazione orale al giorno) e buprenorfina (0,05 mg/kg quattro volte al giorno) SC. Durante la notte, fornire buprenorfina continuamente nell'acqua potabile con lo stesso dosaggio: 6 mL di buprenorfina 0,3 mg/mL, 360 ml di acqua potabile, 10 ml di glucosio al 5%.
- Nell'immediata fase postoperatoria, ospitare ogni animale in una singola gabbia per la protezione. Raggruppare gli animali dopo 24 ore.
- Se un ratto mostra un comportamento angosciato o aggressivo dopo l'iniezione di SC, somministrare buprenorfina nell'acqua potabile durante il giorno.
- Fornire mangime morbido sul pavimento della gabbia per supportare l'alimentazione e il recupero postoperatorio.
- Osserva e prenditi cura di tutti gli animali secondo il foglio di valutazione del benessere e del dolore.
- Somministrare l'analgesia sc di salvataggio (meloxicam 1 mg/kg e 0,05 mg/kg di buprenorfina) quando necessario.
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Representative Results
Un totale di 31 animali sono stati inclusi nel contesto di laboratorio: 27 ratti sono stati inclusi nell'analisi statistica finale; 4 ratti sono morti prematuramente (tasso di mortalità del 12,9%). Per via intraoperatoria, la distensione del respiro è risultata significativamente ridotta (p = 0,03) nei ratti trattati con stent ( 12,9 μm ± 0,7) rispetto ai ratti trattati con bobina (13,5 μm ± 0,6). L'angiografia a fluorescenza è stata eseguita per ogni ratto alla fine del FU finale. La riperfusione è stata indicata in tutti e 6 gli animali trattati con bobine, mentre la riperfusione è stata osservata solo nel 12,5% degli 8 animali trattati con stent.
I volumi di aneurisma al basale aggregati per il giorno 7 e il giorno 21 non differivano in modo significativo (né per gli aneurismi decellularizzati (p = 0,9) né vitali (p = 0,1)) tra i gruppi di trattamento con bobina o stent (Figura 3). I volumi di FU aggregati per gli aneurismi decellularizzati hanno mostrato una crescita non significativa dell'aneurisma in spirale rispetto agli aneurismi stentati (p = 0,28), significativamente maggiore nel gruppo vitale arrotolato rispetto al gruppo stented (60,1 mm3 ± 31,1 mm3 vs 20,5 mm3 ± 20,6 mm3; p = 0,002).
Le quantità di cellule tracer-positive nella neointima degli aneurismi decellularizzati non differivano significativamente tra i gruppi trattati con stent o bobina al giorno 7 FU (p = 0,8), ma erano significativamente più alte nei ratti stentati al giorno 21 FU (Figura 4; p = 0,04). Nei ratti vitali suturati con aneurisma, non sono state osservate differenze significative a 7 giorni (p = 1,0) o 21 giorni (Figura 5) FU (p = 0,66). Negli aneurismi decellularizzati a 7 giorni FU, significativamente più cellule cell-tracer-positive sono rimaste nel trombo dello stent trattato rispetto al gruppo trattato con bobina (p = 0,01). Questa differenza non è stata osservata negli aneurismi vitali a 7 giorni fu. Vedere la Tabella 1 per la proporzione di cellule tracer-positive per aneurismi decellularizzati, così come aneurismi vitali a spirale e stentati per il giorno 7 e il giorno 21 FU. La controcolorazione per il fattore di von Willebrand (F8) è stata eseguita nelle cellule endoteliali del neointima di ciascun ratto (Figura 6).
La durata media della procedura chirurgica è stata di 119,1 ± 21,3 minuti per il gruppo di avvolgimento rispetto a 154,1 ± 30,2 minuti per il gruppo stent (p = 0,001). Anche il numero di punti per le suture di aneurisma differiva in modo significativo (p = 0,000002) per la bobina (15,6 ± 2,9 punti) e i gruppi di stent (11,3 ± 1,1).
Figura 1: Diagramma di flusso dell'impostazione sperimentale. Un totale di 35 animali sono stati operati e randomizzati a gruppi di avvolgimento o stenting. Due animali del gruppo stent sono morti nell'immediato decorso postoperatorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotografie intraoperatorie di aneurismi durante l'embolizzazione di bobine e stent. (A) raffigura un aneurisma della parete laterale (#), suturato sull'aorta addominale del ratto (*). Si noti il dispositivo a bobina introdotto nell'aneurisma prima di eseguire l'ultimo singolo punto per completare la sutura dell'aneurisma. Si noti la colorazione rosata (freccia) sul lato sinistro dell'arteriotomia, che indica la corretta distribuzione del tracciante cellulare. (B) La stessa impostazione di cui al punto A, che mostra il dispositivo dello stent già in situ. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazioni macroscopiche post mortem in 31 animali. I volumi di aneurisma (mm3) sono stati documentati prima dell'impianto e al follow-up, rappresentati lungo l'asse y. (A) Basale (decellularizzato), (B) follow-up (decellularizzato), (C) basale (vitale), (D) follow-up (vitale). I dati per il giorno 7 e il giorno 21 vengono raggruppati. ** p < 0,01. I valori sono espressi come mediane con intervalli interquartili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine esemplare di un aneurisma decellularizzato trattato con stent al giorno 21. A destra, viene mostrata la panoramica dell'immagine di un antiα-SMA monoclonale, aneurisma cellulare impoverito (ingrandimento 2 volte); barra della scala = 150 μm. A sinistra, controcolorato con DAPI; i globuli rossi sono cellule-traccianti-positivi (A) nella parete dell'aneurisma, (B) nel trombo, (C) cellule residue colorate ma sbiadite cell-tracer-positive nel neointima e (D) nel complesso vaso adiacente. Barre di scala = 100 μm (A-D). Una singola freccia segna la parete dell'aneurisma, la doppia freccia l'arteria madre. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; α-SMA = actina della muscolatura α liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagine esemplare di un aneurisma vitale trattato con bobina al giorno 21. Lato destro, viene mostrata la panoramica dell'immagine di un antiα-SMA monoclonale, aneurisma ricco di cellule (ingrandimento 2 volte); barra della scala = 150 μm. Lato sinistro, controinfangato con DAPI; i globuli rossi sono cell-tracer-positivi (A) nella parete dell'aneurisma, (B) nel trombo, (C) più cellule positive nel neointima e (D) nel complesso vaso adiacente. Barre di scala = 100 μm (A-D). Una singola freccia segna la parete dell'aneurisma, la doppia freccia l'arteria madre. Abbreviazioni: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; α-SMA = actina della muscolatura α liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: ingrandimento di 40 volte dalla colorazione F8. # raffigura la formazione del trombo, * il neointima e § il lato endoluminale sotto l'orifizio dell'aneurisma. Si noti la stratificazione endoteliale mostrata come colorazione viola nello strato endoluminale del neointima. Barra della scala = 175 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Colorante DAPI/CM-Dil (%) | Bobina | Stent | |||
| Giorno 7 | Giorno 21 | Giorno 7 | Giorno 21 | ||
| Sacchetti decellularizzati | Neointima | 68.00% | 7.70% | 72.20% | 34.30% |
| Arteria genitore | 75.50% | 10.50% | 76.50% | 35.60% | |
| Trombo | 7.50% | 5.50% | 25.20% | 8.30% | |
| Parete dell'aneurisma | 12.20% | 8.50% | 11.70% | 9% | |
| Sacchetti vitali | Neointima | 56.70% | 11.50% | 58.20% | 15.00% |
| Arteria genitore | 60.00% | 24.20% | 81.50% | 26.00% | |
| Trombo | 62.00% | 26.20% | 71.20% | 23.70% | |
| Parete dell'aneurisma | 13.20% | 10.20% | 13.50% | 11.60% |
Tabella 1: Percentuale di cellule positive al tracciante cellulare nella parete neointima, arteria genitore, trombo e aneurisma. I valori sono rappresentati come percentuali per sacchetti decellularizzati e vitali per il trattamento di bobine e stent per il giorno 7 e il giorno 21. Abbreviazione: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo.
Video 1: Iniezione di cell-tracer nella parte addominale dell'aorta di ratto. Questa tecnica viene eseguita utilizzando un'iniezione di un punto nell'aorta di ratto bloccata. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo studio dimostra che la formazione di neointima è mediata da cellule endoteliali originarie dell'arteria madre del complesso dell'aneurisma, ma è supportata dal reclutamento di cellule derivate dalla parete dell'aneurisma negli aneurismi vitali. Tuttavia, il ruolo delle cellule progenitrici circolanti nella guarigione dell'aneurisma rimane controverso12,13. Complessivamente, 31 ratti Lewis maschi sono stati inclusi in questa indagine; solo 4 morirono prematuramente (12,9% di mortalità).
A differenza del clipping chirurgico, che promuove il successivo contatto endotelio-endotelio, il successo del trattamento endovascolare si basa su risposte biologiche ritardate. Le tecniche di recente sviluppo, come la deviazione del flusso, i dispositivi endovascolari bioattivi o le terapie cellulari intraluminali, sono degne di nota rispetto ai dispositivi di trattamento endovascolare14,15. In questo contesto, le prove dimostrano che il successo del trattamento nell'eradicazione dell'aneurisma di successo è additivamente associato alla risposta biologica dalla parete dell'aneurisma stessa 5,16,17.
Studi recenti hanno suggerito che l'organizzazione del trombo e la formazione di neointima sono processi concomitanti nella guarigione dell'aneurisma dopo terapie endovascolari. Entrambi i processi coinvolti nella guarigione dell'aneurisma si basano sullo spostamento delle cellule dal vaso adiacente del complesso dell'aneurisma e dalla parete dell'aneurisma stesso. Inoltre, entrambi i processi sono facilitati dalla presenza di dispositivi endovascolari come bobine o stent. Come hanno dimostrato Grüter et al.,5 cellule che organizzano i trombi derivano principalmente dal vaso adiacente per entrambi i tipi di approcci di trattamento endovascolare. Qui, la formazione di neointima negli aneurismi trattati con bobina si basa principalmente sulla migrazione cellulare dalla parete del vaso, mentre il vaso adiacente fungeva da donatore primario negli aneurismi trattati con stent.
Un filo conduttore nello stabilire ed espandere le domande di ricerca utilizzando il modello di aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki potrebbe essere osservato nel corso degli anni. In primo luogo, gli aneurismi decellularizzati e, quindi, degenerati sono più inclini alla crescita e alla rottura rispetto agli aneurismi vitali ricchi di cellule9. Inoltre, il trattamento con bobina ha mostrato più successo nel trattamento dell'aneurisma con sacchetti vitali rispetto a quelli altamente degenerati8. Inoltre, il trapianto di cellule ha fornito una sufficiente guarigione dell'aneurisma anche in aneurismi altamente degenerati14. Confrontando diversi dispositivi endovascolari in questo modello di aneurisma, il trattamento con stent era chiaramente superiore al solo trattamento con bobina11. Pertanto, apprezzando le diverse modalità di reclutamento cellulare negli aneurismi arrotolati e stentati dall'arteria madre e dalla parete dell'aneurisma5, le principali domande rimangono se la formazione di neointima sia principalmente innescata da cellule endoteliali dall'arteria madre, cellule dalla parete dell'aneurisma o persino cellule progenitrici circolanti. Recenti scoperte sulle cellule progenitrici circolanti che innescano la formazione di neointima sono controverse 12,13,15,18.
Solo i ratti maschi sono stati inclusi in questa serie per evitare gli effetti confondenti degli estrogeni sulla crescita dell'aneurisma, sulla formazione di trombi e sull'infiammazione della parete, come riportato in precedenza19. Oltre al sofisticato monitoraggio multimodale con angiografia a fluorescenza20 e monitoraggio dei segni vitali, abbiamo utilizzato uno specifico tracciante cellulare per etichettare l'arteria madre per differenziare le cellule derivate dalle cellule circolanti nel flusso sanguigno da quelle derivate dalla vera migrazione delle cellule vicine. Tuttavia, non possiamo escludere un leggero sbiadimento dell'intensità del segnale delle cellule endoteliali con tempo e divisione cellulare, sebbene gli studi abbiano dimostrato una forte intensità del segnale dei miofibroblasti in questi punti temporali (giorno 7 e giorno 21)14. Infine, questo modello di aneurisma ha utilizzato l'emodinamica e i successivi processi biologici, come il tasso di trombosi spontanea o la guarigione dell'aneurisma, che sono fortemente influenzati dalla costellazione della parete laterale dell'aneurisma21.
Come dimostrato in questi risultati, rimane ovvio che il vaso adiacente del complesso dell'aneurisma funge da importante fonte di cellule nella formazione di un neointima. Questi risultati sono fortemente in linea con i risultati recentemente pubblicati da Kallmes et al., che mostrano che lo spessore del montante è anche un determinante dell'apposizione della parete nei deviatori di flusso, che è un importante motore di un'efficace endotelizzazione. Qui, l'aumento dello spessore del montante riduce la probabilità di malapposition, migliora il contatto con la parete dell'arteria madre e, quindi, ottimizza la ricostruzione cellulare tramite i montanti22. Nei ratti con aneurismi decellularizzati, una quantità significativamente più elevata di cellule endoteliali cell-tracer-positive è stata osservata nel gruppo stented al giorno 21 rispetto al gruppo arrotolato allo stesso punto temporale (Tabella 1).
Questa scoperta potrebbe essere attribuita al fatto che gli stent, applicati in una regione ricca di cellule dell'arteria madre anche in aneurismi altamente degenerati, fungono da strutture guida per i movimenti cellulari, consentendo un rivestimento endoteliale continuo dello strato endoluminale del neointima e fornendo una progressiva guarigione dell'aneurisma. Additivamente, confrontando lo stenting e l'avvolgimento il giorno 7 FU, è stata osservata una quantità significativamente più elevata di cellule tracer-positive nel trombo degli animali stented rispetto a quelli arrotolati. Pertanto, una spiegazione ragionevole è che i montanti dello stent facilitano prontamente la migrazione cellulare dalla nave adiacente nel trombo. Negli aneurismi vitali che confrontano l'avvolgimento con lo stenting, né per neointima dopo 21 giorni, né per la formazione di trombi il giorno 7, sono state osservate differenze significative nelle cellule positive al tracciante cellulare. In linea con un precedente risultato5, questo può essere attribuito al supporto per la formazione di neointima attraverso il reclutamento cellulare in pareti di vasi sani.
L'assenza di differenze significative nella quantità di cellule tracer-positive nel trombo dopo 21 giorni negli aneurismi decellularizzati o vitali arrotolati e stentati è dovuta al fatto che il neointima era quasi completamente sigillato23. Pertanto, anche tramite stent, la migrazione cellulare nel trombo non è più possibile. I punti critici da considerare durante l'esecuzione dell'impianto dello stent includono una possibile rottura iatrogena del vaso durante l'applicazione dello stent o la formazione di stenosi critica nella regione dell'arteriotomia, con potenziale sviluppo di ischemia negli arti inferiori. Per prevenire l'ischemia, scegliere il sito di arteriotomia accanto alla biforcazione del vaso per l'inserimento dello stent abbastanza piccolo da evitare la stenosi iatrogena dopo l'impianto dello stent e l'arteriotomia di sutura. Inoltre, prima della chiusura, lavare questa regione con soluzione salina eparinizzata per ridurre al minimo il trasporto distale di eventuali potenziali emboli dovuti alla presenza di qualsiasi componente trombogenico.
I materiali necessari per queste procedure sono in genere estremamente costosi e rari, e la loro disponibilità è fondamentale per i giovani residenti in neurochirurgia24,25. Tuttavia, oltre alla ricchezza di informazioni ottenute da questo modello, praticare questo intervento chirurgico contribuirà a migliorare le capacità chirurgiche.
Per concludere, la risposta di guarigione biologica degli aneurismi trattati endovascolarmente nel modello di aneurisma microchirurgico della parete laterale del ratto di Helsinki dipende dalla migrazione cellulare dal complesso vaso adiacente. È inoltre supportato dal reclutamento di cellule da una parete di aneurisma vitale e sana. Tuttavia, negli aneurismi decellularizzati e, quindi, altamente degenerati, l'arteria ricca di cellule madri è la fonte più importante di cellule per la formazione di un neointima, che è facilitato da dispositivi endovascolari, come gli stent, che collegano i tessuti ricchi di cellule adiacenti all'orifizio dell'aneurisma. Per aiutare a tradurre questa scoperta in contesti clinici, gli aneurismi altamente degenerati potrebbero essere trattati tramite impalcature collocate in regioni di vasi sani ricchi di cellule. L'embolizzazione della bobina da sola potrebbe essere sufficiente per gli aneurismi con pareti dei vasi per lo più sane.
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Disclosures
Gli autori sono gli unici responsabili della progettazione e della conduzione dello studio presentato e non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Alessandra Bergadano, DVM, PhD, per la supervisione dedicata alla salute animale a lungo termine. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di ricerca del Consiglio della ricerca, Kantonsspital Aarau, Aarau, Svizzera, e dal Fondo nazionale svizzero per la scienza FNS (310030_182450).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP428G | |
| 4-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G0762563 | |
| 6-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non-absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Atipamezol | Arovet AG, Switzerland | ||
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bicycle spotlight | any other | ||
| Board (20 x 10 cm) | any other | ||
| Buprenorphine | Indivior, Switzerland | 1014197 | |
| Camera | Sony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan | ||
| Cannula (27-1/2 G) | any other | ||
| Cell count software | Image-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| CellTracker CM-Dil dye | ThermoFisher SCIENTIFIC, USA | C7000 | |
| Coil-Device | Styker, Kalamazoo, MI, USA | 2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter | |
| Desinfection | any other | ||
| Eye-lubricant | any other | ||
| Fentanyl | Sintetica, S.A., Switzerland | 98683 | any generic |
| Flumazenil | Labatec-Pharma, Switerzland | ||
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | any generic |
| Fluorescence microscope | Olympus BX51, Hamburg, Germany; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8 | ||
| Foil mask | any other | ||
| Glucose (5%) | any other | ||
| Heating pad | Homeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, England | any other | |
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | any generic |
| Isoflurane | any generic | ||
| Longuettes | any other | ||
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | any generic |
| Medetomidine | Virbac, Switzerland | QN05CM91 | |
| Micro needle holder | any other | ||
| Midazolam | Roche, Switzerland | ||
| Monitoring-system | Starr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, United States | ||
| Needle holder | any other | ||
| O2-Face mask | any other | ||
| Operation microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | any other | |
| Oxygen | any other | ||
| Rectal temperature probe | any other | ||
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | any other |
| Small animal shaver | any other | ||
| Smartphone | any other | ||
| Sodium dodecyl sulfate (0.1%) | Sigma-Aldrich | 11667289001 | |
| Soft feed | Emeraid Omnivore | any generic | |
| Soft tissue forceps | any other | ||
| Soft tissue spreader | any other | ||
| Stainless steel sponge bowls | any other | ||
| Stent-Device | Biotroni, Bülach, Switzerland | modified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter | |
| Sterile micro swabs | any other | ||
| Straight and curved microforceps | any other | ||
| Straight and curved microscissors | any other | ||
| Straight and curved forceps | any other | ||
| Surgery drape | any other | ||
| Surgical scissors | any other | ||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | any other | ||
| Tape | any other | ||
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T | temporary |
References
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